Etude du lipidome par spectrométrie de masse Mario Ollero INSERM U845. Faculté Necker
Schéma Importance des lipides en biologie expérimentale - Lipidomique Diversité moléculaire - Méthodologie Les techniques protéomiques pour l analyse des lipides (MS) Exemples de lipidomique en biologie expérimentale Sites et outils pour la lipidomique
Systèmes biologiques: -omics cascade GENOME: 25,000 gènes GENOTYPE TRANSCRIPTOME: 100,000 transcrits PROTEOME: 1,000,000 protéines METABOLOME: 7,500 métabolites (plantes 50,000) LIPIDOME: 7,000 métabolites lipidiques (LipidBank) (molécules hydrophobes solubles dans solvants organiques) PHENOTYPE
Pourquoi la lipidomique? Les lipides sont importants parce que Nombreux processus moléculaires contrôlés par des protéines associées aux membranes Impliqués dans beaucoup de voies métaboliques et de régulation de l activité des protéines Impliqués dans la plupart des maladies de la population occidentale Mesurables à partir de fluides biologiques Le profilage des lipides est le plus développé parmi les profilages ciblés en métabolomique Avantages par rapport au profilage génomique et protéomique Petits changements dans les réseaux métaboliques grands changements de concentration des métabolites Plus proche du phénotype Mesure quantitative Mesure semi-comprehensive Petit nombre par rapport aux gènes ou protéines Techniques déjà développées Les voies métaboliques et leur régulation sont très connues
Lipidomique: définition Michel Eugène CHEVREUL (1786-1889) Le décodage systématique de l information liée aux lipides dans les systèmes biologiques (Serhan, 2005) Détermination quantitative spatio-temporelle des lipides identification et profilage des lipides membranaires (lipidomique membranaire) identification et profilage des molécules dérivées des lipides membranaires (lipidomique de médiateurs) Etude des enzymes du métabolisme lipidique, des transporteurs de lipides, leurs gènes et leur régulation Etude de la fonction lipidique: interactions lipide-lipide et lipide-protéine Van Meer, 2007
Schéma Importance des lipides en biologie expérimentale - Lipidomique Diversité moléculaire - Méthodologie Les techniques protéomiques pour l analyse des lipides (MS) Exemples de lipidomique en biologie expérimentale Sites et outils pour la lipidomique
Définition et Classification classiques (Hilditch, 1947) LIPIDE: toute molécule soluble dans les solvants organiques SIMPLES ou NEUTRES: contiennent un ou deux types de composés différents (i.e. un stérol et/ou un acide gras, glycérol et acide(s) gras, alcool et/ou acide gras, acide gras et acide aminé...) et présentent des propriétés apolaires COMPLEXES: trois ou plus identités chimiques (i.e. glycérol + acides gras + sucre; une base de chaîne longue + acide gras + groupe phosphate...) et des propriétés polaires PROTEOLIPIDES: protéines extraites par des solvants organiques. Contiennent un composant lipidique (protéines acylées)
Le drame de la lipidomique Complexité et dynamique énormes Outils toujours en cours de développement Abondance différentielle Influencé par le régime alimentaire
Le drame de la lipidomique Complexité et dynamique énormes Outils toujours en cours de développement Abondance différentielle Influencé par le régime alimentaire Initiative Lipid MAPS (Lipid Metabolites and Pathways Strategy), 2005 Glue Grant (Institute of General Medical Sciences): 12 laboratoires Standardisation de protocoles Méthodes «haut débit» Standardisation de données export Analyse de données automatisée Intégration des bases de données avec les autres «-omiques» Classification et ontologie universelles
Définition et Classification officielles (Lipid MAPS + ILCNC) ILCNC: International Lipids Classification and Nomenclature Committee Petites molécules (200-1500 Da) hydrophobes ou amphipathiques qui sont formées entièrement ou partiellement de condensations carbanioniques de thioesters. Et/ou par condensation carbocationique d unités d isoprène (et normalement solubles en solvants organiques). Fahy, 2005
Classification actuelle (Lipid MAPS + ILCNC) ILCNC: International Lipids Classification and Nomenclature Committee Petites molécules (200-1500 Da) hydrophobes ou amphipathiques qui sont formées entièrement ou partiellement de condensations carbanioniques de thioesters. Et/ou par condensation carbocationique d unités d isoprène (et normalement solubles en solvants organiques). 8 catégories: -Acides gras -Glycerolipides -Glycerophospholipides -Sphingolipides -Stérolipides -Prenolipides -Saccharolipides -polyketides Fahy, 2005
LIPID ID Exemple: LMFA03027312 eicosanoide leucotriène 1,68 millions de combinaisons possibles par «subclass» Fahy, 2005
Méthodologie Wolf 2007
Overview Importance des lipides en biologie expérimentale - Lipidomique Diversité moléculaire - Méthodologie Les techniques protéomiques pour l analyse des lipides (MS) Exemples de lipidomique en biologie expérimentale Outils pour la lipidomique
Méthodologie: lipidomique classique TLC FFA HPLC CL CL PE PE PC PI PC P S SM GC-FID GC-MS
Analyse lipidomique par MS Ionisation traditionnelle: electron impact (EI-MS: GC/MS) field desorption plasma desorption chemical ionization fast atom bombardment Soft ionization: electrospray (ESI) MALDI APCI APPI
Analyse lipidomique par MS: EI-MS (profilage d acides gras) 1. Dérivation 2. GC (séparation+quantification) 3. EI-MS (identification) ion McLafferty ion oméga 18:3n-6
Analyse lipidomique par MS: MALDI vs ESI MALDI Avantages Analyse directe des molécules originales application directe de l extrait organique cocristalisation: matrice et lipides, même solubilité compatibilité avec solvants organiques H+, Na+, K+ «adducts» détectés simultanément Inconvénients contamination Triton contamination plastique contamination matrice hétérogénéité dépôt superposition de spectres ESI Avantages Analyse directe des molécules originales Normalement couplé à chromatographie liquide (interface liquide-gas) Li+ et Na+ «adducts» Inconvénients Incompatibilité certains solvants
Analyse lipidomique par MS: MALDI
Analyse lipidomique par MS: ionisation et fragmentation des GPL Adducts: H+: M+1 Na+: M+23 K+: M+39 PC 16:0/22:6 (38:6) PC 16:0/22:6 (38:6) PC 18:0/20:4 (38:4) PC 16:0/16:0 (32:0)
Analyse lipidomique par MS: fragmentation des phospholipides 184 m/z phosphocholine (PC, SM) 141 m/z phosphoethanolamine 153 m/z PG, PS, PI 185 m/z phosphoserine 260 m/z posphoinositol
Analyse lipidomique par MS: fragmentation des acides gras (MS/MS) 18:0 18:1n-9 18:2n-6 22:6n-3
Analyse lipidomique par MS: dérivation (MS/MS) PGE2-aminobenzènesulfonate PGE2
Analyse lipidomique par MS: couplage avec chromatographie (TLC-MALDI) Fuchs et al, 2007
Analyse lipidomique par MS: couplage avec chromatographie (TLC-MALDI) TLC-MALDI: Chromatogrphy screening + mass spectrometry inflammation control FlexImaging
Analyse lipidomique par MS: identification Analyse individualisée de spectres (patrons de fragmentation) Moteurs de recherche Lipid MAPS Lipid BANK Lipid SEARCH
Analyse lipidomique par MS: identification (Lipid MAPS)
Analyse lipidomique par MS: identification (Lipid MAPS)
Analyse lipidomique par MS: identification (Lipid MAPS)
Analyse lipidomique par MS: identification (Lipid MAPS)
Analyse lipidomique par MS: identification (Lipid MAPS)
Analyse lipidomique par MS: identification (Lipid BANK)
Analyse lipidomique par MS: identification (Lipid BANK)
Analyse lipidomique par MS: identification
Analyse lipidomique par MS: identification
Analyse lipidomique par MS: principaux problèmes 1 lipide 1 signal 1 PM 1 molécule enantiomères stereo-isomères support informatique limité abondance superposition de spectres (spécificité) quantification
Overview Importance des lipides en biologie expérimentale - Lipidomique Diversité moléculaire - Méthodologie Les techniques protéomiques pour l analyse des lipides (MS) Exemples de lipidomique en biologie expérimentale Sites et outils pour la lipidomique
Application: déséquilibre en acides gras (GC-EI-MS) dans la MV Pancréas Poumon DHA AA DHA AA STD WT CF WT CF Freedman et al, PNAS, 1999 18 16 14 AA/DHA 12 10 8 6 4 2 GC-MS (EI) 0 CF HT Control Asthma URI IBD Freedman et al, NEJM, 2004
Application: recherche de marqueurs de la mucoviscidose (MALDI-ClinProTools ) CF patients Healthy siblings Obligate heterozygotes Intens. [a.] 4 3 Plasma/serum EtOH/MetOH SPE C-18 2 1 0 Extraction/purification MALDI-TOF MS spectra acquisition ClinProTools Spectra analysis LC-ESI-MS/MS Upregulated in CF patients: Derivatives of fatty acids (inflammatory mediators) Candidate identification 747.7 Downregulated in CF patients: Phosphatidylcholine (precursor of inflammatory mediators) 623.3 600 700 800 807.0
Application: recherche de marqueurs de la mucoviscidose (MALDI-ClinProTools ) phosphocholine mild severe migration mild severe m/z
Application: identification de médiateurs (LC-ESI-MS/MS) m/z: 343 17R-HDHA +TNF +ASA +DHA SC 7S17R-diHDHA m/z 359 4,11,17R-triHDHA m/z 375 Serhan et al, 2002
Application: identification de médiateurs Serhan et al, 2002
Application: identification de médiateurs (resolvines) Serhan et al, 2002
Application: couplage transcriptomique - lipidomique Toxicité des Statines : myopathie 37 patients: non-traités, atorvastatine, simvastatine biopsie musculaire: microarray ARN Gene Set Enrichment Analysis plasma: lipidomique (UPLC-ESI-MS) Laaksonen et al, 2006
Application: couplage transcriptomique - lipidomique Gene Set Enrichment Analysis Laaksonen et al, 2006
Application: couplage transcriptomique - lipidomique Partial Squares Discriminant Analysis lipides Laaksonen et al, 2006
Application: couplage transcriptomique - lipidomique Combinaion transcriptomique-lipidomique 4 voies: PLC, Sodd, Eicosanoid, Tubby Laaksonen et al, 2006
Application: couplage transcriptomique - lipidomique Régression lipides/expression ALOX5AP Marqueurs des voies altérées par les statines Modulation des traitements Laaksonen et al, 2006
Application: imagerie lipidomique (TOF-SIMS) Spectrometrie de Masse d ions secondaires Bi 3 + source d ions primaires: Bi, Au émission d ions secondaires enregistrement de SM <1500Da construction d image: pixellisation: 1µm 2 intensité relative carte de densité ionique
Application: imagerie lipidomique (TOF-SIMS) 29 26 95 C16:0 255.2 In ten sité R elat ive fragment de PI 241.0 fragm ent de PI 259.0 C18:0 28 3.2 C18:1 281.2 C18:2 279.2 220 225 230 235 240 245 250 255 260 265 270 275 280 285 290
Application: imagerie lipidomique (TOF-SIMS) PIP2 PIP3 vitamine E cholesterol cholesteryl- -sulfate WT CFTR -/- (modéré) CFTR -/- (sévère)
Autres outils lipidomiques: microarrays lipidiques control patient Kanter et al, 2006
Autres outils lipidomiques: lipid-protein overlay assay Dowler 2002
Autres outils lipidomiques: lipid-protein photocrosslinking 1. Photoactivatable lipid analogs 2. Incorporation into membranes 3. UV radiation (photoactivation) 4. Carbonate wash 5. SDS-PAGE 6. Alkyne-conjugated tag (biotin or rhodamine) 7. LC-MS/MS LC-MS/MS 47 PC-interacting proteins Gubbens et al, Chem Biol 2009
Autres outils lipidomiques: TaqMan low density array Applied Biosystems 7900HT Micro Fluidic Card Langmann 2006
Overview Importance des lipides en biologie expérimentale - Lipidomique Diversité moléculaire - Méthodologie Les techniques protéomiques pour l analyse des lipides (MS) Exemples de lipidomique en biologie expérimentale Sites et outils pour la lipidomique
Sites et outils d intérêt LIPID MAPS (Lipid Metabolites and Pathways Strategy): http://www.lipidmaps.org LMSD (structure database) LMPD (proteome database): Human:1202 proteins, 1079 genes; Mouse;1224 proteins, 1083 genes Lipid Library: http://lipidlibrary.co.uk Lipid Bank: http://lipidbank.jp Lipid Data Bank: http://www.caffreylabs.ul.ie LIPIDAT: http://www.lipidat.chemistry.ohiostate.edu LIPIDAG (lipid miscibility) LMSD (molecular structures) Lipid Inspector http://www.scionics.de/lipidinspector Cyberlipid: http://www.cyberlipid.org The Human Metabolome Database: http://www.hmdb.ca/ Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG): http://www.genome.jp/kegg European Lipidomics Initiative: http://www.lipidomics-expertise.de (Lipidomics Net) Groupe d Etude et de Recherche en Lipidomique http://www.gerli.com