BCM - 1521 Travaux Pratiques Isolement des protéines Reference: Protein Purification Principles and Practice. Third Edition. Scopes, RK. Springer-Verlag New York 1994 pp. 71-87. A. Méthodes de solubilisation - La première étape dans la purification des protéines ou de n importe quelle macromolécule biologique est sa dissolution dans une phase liquide - sauf pour les protéines sanguines qui sont déjà solubles, les protéines en générale doivent être libérées à partir des cellules où elles se trouvent. - si la protéine d intérêt est située dans le cytosol de la cellule, sa libération ne demande que la lyse de la cellule en question - dans la méthode la plus douce et la plus simple, appelée lyse osmotique, les cellules sont suspendues dans une solution hypotonique - solution dans laquelle la concentration molaire des solutés en solution est inférieure à leur concentration physiologique à l intérieur de la cellule - cette différence en concentration résulte en l établissement des forces osmotiques qui provoquent un gonflement et ensuite la rupture de la cellule en question - cette méthode est particulièrement efficace avec des cellules animales mais elle est peu efficace avec des cellules bactériennes ou végétales - l utilisation de l enzyme lysozyme qui dégrade les parois bactériennes est parfois efficace, seul ou dans une solution hypotonique - la plupart des cellules exigent une sorte de désintégration mécanique afin de briser la membrane cellulaire et permettre l accès à leur intérieur BCM 1521 Solubilité d une protéine page 1/11
- des techniques routines sont : 1. broyages avec sable ou alumine ; 2. déchiquetage mécanique («blender» de type Waring) ; 3. homogénéisateur (Téflon) ; 4. rupture par haute pression ; 5. sonication par vibration ultrasonique - une fois les cellules sont brisées, le lysat cru peut être filtré ou centrifugé afin d enlever les particules ou débris cellulaires et laissant la protéine d intérêt dans le surnageant de la solution - parfois si la protéine d intérêt est présente dans une organelle, par exemple, la centrifugation différentielle permet d enrichir cette composante cellulaire. La vitesse et la durée de centrifugation sont choisies pour que les autres composants soient sédimentés dans le culot, enrichissant ainsi le surnageant avec la protéine en question. Figure montrant l isolement des organites cellulaires BCM 1521 Solubilité d une protéine page 2/11
- les organites sont identifiés par les activités catalytiques à partir des enzymes spécifiquement associés avec ces organites Figure montrant les marqueurs moléculaires des organites B. Séparation par précipitation. - la distribution des résidus d acides aminés de types hydrophobiques à la surface des molécules protéiques est autant importants dans le comportement des protéines que les résidus de type polaires ou chargés. 1. Rappel des acides aminés protéinogènes 2. Représentation chimique de la protéine aldolase 3. Représentation en structure secondaire de la protéine aldolase 4. Représentation de surface de la protéine aldolase 5. Représentation simplifiée de n importe quelle protéine Modification de la solubilité - le solvant utilisé dans l isolement des protéines est toujours aqueux mais ses propriétés peuvent être modifiées pour que la solubilité d une protéine soit changée BCM 1521 Solubilité d une protéine page 3/11
- variations typiquement utilisées sont : force ionique, ph, solvants organiques, polymères inertes, température ou une combinaison de ceci - le protocole le plus souvent utilisé est l utilisation des sels neutres afin de provoquer la précipitation sélective B.1 Solubilité des protéines à faible concentration de sel. - la plupart des protéines existent sous forme soluble dans la cellule, en concentration qui peut représenter jusqu à 40% en quantité de protéine. - ils sont très solubles en conditions physiologiques de sel - ça veut dire ph presque neutre et force ionique de 0.15-0.20M ; - définition de la force ionique I est I = 1 2 c où c i représente la concentration de chaque espèce ionique i et qui possède une charge électrique Z i - la notion de force ionique est plutôt utilisée en purification que la concentration de sel Exemple : force ionique de 0.15M NaCl = ½ (0.15 (+1) 2 +0.15 (-1) 2 ) = 0.15M - la précipitation d une protéine exige une modification des conditions physiologiques et dépend d une certaine taille en agrégats de protéine i Z 2 i Protéine Suspension en protéine Comment? Qu est-ce qui doit se passer? Culot en protéine - les forces dues au mouvement thermique Brownien exercent une force sur chaque agrégat les gardant en solution BCM 1521 Solubilité d une protéine page 4/11
- à partir d une certaine taille, ces forces ne sont pas suffisantes pour contrecarrer la force gravitationnelle donc la précipitation en résulte - la solubilité de la protéine provient : 1. des interactions dites polaires avec le solvant aqueux, 2. interactions ioniques avec les sels, 3. et d une certaine façon, des forces électrostatique répulsive entre des molécules ou des agrégats de charge similaire - ces types d interactions empêchent l agrégation et donc la précipitation. - formation des petits agrégats peuvent annuler des charges complémentaires (attractives) et empêchent aussi l agrégation menant à la précipitation - les interactions électrostatiques interviennent aux très courtes distances par rapport à la taille de la protéine et dépendent de la forme de la protéine - dans la gamme de force ionique, zéro à physiologique, certaines protéines forment des précipités parce que les forces répulsives sont insuffisantes - une charge globale nette près de zéro d une protéine minimise la répulsion électrostatique et près du point isoélectrique permettrait les forces électrostatiques locales à prédominer menant ainsi à une attirance entre les molécules qui donne lieu à l agrégation et par ensuite la sédimentation - ce phénomène est décrit sous le nom de précipitation isoélectrique (figure 1); la plupart des protéines possèdent un minimum dans leur solubilité autour de leur point isoélectrique ; dans le cas des globulines sanguines leur solubilité est suffisamment basse pour qu elles précipitent. - dans un mélange des protéines, ces situations sont fortement compliquées par des interactions hétérogènes; des protéines qui possèdent des points isoélectriques différents s agrègent afin des former un précipité isoélectrique. - dans beaucoup de cas, les précipités isoélectriques se forment simplement en descendant le ph dans l extrait cellulaire entre 5.0 et 6.0 BCM 1521 Solubilité d une protéine page 5/11
- ceci contient non seulement les protéines solubles mais également des ribosomes et des fragments membraneux - la solubilité des protéines de type globulaire décroît avec la diminution de la concentration de sel. Cependant ce fait est difficile à exploiter dans un extrait cellulaire puisque la réduction, par exemple, d un facteur deux en [sel] par une dilution d un facteur deux ne décroît pas nécessairement la solubilité par un facteur deux. - cette propriété peut être utile plus tard pendant la purification lorsqu on veut dessaler par dialyse - dialyse contre un tampon de faible force ionique, à ce stade, peut provoquer la précipitation. - si le précipité inclut toute la protéine en question ou pas de tout, il y aura la purification ; la centrifugation permet à concentrer le précipité. Dessalage par gel filtration n est pas recommandé puisque les agrégats peuvent bloquer la colonne. - la précipitation isoélectrique des protéines peut être améliorée par l inclusion d un soluté qui décroît d avantage la solubilité de la protéine en question - par exemple des solvants organiques ou du polyéthylène glycol ensembles avec un ajustement de ph peuvent faciliter la précipitation. Les ions métalliques divalents e.g. 50mM MgCl 2 peuvent également provoquer la précipitation et même à des forces ioniques plus élevées. - dans la zone de force ionique de zéro à 0.5M, l augmentation en solubilité avec concentration croisant en sel est connue sous le nom de «salting in» (figure 2) - le sel brise des interactions électrostatiques entre les protéines favorisant la solvatation des régions polaires ainsi que les interactions ioniques avec le sel. B.2 Dessalage à des concentrations de sel élevé. - précipitation par dessalage ou «salting out» d une protéine à des hautes concentrations de sel représente une des techniques le plus utilisées en purification des enzymes BCM 1521 Solubilité d une protéine page 6/11
- cette technique est très distincte de l effet «salting in» - les γ-globulines sériques typiques de beaucoup de protéines qui sont insolubles à des faibles concentrations de sel mais soluble à force ionique physiologique, précipitent à une relativement faible concentration d ammonium sulfate - 1.5M. Par contre, les α- et β-globulines possèdent une solubilité en ammonium sulfate plus dans la moyenne et précipitent autour 2.5-3.0M - le dessalage est largement une fonction de l hydrophobicité de la protéine tandis que le «salting in» dépend de la distribution aux surfaces des protéines des groupements chargés et leurs interactions polaires avec le solvant - la compréhension nécessite les concepts suivants: - de l entropie et de l enthalpie - la différence entre une molécule dites «hydrophobique» et l eau - la structure de l eau et de la glace - la notion de l hydratation - de la solubilité des acides gras en l eau - la dissolution du méthane dans l eau - l effet «goutte huile» - une protéine typique en solution possède des régions hydrophobiques sur sa surface (chaînes latérales de Phe, Tyr, Leu, Ile, Met, Val). L interaction entre ces chaînes latérales et le solvant aqueux provoque une structuration des molécules d eau, i.e. imposant un arrangement plus ordonné ou gelé en ce qui concerne les molécules d eau autour des chaînes latérales par rapport à un état libre en solution. - cette structuration des molécules d eau est thermodynamiquement défavorable puisque ceci représente une forte réduction en entropie comparée à la protéine nonsolvatée et des molécules d eau autrement libres. - l origine de cette structuration réside au fait que l interaction avec des groupements hydrophobiques (van der Waals) possède un minimum d énergie en fonction de la distance interatomique qui est plus large que des ponts hydrogènes ou salins voir exemple suivant La conséquence de ce modèle est le suivant : BCM 1521 Solubilité d une protéine page 7/11
- si on commence avec la dissolution d une protéine sèche dans l eau représentée par: P + nh 2 O P nh 2 O où nh 2 O représente l eau structurée ou ordonnée autour des groupements hydrophobiques, donc S 0 est important et de signe négatif due à l imposition de l ordre. Les données expérimentales support cette interprétation et se manifeste à travers un G 0 plutôt négatif. Par conséquent H 0 est aussi fortement négatif (puisque H 0 = G 0 + T S 0 ). - pour la dissolution d une protéine, S 0, H 0 et G 0 ont donc le signe - - considérons deux protéines qui se rapprochent et qui interagissent via des résidus hydrophobiques ainsi libérant des molécules d eau : P nh 2 O + P mh 2 O P - P + (m + n) H 2 O - dans ces cas, S 0 sera large et positif et H 0 on s attend d être opposé du processus de dissolution donc positif. Le G 0 serait petit vu la tendance opposée entre H 0 et T S 0 et son signe dépendra des valeurs de H 0 et de S 0. En faible concentration de sel, G 0 est typiquement positif. Puisque la protéine est soluble, il n y a pas d agrégation significative du aux régions hydrophobiques. - Donc plutôt défavorable, vu que G 0 = H 0 - T S 0 > 0. (+) (+) - si, par contre, les molécules d eau libérées par ce processus sont séquestrées, la réaction peut procéder et l agrégation de la protéine est constatée - l hydratation des ions de sels neutres à une forte tendance à séquestrer l eau : AB + (n 1 + n 2 ) H 2 O A + n 1 H 2 O + B - n 2 H 2 O (Sel) (Ions) - une fois une quantité suffisante d eau a été enlevée de la protéine, l agrégation pourra avoir lieu. Il faut noter que H 0 sera positif pour cette réaction réaction inverse de dissolution précédente. BCM 1521 Solubilité d une protéine page 8/11
- la prédiction sera que l agrégation promue par des interactions hydrophobiques augmentera avec la température. - G 0 = H 0 - T S 0, T, G 0. Ce phénomène est caractéristique des interactions dites hydrophobes. Récapitulation : le dessalage d une protéine; c est une agrégation protéique qui implique des régions hydrophobes sur la surface d une protéine et au fur et à mesure, les ions de sel deviennent solvatés, les molécules d eau libres deviennent peu nombreuses. Il y a une plus grande tendance pour la protéine de perdre de l eau ordonnée ou gelée autour des résidus hydrophobiques; l agrégation est favorisée puisque les régions aliphatiques exposées ont une préférence à interagir entre elles plutôt avec de l eau. Figure récapitulative montrant précipitation par un sel BCM 1521 Solubilité d une protéine page 9/11
- les protéines avec un nombre plus important de régions hydrophobes sur leur surface ont une tendance à s agréger à des concentrations de sels plus faibles par rapport à des protéines qui possèdent peu de groupements hydrophobes sur leur surface. Deux sortes de sel - la nature du sel est très importante ; - les sels qui se lient et interagissent directement avec la protéine peuvent avoir un effet déstabilisant et ils sont désignés «chaotropiques» - les sels optimaux sont ceux qui encouragent l hydratation des régions polaires (et déshydratation de régions hydrophobiques) chez une protéine sans avoir aucune interaction avec la protéine - bonne corrélation entre augmentation de la tension de surface par le sel et sa capacité à précipiter des protéines - des anions multivalents comme sulfate, phosphate, et citrate avec des cations comme potassium, sodium et ammonium sont préférés. Ces sels sont solubles aux hautes concentrations, essentiel pour le dessalage - dans un mélange des protéines, la co-agrégation entre des protéines est importante et les mêmes protéines ne risquent pas de se rencontrer si les interactions avec d autres partenaires sont plus favorisées. BCM 1521 Solubilité d une protéine page 10/11
B.3 Précipitation avec des solvants organiques. - l addition d un solvant miscible avec l eau comme l éthanol ou l acétone à un mélange contenant des protéines a une variété d effets - le pouvoir de solvatation par l eau d une macromolécule chargée et hydrophillique décroît avec la concentration du solvant organique - ceci peut être attribué à une réduction en constant diélectrique ou un déplacement des molécules d eau de la surface de la protéine couplé à une immobilisation des molécules d eau due à leur hydratation par le solvant organique - l origine de l agrégation protéique est probablement due à des forces électrostatiques et dipolaires (similaire au phénomène de «salting in» en absence du solvant organique) - l évidence indique que la précipitation autour du point isoélectrique a besoin de concentrations de solvant organique plus faibles, suggérant que l agrégation soit similaire au cas de précipitation isoélectrique - l agrégation est provoquée par l interaction entre des régions possédant des charges opposées - un autre facteur qui détermine la solubilité dans un solvant aqueux - organique est la taille de la protéine - plus grande la protéine, le plus bas la concentration nécessaire afin de la précipiter. - les protéines plus larges possèdent une surface plus grande donc une meilleure chance d avoir une région à la surface chargée qui est complémentaire avec une autre protéine ; cette tendance est plus ou moins suivie dans les protéines globulaires - il faut noter que certains solvants organiques peuvent être en compétition pour l intérieur hydrophobique d une protéine et par ce fait dénaturant la protéine ; la purification à basse température peut palier ce problème. BCM 1521 Solubilité d une protéine page 11/11