Déshydratation, Inclusions, Coupes, et microscopie électronique à transmission

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1 Déshydratation, Inclusions, Coupes, et microscopie électronique à transmission Valérie Messent Lobservation de tissus vivants en microscopie électronique à transmission impose des techniques de préparations particulières: Conservation par fixation des constituants des structures biologiques (lipides, protéines, acides nucléiques) par réticulation; Déshydratation des tissus; Inclusion des tissus dans des résines permettant la réalisation des coupes ultrafines de 50 à 100 nm dépaisseur; Confection des coupes; Contraste des coupes ultra-fines; I- La déshydratation Elle consiste à remplacer l'eau des cellules par un liquide hydrophobe : l'alcool ou l'acétone. Indispensable si linclusion est réalisée dans des résines hydrosolubles mais Doit être suffisamment rapide pour préserver lintégrité des tissus Les liquides de déshydratation 1) Léthanol le plus couramment utilisé; se pratique à température ambiante; passages successifs des échantillons dans des bains d'acétone ou d'alcool de concentration croissante Ethanol 30 % 50 % 70 % 95 % 100 % 30 min 30 min 30 min 30 min 3 x 1 h Il faut faire des compromis!!! Les temps indiqués peuvent être diminués dans le cas de tissus peu compacts ou en couche mince (ex: culture de cellules)ou, au contraire, augmentés dans le cas de tissus très denses. Éviter le séjour prolongé des pièces dans les alcools faibles. Léthanol absolu doit vraiment être absolu! (sulfate de cuivre anhydre ou actigel). 2) Alcool butylique normal ou butanol moins pénétrant que léthanol, exige des bains plus prolongés; Avantages: le contraste des coupes ultra-fines par les sels de métaux lourds devient plus rapide et plus intense; le stockage des pièces fixées est possible dans le butanol sans dommage; Le butanol nétant pas miscible à leau, la déshydratation doit débuter par léthanol; II- Linclusion Linclusion comprend dabord linfiltration puis linclusion proprement dite de léchantillon dans la substance choisie. Les substances dinclusion sont des liquides visqueux sous forme de monomères polymérisables grâce à des agents chimiques (initiateurs, catalyseurs, accélérateurs) et physiques (chaleur, radiations UV). Ethanol 30 % 50 % 70 % 30 min 30 min 30 min Butanol > 12h Butanol > 12h

2 La technique dinclusion comporte deux étapes: Limprégnation est obtenue progressivement par passages des échantillons dans des bains résine-solvant de concentration croissante 1) Imprégnation de léchantillon par le milieu dinclusion; 2) Polymérisation à la chaleur ou aux UV; 1/3 résine 2/3 solvant 2/3 résine 1/3 solvant résine pure Linclusion est réalisée dans la résine liquide avec une orientation choisie en fonction des coupes envisagées. Puis, la résine est durcie par polymérisation à chaud ou aux UV. Il existe divers dispositifs d'inclusion : 2 types de milieux dinclusion utilisés en MET: polymérisation Les résines Epoxy: Les méthacrylates: polymérisation polymérisation Araldite, Epon, ERL (Spurr) LR White (London Resin White), Lowicryls (très toxiques, ex: K4M, résine polaire) 1) Les résines Epoxy Composition: Un monomère; Un ou plusieurs durcisseurs (pour régler la dureté); Un accélérateur; Propriétés des résines Epoxy: Insolubles dans leau; Solubles dans léthanol, lacétone, lépoxy 1-2 propane; Transparentes et jaunâtres; Recommandées pour les observations ultrastructurales classiques. Viscosité un peu élevée (sauf ERL); Ne changent pas de volume au cours de la polymérisation; Bonne dureté pour la coupe; Stables sous le faisceau délectrons; Assez imperméables après polymérisation; Polymérisent à 60 C;

3 2) Les méthacrylates Composition: Un ou plusieurs méthacrylates (méthylméthacrylates, butylméthacrylates,) Un plastifiant (pour régler la dureté); Un déstabilisateur (benzoyle peroxyde) OU Solutions commerciales déjà constitutées de mélanges (LR White, lowicryls) Réservées pour les échatillons devant être traités pour la cytochimie, les immunomarquages, les cryotechniques (lowicryls qui polymérisent à basse t, -20 C à -60 C) Propriétés des méthacrylates: Solubles le plus souvent dans leau; Transparentes et incolores; Faible viscosité; Changent souvent un peu de volume au cours de la polymérisation (échauffements locaux); Dureté un peu irrégulière posant parfois des problèmes de coupes; Un peu instables sous le faisceau délectrons; Perméables après la polymérisation; III- Confection des coupes en MET Pour garantir la qualité de lobservation au MET il faut des coupes ultrafines capables de résister au haut vide de la colonne du microscope et au bombardement des électrons du faisceau. Facteurs de réussite: Qualités de lopérateur (patience, concentration, dextérité,) Ultramicrotome Qualité du couteau Qualité du milieu dinclusion Épaisseur des coupes ultrafines: 60 à 90 nm Qualité et dimension du bloc Lultramicrotome (Reichert OMU3) Avance thermique Préparation du bloc Pupitre de commande du microtome Vitesse de coupe Tableau de correspondance couleur épaisseur des coupes Réglages épaisseur des coupes Interrupteur général Interrupteur motorisation (réalisation de coupes en automatique) Loupe binoculaire Mise au point Centrage de la loupe Éclairage Bras porte-bloc Orientation du bloc Manivelle pour coupes en manuel Bloc porte-couteau Orientation du couteau Avance grossière (couteau) Avance manuelle fine Commutateur d'éclairage Placer le bloc sur son support A l'aide d'une lame de rasoir : Enlever la résine superflue Tailler la pointe du bloc en forme de pyramide

4 Fabrication des couteaux en verre Fabrication des couteaux en verre pour la réalisation des coupes semi-fines A partir d'un barre en verre, couper des petits carrés ici à l'aide d'un "KNIFEMAKER" LKB Recouper le carré en 2 triangles Couteaux en diamant pour la réalisation des coupes ultra fines Couteau utilisable à sec par exemple pour entamer les blocs Couteau avec "piscine" fixée et étanchéifiée avec du vernis à ongle ou de la paraffine Réalisation de coupes semi-fines Réalisation de coupes ultra-fines Coupes dépaisseur 0,25 0,5 µm Séparer les coupes (à laide dun cil monté sur allumette) Utiliser un couteau (en verre ou diamant) muni d'une "piscine" Remplir la piscine d'eau distillée. Ajuster le niveau de façon à ce que la surface de l'eau réfléchisse la lumière Ajuster la distance couteau-bloc. Faire quelques coupes "à la main". Afficher l'épaisseur de coupe désirée Démarrer le moteur et laisser les coupes se faire automatiquement. Lorsqu'un nombre de coupes suffisant est obtenu : Récupérer les coupes sur grilles, soit en posant la grille sur la coupe, soit en glissant la grille sous la coupe

5 Coupes semi-fines : -0,5 à 1 µm - Elles permettent de se repérer dans l'échantillon - Observées en microscopie photonique après coloration topographique au bleu de toluidine (1 goutte, quelques secondes à chaud). Les grilles : en cuivre pour les colorations ordinaires en nickel ou en or pour les immuno-marquages à l'or colloïdal 100 Mesh 200 Mesh Coupes ultrafines: - 60 à 90 nm - Elles seront observées au microscope électronique à transmission. Récolte stockage des coupes IV- Contraste des coupes ultra-fines Une diminution de lépaisseur des coupes entraîne une diminution du contraste Le matériel biologique est essentiellement composé d'atomes légers (carbone, hydrogène, oxygène,...), et possède par conséquent un faible pouvoir diffuseur. Récupérer les coupes flottantes soit en posant la grille sur les coupes, soit en glissant la grilles sous les coupes Éliminer lexcès deau à laide dun papier filtre Nécessité de contraster pour observer! Contraste positif Contraste négatif Stocker les grilles dans un portoir ad hoc Acétate d'uranyle 1) Contraste positif Parafilm Grille + coupes Solutions de sels de métaux lourds: les atomes de métaux lourds fixés absorbent plus ou moins les électrons 7 min. A l'obscurité Rinçage Acétate duranyle Citrate de plomb NaOH H 2O UP Citrate de plomb Séchage sur papier Joseph Nucléoprotéines: Noyau, ribosomes, nucléoles Membranes plasmiques et membranes des divers organites cellulaires 7 min. Rinçage H 2O UP Séchage sur papier Joseph

6 2) Contraste négatif (coloration négative) Technique utilisée pour lobservation directe dobjets de petites dimension (virus, molécules, bactéries, particules, organites), ne nécessitant pas dinclusion. Dépôt autour de ces objets dune couche homogène dune substance dense aux électrons (acide phosphotungstique). Les structures apparaissent en «négatif»: en clair sur fond sombre Conditions demploi: ph Concentration les sels de métaux lourds (tungstène) doivent éviter la réaction chimique entre le matériel à étudier et le colorant (sinon, coloration positive. Les grilles doivent être recouverte dun film (souvent hydrophobe, ex: collodion-carbone ou Formvar) Observation au microscope électronique!

7 Virophage inclus dans une capside de Mimivirus (virus géant) Contraste négatif Adénovirus Poliomavirus, SV 40