Table ronde technologique «QUANTIFICATION DES MITOCHONDRIES» 1) Marqueurs biochimiques Jean-François Dumas (Tours) 2) ADN mitochondrial Christophe Rocher (Bordeaux) 3) Imagerie Frédéric Joubert (Paris)
Comment quantifier les mitochondries? 1999 1996 1997 1998 2000
nombre de mitochondries?? densité mitochondriale?? volume mitochondrial?? masse mitochondriale??
Table ronde technologique «QUANTIFICATION DES MITOCHONDRIES» 1) Marqueurs biochimiques Jean-François Dumas (Tours) 2) ADN mitochondrial Christophe Rocher (Bordeaux) 3) Imagerie Frédéric Joubert (Paris)
Table ronde technologique «QUANTIFICATION DES MITOCHONDRIES» 1) Marqueurs biochimiques Jean-François Dumas (Tours)
Citrate synthase (CS) : description matrice mitochondriale Enzyme du cycle de Krebs qui forme du citrate à partir de l oxaloacétate et de l acétyl-coa Matrice mitochondriale ADN nucléaire Régulation allostérique : inhibition par NADH et succinyl-coa
Citrate synthase (CS) : dosage par spectrophotométrie Principe de la réaction Réaction catalysée par la citrate synthase (CS) CS Acetyl-coA + oxaloacétate citrate + coa-sh + H + + H 2 O Réaction colorimétrique 2 coa-sh + 2 DTNB 2 TNB + coa-s-s-tnb = réaction colorée jaune 412 nm
Citrate synthase (CS) : dosage par spectrophotométrie Absorbance TNB (412 nm) + oxaloacétate sans oxaloacétate 2 min 5 min temps (min) activité non spécifique ( 35% activité totale dans foie) activité totale activité CS spécifique = activité totale activité non spécifique
Citrate synthase (CS) : conditions et paramètres de mesure Dosage en cuve ou sur microplaque Température dosage : 20 37 C Homogénats de cellules, de tissus ou d organes détermination masse mitochondriale d un échantillon donné Préparation enrichies en mitochondries normalisation activité intrinsèque phosphorylation oxydative par unité fonctionnelle Rupture des membranes (plasmique et mitochondriales) pour un meilleur accès à l activité
Citrate synthase (CS) : conditions et paramètres de mesure Possibilité de conservation des échantillons avant dosage (azote puis -80 C) Quantité matériel nécessaire: 0,5-10 µg protéines (suspension mitochondriale) 10-50 µg protéines (homogénats) 100000-500000 cellules 100 dosages en microplaque : 200 euros
Citrate synthase (CS) : conditions et paramètres de mesure Kits de dosage commercialisés Sigma : Citrate Synthase Assay Kit 786 euros : 100 dosages en cuve 480 dosages en microplaque Abcam : Citrate Synthase Activity Assay Kit (ab119692) 510 euros : 96 dosages en microplaque Étape d immunocapture (3 heures) CliniSciences : Citrate Synthase Activity Colorimetric Assay Kit 350 euros : 100 dosages en microplaque Interchim : MitoCheck TM Citrate Synthase Activity Assay Kit?? euros : 96 dosages en microplaque
Citrate synthase (CS) : de nombreux exemples d utilisation diverses lignées cellulaires : HepG2, HeLa, MCF-7, HEK293, fibroblastes. divers tissus/organes : foie, cœur, cerveau, muscles diverses origines : humain, souris, rat diverses situations physiologiques/pathologiques : personne en «bonne santé», entraînement physique, cancer, obésité, insulinorésistance, vieillissement
Citrate synthase (CS) : une méthode quantitative ou semi-quantitative Exemple d activité CS sur homogénat cœur souris CS = 600 µmol/min/mg prot souris mdx, temp: 37 C CS = 0,018 µmol/min/mg prot Souris transgéniques, temp: 25 C CS = 50 µmol/min/mg prot Souris transgéniques, temp: 25 C Difficulté de comparer entre différents laboratoires et différentes études
Citrate synthase (CS) : conclusion Dosage simple (réalisation et matériel) Faible quantité de matériel (cellules, tissus, organes) nécessaire Bonne reproductibilité: faibles variations intra- et inter-dosages Pas très cher Pas toujours possible de comparer entre différentes études Toujours possibilité que activité intrinsèque soit modifiée
Cardiolipines (CL) : description dans cellules mammifères signature lipidique des mitochondries localisation majoritaire dans feuillet interne de membrane interne puis dans points de contact puis dans membrane externe 10 à 20% des phospholipides mitochondriaux totaux
Cardiolipines (CL) : un bon marqueur? marqueur non enzymatique mais constitutif mais liens très forts avec activités mitochondriales car implication dans : - activité et assemblage des complexes de la phosphorylation oxydative - dynamique mitochondriale - apoptose
Cardiolipines (CL) : un bon marqueur? oui quantité CL meilleur marqueur de la quantité de mitochondries (16 individus)
Cardiolipines (CL) : un bon marqueur? oui Diabetes, 2007 +54% +48% +56% corrélation entre densité mitochondriale et quantité CL (r = 0,67; p < 0,01) corrélation entre densité mitochondriale et activité CS (r = 0,61; p < 0,01) corrélation entre quantité CL et activité CS (r = 0,76; p < 0,001)
Cardiolipines (CL) : un bon marqueur? non Syndrome de Barth : maladie génétique (gène codant pour la Taffazine -TAZ-) Synthèse Remodelage Réticulum endoplasmique Membrane externe mitochondriale Acyl-CoA polyinsaturés ALCAT-1 CL mature Espace intermembranaire Membrane CDP-DAG + CLS interne CDP-DAGPGPS + G3P PGP PG mitochondriale PTPMT1 CL immature ipla2γ Matrice mitochondriale PC MLCL Acyl-CoA TAZ MLCLAT-1 Lyso-PC CL mature MLCL CL métabolisme des cardiolipines Pas de variation ou augmentation quantité mitochondries mais diminution quantité CL
Cardiolipines (CL) : un bon marqueur? non chimiorésistance MCF-7 MCF-7dox cellules cancéreuses mammaires IC 50 = 0,11 µm IC 50 = 7 µm doxorubicine x 60 résistance à la doxorubicine activité CS = densité mitochondriale (MET) = quantité CL Pas de variation quantité mitochondries mais diminution quantité CL
Cardiolipines (CL) : dosages 1) High Perfomance Thin Layer Chromatography (HPTLC)-densitométrie Rf=1 Front of the eluent CL PA PE Quantification avec standard Rf=0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 PI PC+PS SM Deposit 2) High Performance Liquid Chromatography Quantification avec standard Détection seulement des principales CL Ritov et al, J Chromato B, 2006
Cardiolipines (CL) : dosages 3) Spectrométrie de masse Quantification avec standard Détection de toutes les espèces de CL (composition en AG des 4 ch. latérales) 4) Fluorescence sonde Nonyl Acridine Orange (NAO) (488/525 nm) Méthode semi-quantitative Problème de spécificité??
Cardiolipines (CL) : conclusion Bon marqueur??? Uniquement dans un nombre limité de situations Assez faible quantité de matériel nécessaire - cellules: 10-15 millions - tissus, organes: qq mg Dosages complexes, pas réalisables dans tous les laboratoires Dosages chers (HPTLC-densitométrie = 3000 euros pour 100 dosages)
Autres techniques : les protéines mitochondriales «constitutives»? Intérêt = marqueur non enzymatique VDAC Rôle dans transport des métabolites et dans apoptose (libération protéines pro-apoptotiques et intéraction avec acteurs apoptose)
Autres techniques : les protéines mitochondriales? Utilisation de VDAC comme marqueur quantité mitochondries Journal of Physiology, 2015 Mais quantification par Western-Blotting
«quantification des mitochondries» : marqueurs biochimiques Que choisir? CS Autres techniques