Fluorimétrie Molécualire Fluorimétrie moléculaire: définition et description du phénomène, mesures quantitatives, introduction à l'utilisation de la fluorimétrie quantitative et à l'utilisation de marqueurs fluorescents en biologie. Hors sujet, hors programme : la fluorimétrie atomique 1. Le phénomène de fluorescence moléculaire Les différents états énergétiques possibles des électrons d'une molécule donnée sont discrets, quantifiés. Les états électroniques moléculaires sont quantifiés. Les différences d'énergie entre les états électroniques moléculaires varient de 150 à 600 kj.mol -1. On rappelle que les orbitales moléculaires résultent de la combinaison d 1 orbitales atomiques d' électrons d'atomes liés dans la molécule considérée. A chaque état électronique correspond plusieurs niveaux vibrationnels quantifiés (les différences d'énergie entre les états vibrationnels varient de 4 à 40 kj.mol -1 ). A chaque état vibrationnel correspond plusieurs niveaux rotationnels quantifiés (les différences d'énergie entre les états rotationnels sont inférieurs à 0,5 kj.mol -1 ). Lorsqu'une molécule donnée présente la propriété de fluorescence c'est que : - on a réalisé une excitation photonique UV de la molécule. Lorsqu'une molécule donnée est excitable à la longueur d'onde UV λ, c'est que λ correspond à une énergie permettant le transfert d'un électron depuis une orbitale moléculaire à l'état fondamental de plus basse énergie vers une autre orbitale moléculaire d'énergie plus élevée correspondant à un état dit excité. - Lors de la désactivation, on assiste dans un premier temps au retour à l'état vibrationnel de moindre énergie de l'état excité (relaxation, durée type = 10-12 s). Puis le retour vers l'état fondamental se fera sur un niveau vibrationnel quelconque de l'état électronique fondamental de moindre énergie avec émission d'un photon (durée de vie à l'état excité de l'ordre de 10-9 s). La durée de l'ensemble du processus est de l'ordre de 10-9 à 10-8 s pour une molécule. La longueur d'onde d'émission est toujours supérieure à la longueur d'onde d'excitation puisque ΔE = hv = hc/λ. Quand ΔE diminue, λ augmente. Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 1/6
En fluorescence moléculaire on excite dans l'uv et on observe des émissions de longueurs d'ondes plus élevées dans l'uv proche ou le visible. Elles correspondent à des transitions faisant intervenir des électrons Π et des électrons n. Les molécules à groupements fluorescents sont souvent des molécules avec un(des) polycycles conjugués. Remarque : le phénomène de phosphorescence correspond, lui aussi, à une émission de photons après une excitation photonique. Cependant, il fait intervenir un changement de spin de l'électron lors de la phase non radiative (le changement de spin conduit à ce qu'on appelle un état triplet en mécanique quantique). Tout état triplet excité a une durée de vie très longue de 10-5 s à quelques secondes ou quelques minutes. Le retour à l'état fondamental (retour à ce qu'on appelle un état singulet pour lequel les 2 électrons d'une orbitale sont de spin opposés) est émissif. On parle alors de phosphorescence. Phosphorescence et fluorescence font partie des phénomènes de luminescence. Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 2/6
2. Le spectrofluorimètre Le mot fluorimètre devrait être réservé à des appareils à filtres qui ne permettent pas l'étude des spectres mais sont dédiés à des composés fluorescents donnés. Dans les fluorimètres et les spectrofluorimètres, l'angle entre le flux d'excitation et le flux d'émission mesuré est très important à définir. En général, on choisi un angle de 90 (aucune lumière d'excitation réfléchie ne peut parvenir au photorécepteur). Attention : on utilise des cuves quartz (on travaille dans l'uv pour l'excitation) à 4 faces polies. Un microscope à fluorescence se comporte en fait comme un fluorimètre pour lequel l'œil sert de photorécepteur. 3. Spectres de fluorescence Toute molécule fluorescente se caractérise par 2 spectres: le spectre d'excitation (efficacité des différentes longueurs d'ondes à exciter pour conduire finalement à une émission luminescente) et le spectre d'émission (intensité relative des émissions aux différentes longueurs d'onde). Chacun est un spectre de bande(s). 3.1. Spectres d'excitation Par principe, il est en correspondance parfaite avec le spectre d'absorption. En fait, pour l'obtenir pratiquement avec un spectrofluorimètre, on va placer le monochromateur de réception sur d'émission de fluorescence à la longueur d'onde de maximum d'intensité de fluorescence et on va balayer les longueurs d'onde d'excitation avec le monochromateur d'excitation. Comme les lampes sources n'ont pas une intensité de flux d'excitation constante avec λ, on obtient un spectre d'excitation apparent pour le fluorimètre utilisé (qui peut donc correspondre à une zone du spectre d'absorption légèrement déformé). 3.2. Spectres d'émission Pour l'obtenir, on règle l'excitation à λ, du maximum d'excitation. On enregistre l'intensité d'émission pour différentes longueurs d'ondes sélectionnées par le monochromateur définissant I de la "lumière" atteignant le photomultiplicateur (le capteur). En fait, À du maximum d'émission de fluorescence qui va être obtenu est peu dépendant de la longueur d'onde d'excitation. Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 3/6
3.3. Représentation conventionnelle Par convention, on représente souvent les 2 spectres sur un même graphe du type de celui de la figure 7. Il faut bien avoir en tête à quoi correspond vraiment chaque spectre. 4. Remarque concernant le phénomène de transfert de fluorescence Si 2 chromophores fluorescents qui appartiennent à une même molécule sont suffisamment proches et que le spectre d'émission d'un des 2 chromophores appelé donneur recouvre le spectre d'excitation de l'autre chromophore appelé accepteur, on constate que l'émission de fluorescence sera due en fait au chromophore accepteur. Il y a transfert de fluorescence vers le chromophore accepteur. 5. Rendement quantique de fluorescence (Y) (hors programme) Y = (nombre de molécules se désactivant d'un état excité vers l'état fondamental en émettant un photon) / (nombre de photons absorbés) = (nombre de photons émis) / (nombre de photons absorbés). 0 < Y < 1. 6. Facteurs du milieu modifiant la fluorescence d'une molécule donnée - nature du solvant : selon sa nature, le spectre d'émission et le rendement quantique seront modifiés. - ph du milieu : pour des molécules fluorescentes ionisables en solution aqueuse, les variations de ph entraînent des variations de spectre d'émission et de rendement quantique. - température et viscosité : en diminuant la température et en augmentant la viscosité, on augmente le rendement quantique. - effets d'autres molécules environnantes : par exemple, le dioxygène est connu pour abaisser le rendement quantique de fluorescence de nombreux fluorochromes. (Désaération des solutions à analyser). Il est d'usage d'appeler "Quenching", toute influence qui diminue l'intensité d'émission de fluorescence. Ainsi de nombreuses natures de solvant peuvent participer au "Quenching". 7. Fluorimétrie et analyse quantitative Soit des solutions contenant un fluorochrome mesurées dans des conditions de rendement quantique constant. On mesure à λ exc. donnée et λ ém. donnée. Soit Φ 0 l'intensité du flux photonique d'excitation à λ exc.. Soit Φ l'intensité du flux photonique transmis (non absorbé) à λ exc. Soit ε le coefficient d'absorbance moléculaire du fluorochrome étudié à λ exc.. Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 4/6
Soit I l'épaisseur de cuve de mesure. Soit c la concentration en fluorochrome. On a Φ = Φ 0 10 -εlc (loi de Béer lambert) Donc le flux absorbé est Φ abs = (Φ 0 - Φ) soit Φ abs = Φ 0 - Φ 0 10 -εlc soit Φ abs = Φ 0 (1-10 -εlc ) La fluorescence est mesurée à λ ém. donnée. Le rendement quantique est Y et les photons mesurés sont ceux de longueur d'onde λ ém. dont l'énergie est plus faible que celle des photons absorbés et selon un angle qui fait qu'on ne mesure qu'une fraction f de la fluorescence. On a donc Φ fluorescence mesurée = f Y Φ 0 (1 10 -εlc ) avec 0<f<1 et avec 0<Y<1. Si c est faible, le développement limité au premier ordre donne : Φ fluorescence mesurée = f Y Φ 0 ln(10) ε I c qui devient : Φ fluorescence mesurée = K c avec K coefficient qui sera évalué par étalonnage. 8. Applications de la fluorescence moléculaire en biologie 8.1. Fluorimétrie et dosages quantitatifs de substances (hors anisotropie de fluorescence) Principe du dosage exposé au paragraphe 7. De nombreux dosages en biologie peuvent être réalisés en mesurant finalement une intensité de fluorescence. De tels dosages exigent de travailler dans des milieux de composition strictement déterminée pour s'assurer que les rendements quantiques ne varient pas. La sensibilité des dosages par fluorimétrie est de 100 à 1000 fois plus grande que celle des dosages par absorptiométrie! Les dosages fluorimétriques impliquent 2 longueurs d'ondes caractéristiques de la substance à mesurer: une λ exc. donnée et λ ém. donnée. Ceci améliore a priori les capacités de tels dosages à éviter les interférences par rapport aux dosages absorptiométriques qui sont réalisée à une longueur d'onde d'absorption donnée. Des applications exemples en biologie sont : - fluorimétrie quantitative dans les dosages mettant en œuvre des réactions enzymatiques et faisant intervenir le couple NAD + /NADH,H +. Voir à ce sujet les chapitres concernant les dosages mettant en œuvre des réactions enzymatiques et faisant intervenir le couple NAD + /NADH,H +. - fluorimétrie quantitative dans les dosages de substances mettant en œuvre des réactions Ag/Ac et des Ag ou des Ac marqués par des fluorochromes = dosages par immunofluorescence. De tels dosages sont réalisables en méthodes compétition en phases hétérogène, en méthodes non compétitives en phase hétérogène ou en méthode compétitive en phase homogène. Il faut voir à ce propos le cours dédié sur les dosages de substances mettant en œuvre des Ag ou des Ac marqués. - fluorimétrie quantitative en cytométrie de flux. Voir chapitre dédié. On rappelle simplement qu'une population de cellules à étudier par cytométrie de flux peut être marquée par des fluorochromes : par exemple le marquage de l'adn au BET, le marquage spécifique de telle ou telle cellule par un anticorps conjugué à un fluorochrome. Chaque cellule engagée dans le tube de flux passe devant un éclairage laser à une longueur d'onde adéquate et donne un flash de fluorescence dont l'intensité dépend de la quantité de fluorochrome fixé. Ceci permet de construire des histogrammes de distribution dans la population des cellules analysées et de réaliser des tris de cellules. 8.2. Anisotropie de fluorescence (hors programme) On utilise une "lumière" d'excitation polarisée. On mesure l'émission de fluorescence selon 2 angles de polarisation (1 parallèle et 1 perpendiculaire _ _à la polarisation de la "lumière" d'excitation). L'effet d'anisotropie de fluorescence A est défini par : (Intensité émission polarisée ) - (Intensité émission polarisée _ _ ) A = ---------------------------------------------------------------------------------------------- (Intensité émission polarisée ) + 2 x (Intensité émission polarisée _ _) Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 5/6
Applications : - Un antigène marqué par un fluorochrome, selon qu'il est libre ou lié à un anticorps, ne donnera pas la même polarisation de fluorescence (essentiellement par effet de taille, le complexe Ag-Ac est plus gros que l'ag libre). Ceci permet des dosages de substances par méthodes immunologiques très rapides qui ne nécessitent pas toutes les étapes de lavage des méthodes immunofluorimétriques ou immunoenzymatiques classiques. - L'effet d'anisotropie de fluorescence est fondateur de méthodes permettant d'évaluer le volume moléculaire à l'état hydraté de biomolécules (hors programme) d'étudier des interactions protéines ligands ; protéines molécules de l'environnement solvant. 8.3. Marquages fluorescents "qualitatifs" 8.3.1. Marqueurs fluorescents utilisés pour observations de cellules en microscopie à fluorescence - Marquages à l'acridine orange ou au DAPI ou aux marqueurs fluorescents modernes d'activité biologique et numérations DEFT. Voir chapitre dédié. On rappelle simplement ici que l'acridine est un fluorochrome métachromatique dont la fluorescence n'apparaît que lorsque la molécule est intercalée dans les acides nucléiques ADN et ARN. L'émission est verte pour des acides nucléiques doubles brins et rouge pour des acides nucléiques simples brins. - Coloration en fluorescence des mycobactéries à l'auramine. Voir chapitre dédié. - Marquages spécifiques par anticorps conjugués à des fluorochromes en histologie/cytologie et en microbiologie. Voir les chapitres dédiés. Les mots clefs : techniques directes et techniques indirectes. 8.3.2. Marquage fluorescent de l'adn au BEI et électrophorèses Voir le chapitre électrophorèses d'acides nucléiques. 8.3.3. Remarque concernant le phénomène d'exctinction de fluorescence Les marqueurs fluorochromes utilisés en biologie sont généralement des molécules peu stables et dans les milieux biologiques, l'éclairage UV conduit à l'apparition de radicaux libres qui conduisent à une réaction autocatalytique de destruction des fluorochromes. C'est le phénomène d'extinction de fluorescence : la fluorescence diminue (de façon exponentielle) sous éclairage UV. Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 6/6