DU Cicatrisation des plaies, brûlures et nécroses Bactériologie cutanée Pr Emmanuelle CAMBAU Service de Bactériologie-Virologie Bactériologie clinique Champs d applications multiples Mise en évidence des bactéries responsables d infections Surveillance et étude de bactéries émergentes origine environnementale, animale, humaine Dépistage et surveillance des bactéries multirésistances impliquées ou non dans les infections acquises à l hôpital Bactériologie clinique Distinguer la «bonne» bactérie de la «mauvaise» Les Bactéries Traite des interactions entre les micro-organismes et l être humain Biomasse Bactérienne Habitat Les surprises du classement Nombre de cellules % du total Sous-sol marin 3,6 x 10 30 66 Sous-sol terrestre 1,4 x 10 30 26 Sol émergé 2,6 x 10 29 4,8 Eau de mer 1,2 x 10 29 2,2 Eau douce et Lacs salés 2,3 x 10 26 0,00043 Animaux domestiques 4,3 x 10 24 0,000080 Glace polaire 4,0 x 10 24 0,000074 Termites 6,5 x 10 23 0,000012 Humains 3,9 x 10 23 0,0000072 Oiseaux domestiques 2,4 x 10 21 0,000000044 Les bactéries Procaryotes (absence de noyau) Effectuent pour leur compte les synthèses cellulaires nécessaires à leur croissance et à leur multiplication Développement intra-cellulaire éventuel Métabolisme reste indépendant de celui de l hôte contrairement aux virus 1
Structure de la bactérie Structure de la bactérie Résistance aux antibiotiques Chromosome Plasmide (Résistance naturelle) (Résistance acquise) Gène de résistance Transfert vertical (dans la descendance) Transfert horizontal (intra ou inter espèce) Transmission possible d un patient à l autre via les mains du personnel ou d autres sources Relation entre hôtes et bactéries Bactéries saprophytes de l environnement présence transitoire et sans danger Bactéries commensales au contact des muqueuses (E. coli ) ou de la peau (S. epidermidis) Bactéries opportunistes Bacille pyocyanique Bactéries pathogènes M.tuberculosis C. diphteriae, Legionella, S. typhi Taxonomie et classification Bien identifier pour définir et classer Classification en Famille, Genre, Espèce Famille: Enterobacteriaceae, Genre: Escherichia, Espèce: coli Bactéries à Gram positif Paroi bactérienne Aspect des bactéries au Gram Bactéries à Gram négatif Mycobactéries 2
Staphylococcus aureus Staphylocoques blancs et dorés aspect en culture Streptocoque S. aureus S. auricularis S. capitis S. caprae S. cohnii S. condimenti S. epidermidis S. equorum S. haemolyticus S. hominis S. intermedius S. lugdunensis S. pasteuri S.piscifermentans Staphylocoques S. saccharolyticus S. saprophyticus S. schleiferi S. sciuri S. simulans S. warneri S. xylosus Aspect des bactéries au Gram Corynébactéries Aspect des bactéries au Gram Propionibacterium 3
Entérobactéries Entérobactéries C. freundii E. aerogenes E. cloacae E. gergoviae E. coli E. hermanni E. asburiae L. adecarboxylata P. agglomerans P. mirabilis P. vulgaris P. rettgeri S. marcescens K. pneumoniae K. ascorbata S. marcescens S. typhimurium Shigella flexneri Aspect des bactéries au Gram Pyocyanique Acinetobacter Fusobactéries et spirochettes Spores bactériennes 4
Mycobacterium tuberculosis Rapidly growing mycobacteria Slowly growing mycobacteria Bactéries planctoniques Biofilm Mise en place et organisation d une communauté bactérienne adhérant à une surface et enrobée d une matrice d exopolysaccharide Biofilm bactérien Biofilm Modèle de formation d un biofilm par Pseudomonas aeruginosa. Résistance aux traitements antibiotiques Amplification et synchronisation de la virulence à l ensemble de la population bactérienne 5
Biofilm Les biofilms pourraient représenter le mode de vie normale des bactéries Les Flores N étudier que les bactéries planctoniques (forme libre) laisse de coté un pan énorme de la physiologie bactérienne L homme est un hybride primate-microbes L homme est un hybride primate-microbes Le corps humain est un écosystème pour des milliards de bactéries qui cohabitent naturellement, notamment sur la peau et dans le tube digestif Nous hébergeons dix fois plus de bactéries que nous ne possédons de cellules somatiques et germinales. L extrapolation des résultats d identification de moléculaire indique que nous hébergerions de 15 à 30 000 espèces bactériennes différentes. L homme est un hybride primate microbes L homme est un hybride primate microbes la séquence complète de ces microbiomes, représente probablement bbl un pool de gènes 100 fois supérieur au génome humain. Le microbiote varie d un individu d à l autre, d une région à l autre, d un site anatomique à l autre 6
L homme est un hybride primate microbes «Human Microbiome Project» Comparer les flores bactériennes de volontaires sains à celle de patients atteints d'infections aiguës ou de pathologies de type psoriasis ou syndrome du côlon irritable. Flores microbiennes Flore commensales ou résidentes : Flore cutanée (peau, conjonctive, nez) Flore bucco dentaire, oropharynx Flore digestive Flore vaginale Sites stériles : Sang, urine, lcr, liquide articulaire Flores commensales Une flore commensale vit en harmonie avec son hôte Tant qu elle ne change pas de compartiment Colon Urine Peau Sang Flores commensales Les germes commensaux ne provoquent pas d infections spontanées dans leur site. Toutefois,, ils compliquent les démarches d'identification des bactéries dans les prélèvements polymicrobiens Expertise bactériologique pour distinguer les pathogènes des germes banaux Flore digestive Abondante : le tractus intestinal héberge le chiffre astronomique de 10 14 bactéries (cent milliards de bactéries par gramme de selles). 1 kg de bactéries dans un intestin humain adulte 10 à 100 fois les cellules de notre corps Flore digestive Diversifiée: 1000 espèces de bactéries représentent 90% de la population p totale «Le métagénome intestinal» l ensemble des bactéries cohabitant dans notre tube digestif est aujourd hui considéré comme un organe à part entière. 7
Flore digestive La peau n est pas un site stérile Flore cutanée Ecosystème complexe Rôle de défense non spécifique contre les microorganismes «pathogènes» Epiderme barrière physique Flore (microbiote) cutané Ph Basse température Desquamation Flore résidente La peau n est pas un site stérile 10 2 à 10 5 bactéries par cm 2 selon les zones Staphylocoque Propionibacterium Majorité de bactéries à Gram positif Staphylocoques Corynébactérie Peptostreptococcus Propionibacterium Anaérobies Corynébactéries 8
La peau n est pas un site stérile Flore transitoire Flore de contamination Représentation schématique des zones de très forte densité bactérienne de l épiderme Composée de cocci Gram positif Staphylococcus aureus (20% de porteurs sains) Composée de bacilles Gram négatif Entérobactérie (E.coli, Proteus sp) Pyocyanique, Acinetobacter Variation des populations bactériennes en fonction des zones cutanées Variation des populations bactériennes en fonction des zones cutanées microbiote et microbiome cutanés Ecosystème complexe 9
L'infection doit être distinguée de la colonisation bactérienne L'infection doit être distinguée de la colonisation bactérienne Rupture de l équilibre Colonisation Normal Peu virulent Flore bactérienne résidente (Flore commensale) Flore bactérienne transitoire Infection Modification de flore Germes virulents Retard cicatrisation Extension Locaux Lésions cutanées : plaies, brûlures Mauvaise hygiène Macération Corticothérapie locale Généraux Déficit immunitaire Diabète sucré Corticothérapie générale Immunosuppresseurs 10
La distinction colonisation/infection peutelle être basée sur la clinique? COLONIZING WOUND GRADE 1 Conférence du Consensus International sur le (SPILF 2007, IDSA 2007) : Critères diagnostiques et classification des pieds diabétiques infectés 4 GRADES INFECTING WOUND GRADE 2 GRADE 3 GRADE 4 La distinction colonisation/infection peutelle être basée sur la bactériologie? Contamination/ Colonisation Flore bactérienne résidente = Flore commensale Infection Pathogènes usuels impliqués Flore bactérienne transitoire = Portage de bactéries pathogènes Oui la distinction est actuellement clinique Distinction colonisation/infection: espèces bactériennes et degré de virulence Colonisation Bactéries de la flore commensale: SCN Corynébactéries Bactéries à potentiel de virulence peu connu: Entérocoques Pseudomonas aeruginosa Infection S. aureus +++ Streptocoques -hémolytiques Anaérobies Entérobactéries: Proteus mirabilis, Escherichia coli, Enterobacter sp., Klebsiella sp. Bactéries Epidémiologie des ostéites du pied Senneville CID 2006 Wheat APMR 1986 Lavery JFAS 1995 Newman JAMA 1991 Cocci à Gram + S. aureus 26 40 47 31 SCN 25 10 11 50 Streptococci 12 45 61 27 Enterococcus sp. 8 30 28 8 Autre 5 10 - - Bacilles à Gram - Entérobactéries 11 55 14 20 Pseudomonas sp. 3 5 11 15 Anaérobies 6 60 15 4 Polymicrobien - 70 83 - Rôle pathogène de P. aeruginosa et Enterococcus sp.? La distinction colonisation/infection peutelle être basée sur la bactériologie? Contamination/ Colonisation Flore bactérienne résidente = Flore commensale Infection Pathogènes usuels impliqués Flore bactérienne transitoire = Portage de bactéries pathogènes Non le diagnostic ne peut pas être basé sur l espèce bactérienne 11
La distinction colonisation/infection peut-elle être basée sur la quantification des bactéries? Les prélèvements bactériologiques ne sont indiqués que infection établie cliniquement. [a part, recherche de BMR] Objectif isolement et identification des bactéries responsables de l infection étudier la sensibilité aux antibiotiques Méthodes de prélèvement microbiologique Définir les objectifs de l analyse, la manière de prélever selon les différentes présentations cliniques, le matériel de prélèvement à utiliser, les conditions de transport, les techniques analytiques l interprétation des résultats de la culture Des protocoles conçus conjointement par les cliniciens et les microbiologistes sont indispensables. Débridement Mécanique Avant tout prélèvement, il faut PREPARER LA PLAIE. débridement mécanique (voire chirurgical) : curette ou scalpel stériles un nettoyage : gaze imbibée de sérum physiologique gq stérile NB : utilisation d antiseptiques possible, mais à éliminer par du sérum physiologique stérile avant de réaliser le prélèvement. L écouvillonnage simple Méthode la plus utilisée car la plus facile mais A EVITER, car la moins fiable Peu adapté à la mise en évidence optimale des bactéries réellement responsables de l infection Recueil de la totalité de la flore aérobie colonisante si la préparation n est pas optimale Difficultés d isoler les bactéries anaérobies Le Curetage Ecouvillonnage : Débrider et nettoyer l ulcère Prélèvement du tissu par grattage de la base de l ulcère au moyen d une curette ou d un scalpel stériles Prélever en frottant avec un écouvillon la périphérie du fond de l ulcère Cette méthode est indiquée pour les prélèvements superficiels et les plaies anfractueuses profondes 12
Le Curetage Ecouvillonnage : Antibodies and antibiotics unable to penetrate biofilm Scab EPIDERMIS Plus spécifiques que l écouvillonnage simple moins de bactéries colonisantes identifiées DERMIS Seulement si débridement de bonne qualité Immune cells unable to clear biofilm Wound fluid Wound matrix Recherche de bactéries anaérobies possible Granulation tissue Conditions: Chronic inflammation and release of proteases result in tissue dammage Bacterial cytotoxins kill host immune cells HYPODERMIS Vessels Macrophages Planktonic bacteria Biofilm matrix with ph, po 2, waster gradients Antibiotic chelator enzymes Bacterial cytotoxins Neutrophils Biofilm bacteria embedded in protective EPS Quorum sensors Antibiotics L Aspiration à l aiguille fine : Débrider et nettoyer Désinfecter la peau en périphérie (antiseptique) Ponctionner avec une seringue et une aiguille pour IM ou SC : La ponction doit être effectuée en passant par une zone saine. Indiquée pour les plaies profondes collectées ou anfractueuses lorsque les prélèvements par écouvillons ne sont pas contributifs L aspiration à l aiguille fine En l absence d obtention de liquide, 1 à 2 ml de sérum physiologique stérile peuvent être injectés puis réaspirés immédiatement à l aide d une seconde aiguille pour être analysés. La seringue ayant servi au prélèvement est envoyée au laboratoire sans l aiguille, purgée d air et bouchée hermétiquement et stérilement. La Biopsie tissulaire : La sévérité de la neuropathie autorise souvent une biopsie au lit du patient sans préparation particulière. Deux à trois fragments de tissu sont obtenus à partir de plusieurs zones ; immédiatement déposés dans un tube stérile additionné de quelques gouttes de sérum physiologique pour éviter la dessiccation. la biopsie est la méthode à privilégier chaque fois que possible devant toute lésion tissulaire profonde. La biopsie osseuse La biopsie osseuse est le moyen de diagnostic microbiologique le plus fiable en cas d atteinte osseuse Prélèvement de l os par chirurgie ou par ponction percutanée, peut être parfois guidé par l imagerie Passage en peau saine au moyen d'un trocart, après désinfection la plus complète possible pot stérile contenant du sérum physiologique 13
La biopsie osseuse Les hémocultures Aéro Anaérobies La biopsie osseuse est la méthode de référence pour le diagnostic d ostéite : rapide, simple, sans effet secondaire Rarement réalisée en dehors des centres spécialisés Prélèvement par chirurgie ou par ponction percutanée, radio ou écho guidée passage en peau saine au moyen d'un trocart, après désinfection sans anesthésie locale (neuropathie sensitive) pot stérile contenant du sérum physiologique Notamment au cours des bactériémie secondaire à des ostéites Diagnostic microbiologique Méthodes d études Facile si Isolement d une bactérie pathogène Hémocultures positives Lésion cutanée récente: trauma, inoculation, Corps étranger Difficile si Plaie subaigue ou chronique Escarre, ulcères, brûlures Etape du diagnostic conventionnel Examen Microscopique Examen direct après coloration (Gram ) Echantillon biologique gq Examen direct Culture et Identification Antibiogramme J0 J24h J48h Méthode la plus facile, la plus rapide et la moins coûteuse pour établir un diagnostic de présomption. Non spécifique d espèce Manque de sensibilité (>10 4 bacilles/ml) Permet aussi d établir rapidement un diagnostic pour les malades les plus contagieux (tuberculose) 14
Méthodes conventionnelles Culture et Isolement Identification Milieux pour l isolement et la sélection des bactéries Culture d E.coli Culture de Klebsiella pneumoniae Nouvelle approche de protéomique Permet d identifier les bactéries par la comparaison des profils protéiques La spectrométrie devient un outil intéressant en routine de microbiologie clinique Deux raisons essentiellement Bactéries cultivables «entières» Bases de données Exemple de spectres obtenus milieux complexes 15
Méthodes conventionnelles Limite des méthodes phénotypiques Bactérie non cultivable ou de culture difficile Délais parfois importants de la réponse Facteurs de virulence et/ou mécanismes de résistances Tests rapides Immunochromatographique L. pneumophila sérogroupe1 Steptoccocus pneumoniae Clostridium difficile GDH Méthodes moléculaires Amplification par PCR de séquences cibles révélées par diverses techniques Méthodes moléculaires Mise en place à différentes étapes du diagnostic Identifications (rpob, hsp65, 16S) Toxines (LPV, Tox A/B) Gènes de résistance aux antibiotiques Gel Hybridation Séquence Performance Temps technique Cout Méthodes conventionnelles Antibiogramme par diffusion en milieu gélosé Antibiogramme par diffusion en milieu gélosé K. pneumoniae on mesure les inhibitions de la croissance autour des disques d ATB pour classer les bactéries en S/I/R Souche sauvage Souche productrice de Blse 16
Mesure des CMI par E Test Souche productrice de carbapenèmase de type KPC Les bacilles à Gram négatif Les Entérobactéries : Proteus mirabilis, Escherichia coli, Klebsiella sp. fréquemment en cas d infections chroniques ou déjà traitées ou en cas de stade avancé Pseudomonas aeruginosa : après des hospitalisations de longue durée ou des bains de pied, ou un traitement par des pansements humides, le port de chaussures en caoutchouc isolés de plaies punctiformes situées en regard du calcanéum et sont à l origine d ostéites rôle dans les plaies superficielles?? Interprétation des résultats : Principes L interprétation doit tenir compte : des conditions de recueil du prélèvement du délai et des conditions de transport du prélèvement au laboratoire du type de Bactéries isolées : staphylocoques, bacilles à Gram négatif du nombre de prélèvements où la même bactérie est isolée (cas des germes commensaux) Interprétation des résultats : Principes Conclusion Il n existe à ce jour aucun moyen formel permettant de différencier une colonisation d une infection!!! Pas de moyens microbiologiques actuellement pour distinguer pathogène de non pathogène La connaissance Des critères d infection des plaies Des bactéries en cause De leur sensibilité aux antibiotiques est un pré requis nécessaire pour une bonne prescription 17
Conclusion La qualité des prélèvements conditionne l interprétation des résultats Des protocoles doivent donc être établis pour une prise en charge optimale Qui nécessite une coopération multi diciplinaire entre les différents acteurs intervenant dans ces pathologies 18