PHYSIQUE CELLULAIRE Introduction à la Neurobiologie -3- L amont du potentiel d action: «l input» neuronal Jean-Pierre HENRY 18 Mars 2010
Résumé du cours précédent Le potentiel d action est l élément électrique de base: Il est «quantique» Il se propage sans affaiblissement Il est engendré à partir du potentiel de repos par dépolarisation Cette dépolarisation induit une ouverture des canaux Na +, suivie d une ouverture de canaux K +, permettant la régénération du potentiel de repos Ces canaux ont été purifiés et leur structure résolue à l échelle atomique Ils forment la famille des canaux dépendants du potentiel (voltage-dependent), comprenant plus de 140 membres
Comment est «physiologiquement» engendré un potentiel d action? Origine de la modulation du potentiel de repos
Comment est «physiologiquement» engendré un potentiel d action? Il y a modulation du potentiel de repos de l extrémité dendritique (potentiel synaptique) Cette modulation se fait sous l influence d un élément «amont» qui représente «l input» Cet amont peut être la terminaison axonale d un neurone: le neurone amont est présynaptique, l aval postsynaptique Cet amont peut aussi être un organe sensoriel
Les deux types «d input» Input sensoriel Input synaptique
La transmission synaptique La synapse chimique
La synapse chimique La terminaison axonale du neurone amont libère une molécule: neuromédiateur/neurotransmetteur L espace entre les deux neurones (fente synaptique) est petit: 50 nm La molécule se lie à un récepteur sur la membrane du neurone aval (dendrite, corps cellulaire) Le récepteur induit un changement du potentiel de repos: Dépolarisation: synapse excitatrice Hyperpolarisation: synapse inhibitrice
Définition d un neurotransmetteur C est un composé présent dans le neurone pré synaptique et synthétisé par lui Il est libéré au cours de la transmission Appliqué sur le neurone post synaptique à une concentration équivalente, il produit les mêmes effets que la stimulation électrique du neurone pré synaptique Il existe des mécanismes physiologiques permettant de l extraire rapidement de le fente synaptique
Principaux neurotransmetteurs du cerveau des mammifères Neurotransmetteur Acétylcholine (Ach) Dopamine (DA) Noradrénaline (NA) Famille chimique Catécholamine Catécholamine Présence hors du cerveau Jonction neuromusculaire Système sympathique Sérotonine (5-HT) acide γ- aminobutyrique (GABA) glycine Acide glutamique Indolamine Acide aminé Acide aminé Acide aminé Plaquettes Ubiquitaire Ubiquitaire
Neurotransmetteurs et communication cellulaire Certaines molécules ne fonctionnent que comme neurotransmetteurs (Ach) Les acides aminés (Gly et Glu) sont des composants des protéines Certaines monoamines (NA, Adrénaline) fonctionnent comme des hormones: elles sont libérées comme des neurotransmetteurs, mais dans le flux sanguin, et les cellules cibles, portant les mêmes récepteurs sont eloignées
Peptides neuroactifs Pour ces composés, les 4 critères ne sont généralement pas remplis; ils peuvent co-libérés avec les neurotransmetteurs classiques
Les récepteurs ionotropes «Ligand-gated channels»
Le récepteur de l ACh de la jonction neuromusculaire La fibre nerveuse est équivalente à un neurone: elle a un potentiel de repos (- 90 mv) et elle est excitable On stimule le motoneurone et on enregistre la différence de potentiel au niveau de la terminaison synaptique
Potentiel d action dans la fibre musculaire La stimulation du nerf produit dans le muscle une dépolarisation: Excitatory Post Synaptic Potential, EPSP), jusqu à - 20 mv Cette dépolarisation induit un potentiel d action (spike) Le curare inhibe le récepteur et l EPSP n atteint plus le seuil
Nature des conductances ouvertes à une synapse excitatrice On excite le corps cellulaire du neurone amont On mesure le courant entrant dans le neurone cible à potentiel imposé (voltageclamp) On mesure aussi le potentiel à courant imposé (currentclamp)
Nature des conductances ouvertes à une synapse excitatrice Pre: potentiel d action du neurone amont Le neurone est à son potentiel de repos: - 55mV La stimulation produit à - 55 mv un courant entrant (C 2 ) et donc une dépolarisation (C 1 ) La dépolarisation n amène pas la cellule au potentiel d équilibre du Na + 55 mv Le courant est nul à 0 mv Le récepteur est associé avec une conductance cationique, passant Na + et K +
Le canal ionique associé avec le récepteur à l Ach, étude en patch-clamp L étude est faite en conformation cell-attached; la cellule est une cellule musculaire (grenouille) L enregistrement est fait à - 92 mv en présence de 100 nm d ACH On voit un canal osciller entre deux états, ouvert (courant entrant) et fermé La conductance élémentaire est de 30 ps
Dépendance vis à vis du potentiel Le potentiel est varié depuis + 70 mv jusqu à - 70 mv Comme la conductance macroscopique, le courant est nul à 0 mv On peut montrer que Na + et K + ont des perméabilités équivalentes Le canal est imperméable aux anions
Canal unique et conductance macroscopique On soumet la cellule à un pulse bref d Ach (flèches), comme c est le cas dans une stimulation du motoneurone Les différents récepteurs s ouvrent de manière synchrone (canal 1 à 6) Leur fermeture est aléatoire La somme des canaux ouverts reproduit le courant entrant macroscopique
Résumé
Synapse inhibitrice: les récepteurs au GABA et à la glycine Le dispositif expérimental est celui décrit pour la synapse excitatrice Une électrode est introduite dans la cellule amont; elle permet de dépolariser celle-ci et de créer un potentiel d action Dans la cellule cible, on a 2 électrodes et un montage current-clamp Au potentiel de repos (-55 mv), la stimulation hyperpolarise légérement Le potentiel d inversion (-60 mv) est le potentiel de Nernst de Cl - Le ligand (GABA ou glycine) ouvre une conductance Cl -
Comparaison des récepteurs ACh et GABA Le récepteur activé par l ACh (2 µm) de cellule musculaire a son potentiel d inversion à 0 mv Le récepteur activé par le GABA (5 µm) de neurone de l hippocampe de rat s inverse à - 60 mv
Principaux récepteurs ionotropes
Conclusions sur les récepteurs ionotropes Il existe des canaux ioniques activés par des ligands (neurotransmetteurs) comme il existe des canaux ioniques activés par le potentiel Dans le système nerveux central, les principaux neurotransmetteurs excitateurs sont l Ach et surtout le Glutamate Les neurotransmetteurs inhibiteurs sont la glycine et surtout le GABA
Données moléculaires sur les récepteurs ionotropes 1. Le(s) récepteur(s) de l Ach 2. Le(s) récepteur du Glutamate
Un système modèle: l organe électrique de la torpille L organe électrique est équivalent à un muscle; ses cellules (électrocytes) sont empilées et innervées sur une face A la stimulation nerveuse, décharges des cellules en série (50-100 V, 10 A)
Purification du récepteur de l Ach de torpille La purification a été faite à partir de la face innervée de l organe électrique Protéine membranaire difficile à purifiée Test: liaison de l α-bungarotoxine, un peptide du venin de serpents Première purification d un récepteur dans le laboratoire de Jean-Pierre Changeux (1970) Premier clonage Shosaku Numa (1983)
Organisation générale du récepteur AChR Le récepteur est un hétéropentamère (α 2 βγδ) Les sous-unités sont homologues et il existe des homopentamères Chaque sous-unité a 4 segments transmembranaires Il y a 2 sites de liaison de l Ach, entre des sousunités Le canal est au centre (Karlin A (2002) Nature Rev Neurosc,3, 103)
Sélectivité de l AChR La cristallisation 3D et la résolution atomique n ont toujours pas été réussies Des protéines bactériennes voisines ont été cristallisées Les meilleures structures (4 Ä) ont été obtenues par cristallisation 2D et microscopie électronique Dans cette représentation, le rouge indique les charges négatives et le bleu les positives Cette distribution électrostatique explique la sélectivité cationique (Unwin N (2005) J Mol Biol,346, 967)
Mécanisme de l ouverture: le AChR, une protéine allostérique Allostérie: théorie proposée en 1964 par Monod, Wyman et Changeux pour expliquer l action sur une enzyme d une molécule étrangère (ni substrat, ni produit) La protéine est un oligomère Elle existe en différentes conformations Le ligand allostérique I fait passer la protéine d une conformation à une autre
Mécanisme de l ouverture: le AChR, une protéine allostérique Structure modélisée d un AChR homopentamérique 5 sites de liaison identiques entre les parties extracellulaires des sous-unités A- une sous-unité; B-partie extra-cellulaire (2 sousunités); C- protéine entière de face; D- de profil, extérieur en haut (Taly et al (2009) Nature Drug Discov Rev,8, 733)
Mécanisme de l ouverture: le AChR, une protéine allostérique Le AChR est une protéine avec 2 conformations (ouverte et fermée) Les agonistes (Ach, Nicotine) stabilisent la conformation ouverte Les molécules qui stabilisent la conformation fermée (bungarotoxine) sans entrer dans le canal sont des antagonistes Le curare bloque directement le canal
Les récepteurs ionotropes du glutamate Propriétés et structure
Propriétés des GluR Les GluR sont les principaux récepteurs des synapses activatrices du cerveau Activés, ils laissent passer les cations (Na +,K +,Ca 2+ ) Trop de glutamate tue: l excitotoxicité (ischémie cérébrale): une entrée massive de Ca 2+ par les GluR induit une mort cellulaire Le patch-clamp a montré l existence de 3 familles de GluR, chacune caractérisée par sa pharmacologie (ligands non physiologiques ouvrant le canal par liaison au site du Glu) et sa cinétique Les 3 familles comportent plusieurs membres Les GluR sont des tétramères (homo ou hétéro); toutes les sous-unités sont apparentées (gènes différents, mais homologues); environ (5 à 600 acides aminés)
Le «scoop»: structure atomique de GluR (Sobolevsky et al (Dec2009) Nature,462, 745)
Structure GluR: 4 sous-unités identiques Le GluR cristallisé est un homotétramère Chaque sous-unité est composée de 3 domaines Le domaine transmembranaire (TMD) est dans la membrane et son assemblage forme le canal ionique Dans l espace extra-cellulaire se trouve d abord le domaine liant le ligand (glutamate) LBD Puis le domaine amino-terminal (ATD)
La liaison du ligand module l activité du canal Le domaine de liaison du ligand (LBD) comporte une poche (clamshell) accueuillant le ligand En présence du ligand, il y a un changement de conformation qui ouvre le canal (Madden DR, 2002, Nature Rev Neurosc, 3, 91)
L ouverture du canal La protéine est un tétramère; les sous-unités sont assemblées par des interactions au niveau des domaines ATD et LBD La liaison du glutamate sur le domaine LBD est transmise au domaine TM (canal) Protéine allostérique (Jin R et al (2009) EMBO J,28, 1812
Le canal de GluR est semblable à un canal K + On a superposé la structure du canal de GluR (fermé) en bleu sur celle d un canal K + fermé dont a enlevé le filtre de sélectivité (en gris) En a, vue en coupe dans la membrane, en b, vue depuis le milieu extracellulaire, en c, hélices internes
GluR, une organisation originale des sous-unités Les 4 sous-unités sont associées en 2 dimères En a, vue en coupe En b, vue en face au niveau ATD: on a un dimère A-B et un autre C-D En c, au niveau LBD, on a maintenant des dimères A-D et B-C En d, au niveau du canal, symétrie d ordre 4
Transmission du changement de conformation depuis LBD jusqu à TM On voit en coupe 2 domaines LBD et les TM correspondants Les hélices (cylindres) de LBD en violet correspondent à la conformation fermée du canal; en vert, déplacement induit par le glutamate: on tire sur les hélices M 3, ce qui ouvre le canal
Les récepteurs métabotropes La notion de second messager la signalisation
Notions générales Nous n avons pas parlé des récepteurs à certains neurotransmetteurs (monoamines, peptides) Pour la majorité, les récepteurs correspondants ne sont pas associés directement avec des canaux Pendant leur activation (liaison du ligand), ces récepteurs changent de conformation Ce changement est perçu par une protéine intracellulaire (protéine G), qui le transmet à une protéine effectrice Celle-ci va affecter (souvent indirectement) un canal ionique, qui va modifier le potentiel synaptique local
Exemple de cascade de signalisation Le récepteur de la sérotonine est activé par son ligand Il transmet son activation à la protéine G sur la face intérieure de la membrane A son tour, celle-ci active une enzyme, l adénylate cyclase Son produit, l AMP cyclique, active une protéine kinase Cette dernière phosphoryle un canal K + Le canal se ferme et induit une dépolarisation Kinase: enzyme qui introduit un groupe phosphate dans une protéine
Caractérisation biochimique des récepteurs métabotropes et des protéines G (Alberts et al, Molec Biol Cell) Ces récepteurs sont des protéines traversant la membrane 7 fois C est une très grande famille (plus de 700 membres), cible de la majorité des drogues Elle n est pas limitée au système nerveux Les protéines G sont faiblement liées à la membrane Il en existe plusieurs dizaines Elles sont trimériques La sous-unité α lie le GTP ou le GDP
Effet de l activation du récepteur L activation du récepteur entraîne un changement de conformation La protéine G diffuse sur la membrane: sa rencontre avec le récepteur induit un changement de conformation Celui-ci permet la liaison du GTP, qui induit une dissociation des sous-unités la sous-unité α liée au GTP peut activer d autres protéines
Vue plus générale de la signalisation: l horreur de la biologie Un même récepteur peut activer différentes protéines G, qui peuvent avoir des effets différents Il faut arrêter l activation du système: phosphorylation du récepteur, hydrolyse du GTP par la sous-unité α elle-même (Rosenbaum et al (2009) Nature,459, 356)
Nouveaux «scoops»: structures de récepteurs à 7 hélices Structure du récepteur β 1 -adrénergique de dinde Passage de l organisation postulée à la structure 3D atomique Depuis 2007, trois structures ont été décrites qui s ajoutent à la rhodopsine (Warne et al (2008) Nature, 454, 486)
Les changements de conformation liés à l activation Changement de position des hélices trans-membranaires TM 6 et 7 lors de l activation du récepteur β 2 - adrénergique Le ligand est figuré en vert clair; la forme activée est en gris (Bokoch et al (2010) Nature, 463, 108)
Activation «sensorielle» Récepteurs olfactifs Récepteurs visuels
Récepteurs olfactifs Sur les neurones, il y a de multiples récepteurs à 7 hélices Leur activation par un odorant active une protéine G, puis une AMP-cyclase L AMP c formé ouvre un canal cationique L entrée de Na + permet la dépolarisation et le potentiel d action
Récepteur visuel (d après S Picaud, INSERM U592, Institut de la vision) Les récepteurs visuels (bâtonnet et cônes) tapissent le fond de l œil De manière surprenante, les neurones sensoriels sont devant les récepteurs Les récepteurs et les neurones sensoriels forment 3 couches bien identifiables
Organisation des récepteurs Segment externe: disques Segment interne: mitochondries Lys296 Noyau Terminaison synaptique Les récepteurs (bâtonnets) sont photosensibles sur le segment externe: augmentation de la surface, disques La membrane des disques à une protéine majoritaire, la rhodopsine, de la famille des récepteurs à 7 hélices Un pigment, le rétinaldehyde, est lié à la lysine 296
Effet de la lumière sur les récepteurs 2 3 2 3 2 3 1 4 1 4 1 4 5 5 5 6 6 6 7 7 7 8 8 8 9 9 11-cis-retinaldehyde 10 11 12 13 All-trans-retinaldehyde 9 10 10 11 11 12 12 13 13 14 15 CHO 14 All-trans-retinol (vitamin A) 14 15 CH 2 OH 15 CHO Le précurseur du rétinaldéhyde est la vitamine Le rétinaldéhyde est lié par une base de Schiff sur une lysine A l obscurité, il est sous la forme 11-cis A la lumière, il s isomérise en trans Ce changement induit un changement de conformation de la protéine La structure atomique des 2 conformations a été résolue récemment
Surprise: pas de potentiel d action dans les récepteurs L illumination du récepteur ne produit pas un potentiel d action dans les cellules réceptrices Ces cellules sont «dépolarisées» à l obscurité (- 30 mv) A la lumière, elles se polarisent à - 70 mv Ce n est que deux cellules plus loin (neurones ganglionnaires) qu apparaît un potentiel d action Ce potentiel d action transmet l information au cerveau
La cascade de signalisation visuelle La rhodopsine activée active une protéine G, la transducine La sous-unité α, liée au GTP, active une phosphodiestérase qui clive le GMP cyclique Le c GMP est requis par un canal cationique; son hydrolyse ferme le canal Cette fermeture polarise la cellule
Le comportement paradoxal des récepteurs rétiniens A l obscurité, la rhodopsine inactive conduit à une ouverture de canaux Na + et à une libération forte de neurotransmetteur La lumière ferme ces canaux et hyperpolarise la cellule La libération de neurotransmetteur est inhibée
Les récepteurs visuels, un exemple «bizarre» L entrée du signal ne produit pas un signal positif, mais l inhibition d un signal positif C est une solution coûteuse: la dépolarisation à l obscurité tend à diminuer le gradient ionique, d où une dépense énergétique (ATP, oxygène) La transduction visuelle est lente La cascade amplifie énormément le signal: Une rhodopsine activée peut activer plusieurs transducines (protéine G) Une phosphodiestérase hydrolyse de nombreux c GMP
La cascade est un amplificateur Une molécule de rhodopsine absorbe un photon 500 molécules de transducine sont activées 500 molécules de phosphodiestérase sont activées 10 5 molécules de c GMP sont hydrolysées 250 canaux Na + sont fermés 10 6 ions Na + /s ne rentrent pas dans la cellule (d après Alberts, Molec Biol Cell) La membrane s hyperpolarise de 1 mv
Pour terminer: une idée folle A partir d une algue verte, une protéine, «channel rhodopsine-2» a été isolée C est un canal cationique associé avec le cis-rétinal L illumination ouvre le canal Pourquoi ne pas exprimer cette protéine dans les neurones ganglionnaires, capables de potentiel d action?
Expression de channel rhodopsin-2 dans des rétines sans récepteurs La protéine est couplée à la GFP: les cellules vertes expriment ChR2; l expérience est faite sur des rétines de souris sans récepteurs On mesure le courant et le potentiel dans ces cellules, à différentes illuminations Des potentiels d actions sont visibles (fig E) (Bi et al (2006) Neuron, 50, 23)
Message final Les potentiels d actions sont engendrés après une modification du potentiel de repos synaptique Celle-ci peut être produite par une entrée sensorielle ou un neurotransmetteur Les récepteurs aux neurotransmetteurs peuvent ouvrir directement un canal ionique ou être couplés par des seconds messagers Dans ce second cas, le couplage est plus lent, mais il permet des effets beaucoup plus diversifiés Il peut aussi y avoir une amplification importante