REDACTEURS VERIFICATEURS APPROBATEUR DESTINATAIRES Offianan André TOURE Franck REMOUE Participants au projet PALEVALUT Infirmiersenquêteurs, biologistes Date : 19/08/13 Date : 26/08/13 Date : Objet : La procédure définit la confection des gouttes épaisses (GE) et frottis sanguins (FS) et leur lecture, qui permet la détection des infections plasmodiales, évaluer la densité parasitaire et identifier l espèce de Plasmodium. Application : Le document est élaboré pour le personnel chargé de la confection des gouttes épaisses et frottis sanguins et de leur lecture Documents associés : néant Annexes : 2 Historique des modifications : Date Version Nature de la modification 19/08/2013 0 Création de la POS 26/08/2013 1 Correction FR (Bénin) 24/09/2013 2 Validation FR 07/11/2013 3 Fusion avec POS BIO-PREL Contenu 1 Introduction... 2 2 Objectifs... 2 3 Responsabilités... 3 4 Matériels... 3 1
5 Méthodes... 4 5.1 Réalisation des lames... 4 5.2 Coloration... 4 5.3 Lecture des lames GE/FS... 5 5.4 Contrôle de qualité... 6 6 Références... 7 Annexe 1 : Dilution du Giemsa... 8 Annexe 2 : Entretien du microscope... 10 1 Introduction La Microscopie optique conventionnelle est la méthode standard pour la confirmation en laboratoire du diagnostic du paludisme. L'examen attentif par un microscopiste expert de goutte épaisse et d un frottis sanguin bien préparés et bien colorés reste actuellement le gold standard pour détecter et identifier les parasites du paludisme. Dans la plupart des cas, la procédure consiste à prélever un échantillon de sang par piqûre au doigt afin de préparer une goutte épaisse et un frottis sanguin, les colorer (le plus souvent avec du Giemsa) et les examiner à travers un microscope (avec objectif 100x à l huile en immersion) pour rechercher la présence de plasmodiums et évaluer la densité parasitaire. Le frottis sanguin est utilisé pour l identification de l espèce plasmodiale (P. falciparum, P. vivax, P. ovale et / ou P. malariae) et la goutte épaisse pour la détermination de la densité parasitaire (généralement à partir du rapport des parasites par nombre de leucocytes). Une bonne préparation et une bonne coloration sont essentielles pour la microscopie de haute qualité. 2 Objectifs Cette POS décrit le processus de préparation, de coloration et de lecture de la goutte épaisse et du frottis sanguin pour la microscopie du paludisme réalisées dans le cadre du diagnostic du paludisme. 2
3 Responsabilités La goutte épaisse et le frottis sanguin sont réalisés sur le terrain ou en laboratoire par les techniciens et les ingénieurs de laboratoire. Le contrôle de qualité de ces prélèvements est sous la responsabilité des épidémiologistes spécialistes. 4 Matériels Pour la réalisation de lames - Lames givrées propres - Plateau pour le séchage des lames - Crayon - Boîte de rangement pour lames - Ruban adhésif ou élastique Pour la fixation et la coloration - Capsules de tampon pour solution ph 7,2 ou solution mère de tampon - Cylindre mesureur (capacité de 1 000, 100 et 25 ml) - Marqueurs indélébiles - Eau distillée - Bonbonnes d'alcool - Méthanol - Plateau de coloration - Solution de coloration au Giemsa - Séchoir à lames - Boîtes de rangement pour lames (papier tissé/papier normal et élastique pour envelopper les lames colorées) - Minuteur Pour la lecture des lames et le comptage des parasites - Microscope optique (optiques x 40 et x 100 à immersion nécessaires) - Compteur Manuel - Cahier - Lotus - Coffret - Huile à immersion Précautions - Eviter le contact entre goutte épaisse et mouche ou poussière - Ne jamais oublier d identifier la lame - Les lames doivent toujours être propres 3
5 Méthodes 5.1 Réalisation des lames - La procédure de prélèvement est décrite dans la POS BIO-PREL. - Avec la main droite, prendre une lame de verre propre par le bord - Avec la main gauche, presser le doigt piqué pour faire sortir une goutte de sang - Toucher la goutte de sang avec le milieu de la lame - Une deuxième lame placée au contact de la goutte, à environ 45 par rapport à l horizontale, permet un étalage du sang par capillarité. - D un mouvement rectiligne uniforme, le sang est étalé sur la première lame - Le frottis ainsi confectionné est rapidement séché par agitation pour éviter que les hématies soient crénelées - Toujours avec la main gauche, presser le doigt piqué pour faire sortir une troisième goutte de sang sur la moitié libre de la lame portant le frottis - Appliquer le coin de la lame ayant servi pour l étalement du frottis au centre de la goutte. Etendre la goutte en tournant le coin de la lame (environ 30 secondes), jusqu à avoir un diamètre d environ 1 cm. - Si l étalement a l épaisseur requise, il permet de voir à son travers les aiguilles d une montre, mais pas les chiffres. - Le frottis mince séché est ensuite fixé avec du méthanol. La goutte épaisse ne doit pas être fixée au méthanol. - Numéroter la lame en marquant le numéro du patient de même que la date de réalisation et les initiales du patient 5.2 Coloration Précautions - Toujours utiliser une eau de coloration dont le ph est proche de la neutralité (ph entre 7,0 et 7,2) - Filtrer le Giemsa avant son utilisation - Respecter les temps de coloration (30-45 minutes) - Éviter que la pellicule argentée qui est à la surface du colorant ne recouvre la goutte épaisse 4
-Toujours vérifier les réactifs avant de colorer Mode opératoire de la coloration - Après séchage, placer les lames de gouttes épaisses (position verticale) dans le bac à coloration - Remplir le bac de la solution de Giemsa à 6 % jusqu à recouvrir toutes les lames - Laisser 30 à 45 mn -Laver les lames en les plongeant dans de l eau minérale à ph entre 7,0 et 7,2. - Égoutter les lames lavées. - Placer les lames pour séchage sur un râtelier incliné, la face portant le sang coloré est placée au-dessous pour les protéger des poussières de l air. NB : RENOUVELER LE COLORANT APRES 12 HEURES D UTILISATION 5.3 Lecture des lames GE/FS Les lectures se font tous les jours sur le terrain ou au laboratoire en fonction des lames disponibles par deux microscopistes. 1. Utiliser l'objectif 40x, parcourir la GE à la recherche de toute microfilaire qui peut être présente. En même temps, sélectionner une partie de la GE exempt de débris de coloration et riche en globules blancs. 2. Placer une goutte d'huile à immersion sur la goutte épaisse. 3. Pivoter l'objectif x 100 à immersion sur la partie sélectionnée. 4. Vérifiez que la partie de la GE sélectionnée est de bonne qualité et examiner 200 champs microscopiques avant de pouvoir déclarer qu aucune parasitémie, par espèce plasmodiale, n a été détectée. Détermination de la densité parasitaire Le comptage en routine du Nombre de parasites du paludisme est effectué et exprimé en parasites visibles par microlitre de sang (n / µl). Le calcul de la densité parasitaire revient à compter le nombre de parasites et le nombre de leucocytes pour 200 champs microscopiques. 1. Le nombre de parasites et le nombre de leucocytes dans les 200 champs microscopiques sont comptés. 5
2. Comptez toutes les espèces présentes et enregistrez séparément les gamétocytes et les formes asexuées. 3. Le nombre de leucocytes (nombre de leucocytes par µl de sang) sera déterminé par un Analyseur d'hématologie et utilisé dans le calcul de la densité parasitaire ci-dessous (à défaut, considérer une leucocytémie de 8000 leucocytes par µl): 4. (Nombre de parasites comptés / nombre de leucocytes comptés) x (Nombre de leucocytes par µl de sang, déterminé par analyse hématologie) = nombre de parasites par µl de sang 5. Les GE doivent être lues par deux microscopistes indépendants 6. Les deux microscopistes devront au préalable avoir été pré-qualifiés 7. L'écart entre les deux densités parasitaires sera calculé comme suit: Ecart (exprimé en %) = (différence de densité parasitaire entre les deux lectures / moyenne arithmétique des deux densités parasitaires) x 100. 5.4 Contrôle de qualité Le contrôle de la qualité des examens microscopiques suppose de veiller à ce qu on utilise une solution de Giemsa de bonne qualité, à ce que les méthodes de coloration soient conformes aux méthodes reconnues, à ce que les microscopes soient de la qualité voulue et bien entretenus, et à ce que les résultats de l examen microscopique soient fiables. Contrôle de qualité de la solution de Giemsa. Pour veiller à ce qu on obtienne les résultats voulus au niveau de la coloration, on joindra à chaque nouveau lot de solution de travail un frottis dont on sait qu il est positif. Les lames témoins peuvent être préparées à partir du sang d un malade et conservées pour une utilisation future. Préparation des frottis témoins positifs Chez un patient impaludé, effectuer un prélèvement de sang dans un tube à EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique). Le prélèvement de sang idéal montre au moins une plasmodie tous les 2 à 3 champs sur le frottis sanguin. Réaliser autant de frottis que possible, de préférence dans l heure qui suit le prélèvement de sang. Les sécher rapidement à température ambiante à l aide d un ventilateur ou d un sèche-cheveux. Les fixer ensuite dans le méthanol absolu (100%) et les laisser sécher. Les disposer par deux, dos à dos, dans un coffret de lame. Etiqueter la boîte à l extérieur en indiquant l espèce, la date et la mention «lames témoins du Giemsa». Ces lames peuvent être conservées à température ambiante, mais dureront plus longtemps si elles sont conservées à une température égale ou inférieure à 70 C. Juste avant utilisation, retirer la lame de la boîte et laisser la condensation s évaporer ; inscrire sur la lame la 6
date et la mention «témoin +». On peut alors colorer le frottis et l examiner pour vérifier que la solution de travail de Giemsa est de bonne qualité. Contrôle de qualité de l examen microscopique et de la numération Deux techniciens qualifiés examineront indépendamment l ensemble des lames et on calcule ensuite les densités parasitaires en faisant la moyenne des deux numérations. 1. S'il y a un écart (calculé selon la formule décrite ci-dessus) de 20% ou moins, alors la moyenne des deux densités parasitaires sera utilisée comme la densité parasitaire du patient. 2. Si l'écart est supérieur à 20%, les GE doivent être lues à nouveau par les deux microscopistes. 3. Si l'écart des nouvelles densités parasitaires entre les deux microscopistes est 20% ou moins, alors la moyenne des deux densités parasitaires sera utilisée comme la densité parasitaire du patient. Si l'écart entre les deux nouvelles densités parasitaires reste supérieur à 20%, un troisième microscopiste sera sollicité. La densité parasitaire sera calculée en faisant la moyenne des deux numérations les plus proches. 6 Références 1. Basic malaria microscopy. Part 1. Learner's Guide. Geneva, World Health Organization, 1991 (unpublished document LF.Q.AZ.1991pt.1) 2. Peripheral Blood Film Preparation and Staining Standard Operating Procedure. Brisbane, Australian Army Malaria Institute, 2000 (unpublished report). 3. Malaria Screening Standard Operating Procedure. Brisbane, Australian Army Malaria Institute, 2000 (unpublished report). 4. New perspectives: Malaria diagnosis. Geneva, World Health Organization, 2000 (unpublished document WHO/MAL/2000.1091). 5. Basic Malaria Microscopy, Part 1, Learner s Guide, WHO, Geneva, 1991 6. Malaria light microscopy creating a culture of quality. Report of WHO SEARO/WPRO workshop quality assurance for malaria microscopy. Kuala Lumpur, Malaysia 18 21 April 2005 7. Malaria Microscopy Quality Assurance Manual Version1 World Health Organization February 2009 7
8. WHO Basic Malaria Microsocopy, Learners Guide, 2007 (revised edition). 9. Methods Manual For Laboratory Quality Control Testing of Malaria Rapid Diagnostic Tests. Version Five 10. RITM, Parasitology Manual of SOPs, August 2007. 11. Accès universel aux tests diagnostiques du paludisme MANUEL PRATIQUE. OMS 2012 Annexe 1 : Dilution du Giemsa MATERIEL - Eau minérale (ph = 7-7,2) - Eprouvette graduée - Pipette REACTIF -Giemsa RESPONSABILITES La dilution du Giemsa est de la responsabilité des techniciens de laboratoire. PRECAUTIONS - Toujours utiliser une eau de coloration dont le ph est proche de la neutralité (7-7,2) - Filtrer le Giemsa avant son utilisation MODE OPÉRATOIRE La solution de Giemsa doit être diluée à 6% La dilution du Giemsa pur doit se faire avec de l eau minérale dont le ph est compris entre 7,00 et 7,2 Exemple de dilution Pour un volume total de 50ml : 3ml de Giemsa et compléter à 50ml avec de l eau minérale Pour un volume total de 100ml : 6ml de Giemsa et compléter à 100ml avec de l eau Pour un volume total de 250ml : 15ml de Giemsa et compléter à 250ml avec de l eau Pour un volume total de 500ml : 30ml de Giemsa et compléter à 500ml avec de l eau Pour un volume total de 1000ml : 60ml de Giemsa et compléter à 1000ml avec de l eau 8
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Annexe 2 : Entretien du microscope Objectif S assurer que les microscopes sont utilisés correctement et que les procédures de maintenance et de nettoyage sont bien suivies. Responsabilité Tout le personnel du laboratoire Principe du microscope Le microscope est utilisé pour voir des éléments de tailles microscopiques. La méthode d illumination utilise une source lumineuse qui projette une lumière qui est concentrée sur l objet à observer par le condensateur et celui-ci apparaît sur l image de la source lumineuse. La fiabilité du diagnostic du paludisme fonde sur un examen microscopique est tributaire du bon fonctionnement et de l usage correct de l instrument. Le microscope doit être réglé de manière a fonctionner de manière optimale, protégé contre tout dommage, utilisé de manière ergonomique, régulièrement entretenu et, si nécessaire réparé par un personnel qualifié. Matériel - Couverture en plastique - Flacon compte gouttes - Lame porte objet - Papier absorbant - Huile à immersion Procédure d'installation du microscope 1. Placer le microscope sur une paillasse bien stable, exempte de vibrations. En raison des grossissements élevés qui sont utilisés, le moindre mouvement de la paillasse va provoquer un déplacement important de l image observée par l opérateur. 2. Placer le microscope dans une position telle que l opérateur ait toute la place voulue pour ses jambes sous la paillasse. 3. Ne pas disposer le microscope face à une fenêtre très éclairée. Le placer devant un mur ou une fenêtre voilée. Réglage du microscope : 1. Pour un réglage optimal de l optique et l usage général de l instrument, se conformer aux indications données par le fabricant. 10
2. Régler l ouverture du diaphragme à iris à la valeur recommandée par le fabricant pour obtenir la profondeur de champ maximum. Si le fabricant a prévu une échelle de réglage du diaphragme a iris sur le condenseur, régler l ouverture du diaphragme sur celle de l objectif 100x à immersion. Si l on peut enlever les oculaires du microscope, procéder comme suit : - Remonter complètement le condenseur - Régler la lampe sur intensité faible - Mettre en place l objectif 40x - Fermer le diaphragme a iris - Retirer un oculaire - Regarder dans le tube puis régler le condenseur jusqu a ce que le bord du diaphragme soit parfaitement au point sans montrer d anneau périphérique en vert ou en rouge - Ouvrir le diaphragme jusqu à ce que la lumière remplisse complètement l objectif - La partie éclairée a généralement une forme octogonale; - lorsque les sommets de l octogone touchent le contour externe de l objectif, ouvrir le diaphragme jusqu à ce que la partie éclairée prenne une forme circulaire; remettre l oculaire en place. Utilisation du microscope - Allumer le microscope par un bouton ON/OFF ou un bouton rotatif qui permet d augmenter ou de diminuer la lumière - Ouvrir le diaphragme pour laisser passer la lumière - Poser la lame sur la platine du microscope - Déposer une goutte d huile à immersion - Monter le condensateur au maximum (pour avoir plus de lumière) - Placer l objectif X100 à immersion (lecture avec huile à immersion) - Régler les oculaires sur l écart de vos yeux - Avec la vis macroscopique, faire descendre l objectif X100 jusqu à toucher l huile à immersion (surveiller la descente en regardant la lame) - Laisser la vis macroscopique et continuer avec la vis microscopique mais, cette fois ci en regardant dans les oculaires pour régler la netteté de l image - Commencer le comptage - Après examen, abaisser la platine ou de balancer l'objectif de plus faible puissance en position avant d'enlever la lame. Ne jamais retirer la lame lorsque le x 40 x 100 et objectifs sont en position pour ne pas rayer les verres. - Essuyer toute huile à l'aide d'un morceau de gaze de coton non pelucheux libre trempé dans une solution de nettoyage pour lentilles (80/20 solution de l'éther éthylique). Nettoyez avec un tissu de verre. 11
- Eteindre le microscope, se déconnecter de la source d'alimentation et le couvrir pour protéger de la poussière. Entretien et nettoyage du microscope Journalier 1. Suivez toujours les instructions du fabricant avec soin. 2. Nettoyez les lentilles avec du papier optique et non un chiffon ou de papier ordinaire. Utiliser une solution de nettoyage de lentille (80/20 une solution de l'éther éthylique) et ne pas utiliser le xylène, l'alcool ou l'acétone; ceux-ci peuvent dissoudre le ciment de maintien des lentilles. 3. Pour le retrait de forte contamination de la surface de l'instrument, utilisez une solution de savon doux - ne jamais utiliser de l'acétone. 4. A la fin de chaque journée, débranchez la source d'alimentation en éteignant la prise murale et retirer la fiche ou déconnecter les bornes de la batterie. 5. Couvrir l'appareil après utilisation. 6. Pour protéger contre les champignons dans les climats humides, placez le microscope dans une Petite armoire ou un placard qui est chauffée en permanence par le bas par une ampoule à faible consommation. Ne pas stocker le microscope dans son étui ou sous une hotte en plastique dans les climats humides. 7. Protégez le microscope contre les surtensions en utilisant un stabilisateur de tension. 8. Remplacez les ampoules défaillantes, en suivant les instructions du fabricant. 9. Si l'équipement est défectueux, consulter un ingénieur biomédical qualifié. 10. Tous les microscopes dans le laboratoire doivent être prévues pour le nettoyage de routine et check up tous les jours en utilisant le tableau d'entretien quotidien du microscope. Hebdomadaire Nettoyer la surface du microscope, de la platine, et le condensateur avec du linge doux Nettoyer les oculaires et les lentilles avec de l alcool Remplir la fiche d entretien du microscope et signer NB : Ne jamais utiliser du xylène pour l entretien du microscope Dépannage En cas de panne se référer au fournisseur ou au service responsable de l entretien 12