Journée e des doctorants de l IPHCl 12 Février F 2010 Apports de la Spectrométrie trie de Masse pour la Caractérisation risation de Complexes Supramoléculaire Laboratoire de Spectrométrie trie de Masse Bio-Organique (LSMBO) Directeur : Dr Alain VAN DORSSELAER IPHC-DSA Stéphanie PETIOT Daniel AYOUB
LSMBO : équipe et thématiques 2 grandes thématiques : Spectrométrie de Masse et Protéomique (T.Wasselin et N.Barthémély) Spectrométrie de Masse Supramoléculaire La reine Jean-Marc Strub Fabrice Bertile Hélène Diemer Jennifer Jund Danièle Thiersé (électrophorèse) Alain Van Dorsselaer Véronique Trimbour (secrétaire) Les soldats Sébastien Gallien Agnès Hovasse Daniel Ayoub Nicolas Barthelemy Les ouvrières Guillaume Béchade Thierry Wasselin Alayi Tchilabalo Stéphanie Petiot Cédric Atmanene Sarah Sanglier Christine Schaeffer Cyril Colas Fabrice Varrier (informaticien) Vé Jean-Michel Saliou Chrystel Husser (électrophorèse) Christine Carapito Les ouvrières qualifiées S.Petiot, D.Ayoub - SM supramoléculaire - journée doctorants IPHC 12/02/2010
La Spectrométrie trie de Masse, Qu est est-ce que c est c? Technique analytique permettant la détermination de Masses Moléculaires Technique analytique de mesure : du rapport masse sur charge (m/z) de molécules Informations d identité (qualitatif) du rapport m/z de fragments de ces molécules Informations d identité / structure (qualitatif) de l abondance de ces espèces Informations quantitatives S.Petiot, D.Ayoub - SM supramoléculaire - journée doctorants IPHC 12/02/2010
La Spectrométrie trie de Masse, Comment ça a marche? Schéma général d un Spectromètre de Masse Echantillon SOURCE d IONISATION INTERFACE ANALYSEUR Acquisition - traitement du signal Transfert des analytes en phase gazeuse sous forme d ions. Focalisation et transmission des ions (ddp, P) Mesure du rapport m/z
SM moléculaire vs SM supramoléculaire 2 approches distinctes en SM La spectrométrie de masse moléculaire Informations sur les édifices maintenus par des liaisons covalentes La spectrométrie de masse supramoléculaire Informations sur les édifices maintenus par des liaisons non-covalentes solution Milieu dénaturant solution MS Phase gazeuse - Analyse protéomique, - Identification, -PTM, -etc. Conditions natives solution MS Phase gazeuse - Stoechiométrie d interaction, - Spécificité d interaction, - Affinités relatives, - Structure dans l espace -etc.
Instrumentation en SM - source La source d ionisationd Il existe différentes sources En MS supramoléculaire : Analyse de complexes «fragiles» source d ionisation très douce Electrospray (ES) Cône de Taylor Echantillon en solution capillaire métallique (oxydation*) - Electrolyte - - - - - - - - - Interface Interface électrons - électrons Haute tension
Les Spectromètres tres de Masse en SM supramoléculaire Instruments utilisés s au LSMBO
SM supramoléculaire champs d applicationd Analyse par SM de complexes supramoléculaires Ex : Protéine-ligand, protéine-métal, protéine-protéine, protéine-arn, protéine-adn, ARN-ligand, ADN-ligand, Informations obtenues par mesure de la masse : Validation de l existence de complexes non-covalents Stœchiométrie des complexes / états d oligomérisation Spécificité d interaction Affinité Coopérativité Stabilité en phase gazeuse Cinétique de formation des complexes
Stratégies en SM Supramoléculaire - stœchiom chiométrie Détermination de la stœchiométrie d interaction protéine-ligand 1. Analyse du complexe en conditions dénaturantes Milieu dénaturant SM 100 LukS 33099 Da 1488 Da CXXX-8 % mass 500 1500 2500 2. Analyse du complexe en conditions NON dénaturantes 0 LukS: CXXX-8 mass Milieu NON dénaturant SM 100 34586 Da M = 1487 Da 3. Interprétation : Existence et Stœchiométrie du complexe Thèse de C.Atmanene % 0 33099 Da 31000 33000 35000 37000 39000 mass
Stratégies en SM Supramoléculaire - stœchiom chiométrie Détermination de la stœchiométrie d interaction protéine-protéine mcarm1 vc 200v nat 20 um pi 7mbar AcNH4 50 mm ph7 Z48488sp 46 (3.144) Sm (Mn, 2x50.00); Cm (3:52) 100 8443.05 40 TOF MS ES 39.8 A: 354532.22±4.76 B: 32118.64±17.75 C: 179948.55±1.22 A43 8245.73 33 8658.62 33 Oligomère M (Da) Monomère 43066 ± 1 % 6418.59 18 6667.19 22 8049.06 18 8868.12 21 Tétramère 173293 ± 28 Octamère 354546 ± 23 6938.93 15 9117.34 11 5450.33 7 6171.46 8 7221.21 7 7865.72 7 0 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 m/z La protéine est présente sous forme de tétramère et d octamère
Stratégies en SM Supramoléculaire - stœchiom chiométrie Détermination de la stœchiométrie d interaction protéine -ADN gapb 5uM/ccpn 15uM 200 V pi 6 mbar 2vivaspin 2 zeba acnh4 150 mm ph8 Z48245ca 8 (0.546) Sm (Mn, 2x30.00); Cm (1:45) 100 5396.85 60 5079.95 55 TOF MS ES 60.2 A: 86201.37±1.54 B: 86506.39±0.01 C: 135941.36±4.36 % 5757.01 29 2317.37 23 4797.59 18 1180.49 10 2255.88 12 2606.81 13 2481.39 10 3308.33 14 3544.25 12 3628.72 12 5777.70 6474.05 13 6179.71 13 12 6489.59 6194.57 11 11 6797.71 10 0 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 6000 6500 7000 7500 m/z La protéine est présente sous forme de monomère et de dimère. 2 ou 4 protéines peuvent se fixer sur une molécule d ADN
Mobilité ionique et Spectrométrie trie de masse Principe Cellule de mobilité ionique Drift time N 2 Séparation des ions en fonction de leur mobilité ionique Taille, Forme Informations sur la conformation des ions en phase gazeuse 0 Drift time 15 ms
Représentation des données expérimentales IM-MS MS DRIFTSCOPE 4000 Spectre de masse 10 m/z 12 11 2000 8.5 10.6 Mobilogramme 5 10 15 Drift Time (ms) Thèse Cédric Atmanene
Etude des changements conformationnels par IM-MS MS CggR / O LR (3 µm) 30 µm FBP W06166CA.raw W06156CA.raw : 1 Modèle (SAXS) 23 27 27 24 25 26 26 Drift time : Ω 7.5 Drift time (ms) 15 Thèse Cédric Atmanene
A retenir Avantages : Caractérisation d édifices non-covalents de différentes natures de quelques dizaines à plusieurs millions de Da métaux, petites molécules, peptides, protéines, ARN, ADN, Visualisation directe des espèces présentes en solution pas de modélisation des données expérimentales pas de label (ex : fluorescence) idéal pour les systèmes complexes (nombreux partenaires) Information sur les modifications structurales Les conditions à respecter : Conditions expérimentales particulières (tampon, échantillon ionisable) Conditions instrumentales particulières : optimisation Expériences de contrôle
Pour nous contacter Alain VAN DORSSELAER (DR) vandors@unistra.fr Sarah SANGLIER (CR) sarah.cianferani@unistra.fr Daniel AYOUB dayoub@unistra.fr Jean-Michel SALIOU Laboratoire de Spectrométrie de jmsaliou@unistra.fr Masse Bio-Organique (LSMBO) ECPM Bât. R5-0 Stéphanie PETIOT 25, Rue Becquerel stephanie.petiot@etu.unistra.fr 67087 Strasbourg