Bases Fondamentales de l Angiogenèse

Bases Fondamentales de l Angiogenèse Fabrice SONCIN Directeur de Recherche INSERM Institut de Biologie de Lille fabrice.soncin@ibl.fr

Angiogenèse: la mise en place de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants. Phénomène normal, mise en place précoce, perfusion Quasiment tout tissu/organe a besoin d être perfusé pour survivre et se développer

Généralités: Finalité de l angiogenèse: la perfusion des tissus La diffusion de l oxygène est limitée au sein des tissus 100 à 200 µm

Généralités: exemples des conséquences d une mauvaise oxygénation des tissus Ischémie cardiaque Ischémie des membres inférieurs

Généralités: L arbre vasculaire Quasiment tout tissu/organe a besoin d être perfusé pour survivre et se développer Au niveau des organes

Généralités: Formation du réseau vasculaire chez l embryon Émergence des angioblastes dans le mésoderme. A. Territoires présomptifs du mésoderme au cours de la gastrulation chez le poulet. B. Expression de l ARN messager du VEGFR-2 (flèche) au sein du mésoderme extra-embryonnaire dans la gastrula aviaire : l apparition des messagers du récepteur du VEGF précède de quelques heures l émergence des angioblastes dans le mésoderme extra-embryonnaire

Formation du réseau vasculaire chez l embryon cellules endothéliales cellules hématopoïétiques Circulation effective

Formation du réseau vasculaire chez l embryon Remodelage du plexus vasculaire au cours du développement aviaire. A- Chez un embryon de caille de 7 somites, les ébauches des aortes sont repérables (flèches) parmi le réseau vasculaire primitif mis en évidence avec l anticorps monoclonal QH1. B- Un jour et demi plus tard, une circulation fonctionnelle est présente, avec l aorte bien visible (flèche). A: artères; C: cœur; R: réseau vasculaire primitif; TN: tube nerveux; SR: sinus rhomboïdal; V : veines.

Adams et al. Nat Rev Mol Cell Biol 2007

Structure d un gros vaisseau Endothéliales Structure d un vaisseau sanguin. L endothélium ou intima est une monocouche de cellules endothéliales directement en contact avec le sang, cernée par une lame basale (en noir). En périphérie, la paroi du vaisseau ne se compose que de péricytes lorsque son diamètre est petit (A) tandis que, lorsque le diamètre est important (B), elle comprend un anneau de cellules musculaires lisses, la média, et une adventice formée de tissu conjonctif, de fibres de collagène et de fibres élastiques. L adventice abrite le vasa vasorum (en rouge) et les nerfs (en bleu).

Les cellules impliquées: les cellules endothéliales Forme une monocouche à la face luminale des vaisseaux sanguins, des cavités cardiaques et des vaisseaux lymphatiques Au contact de la circulation sanguine Rôle dans la prévention de la thrombose Rôle dans l immunité Rôle dans la tonicité vasculaire Rôle dans l angiogenèse

Rôle dans la prévention de la thrombose Role des endothéliales dans le maintien de la balance thrombose/fibrinolyse. a) Des niveaux faibles de thrombine sont maintenus par l état anti-thrombotique de l endothélium, grâce à la production et la sécrétion de l activateur tissulaire du plasminogène (t-pa), la production de NO, le relarguage de cytokines anti-inflammatoires et la répression de molécules impliquées dans l adhérence des lymphocytes. b) une blessure de l endothélium et son activation entraînent une augmentation des niveaux de facteur tissulaire entraînant la formation de thrombine qui promeut la fibrinogenèse; L endothélium abimé secrète des cytokines et exprime des sélectines qui favorisent la thrombose, l infiltration leucocytaire, l inflammation et la fibrose vasculaire.

Rôle dans l immunité Séquence d événements permettant le recrutement des leukocytes au cours de l inflammation. Les leucocytes sont capturés par roulement (rolling) grâce à leurs récepteurs P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) and E-selectin ligand-1 (ESL-1) reconnus respectivement par les P- et E-sélectines exprimées par les cellules endothéliales. Certains leucocytes tels les lymphocytes ou les cellules souches hématopoïétiques reconnaissent la vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) sur les endothéliales via les intégrines α4. La L-selectine est essentielle pour le rolling des lymphocytes sur les endothéliales des tissus lymphoïdes. Au cours de la progression de l'inflammation, le rolling des leucocytes ralentit, ce qui permet l'intégration des signaux médiés par les ligands des selectines aux G- protein coupled receptors (GPCRs). Ces signaux d'activation entraînent la polarisation des leucocytes et le clustering de L-selectin et PSGL-1 qui vont former des pôles d adhérence favorisant le recrutement d'autres leucocytes par interaction directes leucocytes-leucocytes. L'activation des leucocytes augmente l'affinité des intégrines entrainant une adhérence plus ferme sur intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) exprimée par les endothéliales. Les leucocytes adhérents migrent latéralement sur l'endothélium à la recherche de sites de transmigration. Les leucocytes peuvent migrer classiquement entre les jonctions intercellulaires (paracellulaire) en interagissant aves les protéines de jonction junctional adhesion molecules (JAMs), CD99, platelet/endothelial-cell adhesion molecule-1 (PECAM- 1), endothelial cell selective adhesion molecule (ESAM), ou à travers les cellules endothéliales (transcellulaire). Wagner DD., Frenette PS Blood (2008) 111:11 5271-

Rôle dans la tonicité vasculaire La L-arginine est convertie par la NO-synthase spécifique de l endothélium (enos) en NO, qui diffuse dans les vaisseaux et leur paroi et active la guanylate cyclase soluble (sgc) qui va augmenter la concentration de cgmp et induire la vasodilatation et l inhibition de l agrégation plaquettaire. NO participe aussi à maintenir l endothélium et les plaquettes dans un état non-thrombotique Les souris déficientes en enos ne montrent plus aucune vasodilatation et ont un temps de coagulation réduit NO induit la production de VEGF -> effet proangiogénique dans l ischémie du membre inférieur Evgenov et al. Nature Reviews Drug Discovery (2006) 5, 755 768

Rôle dans l athérosclérose

L identité endothéliale Les cellules endothéliales se distinguent par l expression de plusieurs molécules spécifiquement ou quasispécifiquement exprimées à leur surface: VE-cadhérine, VEGFR-2, CD31/PECAM, enos, ROBO-4, Notch-4, Tie-2, VEGF-R1 (+ macrophages, trophoblaste) Récepteur Protéine C (+ cellules hématopoïétiques) vwf (+ plaquettes et mégacaryocytes) EphrinB2, Nrp-1 : EphB4, Nrp-2 : artères veines CD31/PECAM VE-cadhérine

ECM EC SMC Digestion ECM Prolifération Migration Stimulus angiogénique Hypoxie Recrutement SMC

Occurrences de l angiogenèse Pendant le développement embryonnaire: Mise en place du système cardio-vasculaire Vascularisation des organes Chez l adulte: Physiologique Cycle menstruel (ovaire, utérus) Grossesse: placenta et glande mammaire Réparation tissulaire (cicatrisation) Pathologique Inflammation Formation de vaisseaux collatéraux (cœur, extrémités ) Néo-vascularisation oculaire (rétinopathies, DMLA) Hémangiome Polyarthrite rhumatoïde Croissance tumorale et métastases

Le stimulus angiogénique: l hypoxie Structure des sous-unités HIF. Toutes les sous-unités HIFα et HIFβ présentent une structure semblable organisée en domaines protéiques répertoriés. Elles possèdent un domaine bhlh (basic Helix Loop Helix) et un domaine PAS (Per-Arnt-Sim) situé dans la partie N-terminale. La partie C-terminale contient un ou deux domaines fonctionnels d activation de la transcription, le C-TAD à l extrémité C-terminale et le N-TAD situé en amont du C-TAD. Une séquence de localisation nucléaire (NLS) a été identifiée à l extrémité N- terminale de certaines sous-unités.

Le stimulus angiogénique: l hypoxie L hydroxylation est la clé de la régulation de HIF. Dans des conditions normoxiques (po 2 haute), les prolyl hydroxylases (PHD) et le facteur FIH sont actifs. Ces deux types d enzymes hydroxylent respectivement deux résidus prolines dans le domaine ODDD (oxygen dependent degradation domain) et un résidu asparagine dans le domaine d activation C-TAD de HIFα. L hydroxylation des prolines P 402 et P 564 entraîne la reconnaissance de HIFα par un complexe formé par la protéine VHL (Von Hippel-Lindau) et une E3 ubiquitine ligase. L ubiquitination de HIFa déclenche sa dégradation par le système du protéasome. L hydroxylation de l asparagine N 803 inactive la fonction activatrice de HIFα en empêchant son interaction avec le complexe coactivateur CBP/P300

Le stimulus angiogénique: l hypoxie Hypoxie Induction des gènes cibles de HIFα. Dans des conditions d hypoxie (po 2 basse), les prolyl hydroxylases (PHD) et le facteur inhibiteur (FIH) sont inactifs. La sousunité HIFα stabilisée forme un dimère avec la sous-unité HIFβ et se fixe sur l ADN au niveau d un site HRE (hypoxia responsive element). Le complexe coactivateur (Co-A) CBP/P300 se fixe au niveau du domaine d activation C-terminal de HIFα et active l expression d un grand nombre de gènes cibles impliqués dans de nombreuses fonctions cellulaires

Facteurs impliqués dans l angiogenèse Pro-angiogéniques VEGF afgf bfgf TGF-α, β EGF TNF-α Angiogénine IL-8 Ang-1, 2 PDGF NO PIGF MMPs etc Anti-angiogéniques Thrombospondine Angiostatine Endostatine Vasostatine Prolactine Hormone de croissance Canstatine Tumstatine Interferon-a, β et γ Inhibiteurs de MMPs IL-4, 8, 12 PAI Rétinoides Héparinases etc VEGF; vascular endothelial growth factor, afgf; acidic fibroblast growth factor, bfgf; basic fibroblast growth factor, TGF; transforming growth factor, EGF; epidermal growth factor, TNF; tumour necrosis factor, IL; interleukin, Ang; angiopoietin

Le VEGF VEGF = Vascular Endothelial Growth Factor Médiateur clé de l angiogenèse Secreté par les cellules en hypoxie Stimule la croissance et migration des cellules endothéliales Les souris déficientes pour un seul allèle du VEGF-A meurent à E11-12 par défaut de vasculogenèse et de mise en place des vaisseaux principaux Le VEGF induit une angiogenèse marquée dans toutes les situations où il est surexprimé Son expression est augmentée dans les tumeurs solides et les tissus en angiogenèse Glycoprotéine homodimérique 45 kda Se lie aux VEGF-Rs et à l héparine Existe sous plusieurs isoformes, par épissage VEGF 121 VEGF 145 VEGF 165 (isoforme prédominante) VEGF 183 VEGF 189 VEGF 206

Le stimulus angiogénique: l hypoxie Surexpression du transcrit (b) dans les zones de nécrose (N) Shweiki D. et al Nature (1992) 359:843-845 Présence des cellules endothéliales (vwf) autour des zones de nécrose (N)

Le stimulus angiogénique: l hypoxie Contrôle de l expression du VEGF-A. L expression du VEGF-A est contrôlée à trois niveaux : transcription, stabilité de l ARN messager et traduction : A- La voie de signalisation RAS-MEK-ERK-1/ERK-2 stimule la transcription via la phosphorylation du facteur de transcription SP-1 et de la sous-unité HIF-1α et leur recrutement au niveau du promoteur du gène du VEGF-A où ils s associent avec le facteur AP-1. B - Les ARN messagers (ARNm) du VEGF-A sont stabilisés à la fois par la p38 MAP kinase activée par le stress et par la voie hypoxique. C - La traduction du VEGF-A est contrôlée dans les conditions d hypoxie et d appauvrissement nutritionnel par le biais de séquences IRES (internal ribosome entry site). Dans ces conditions de stress énergétique, la traduction «Capdépendante» est inhibée.

Harper SJ & Bates DO, Nat Rev Canc 2008

Lohela M. et al. Curr Opin Cell Biol 2009

VEGFR-1 (Flt-1, fms-like tyrosine kinase-1) VEGFR-1 a une plus forte affinité pour le VEGF que VEGFR-2 (15 pm vs. 750 pm) Cependant, son activité Tyr-kinase en réponse au VEGF est très faible: pas (peu) d activité mitogène Les souris déficientes en VEGFR-1 meurent à E8.5-9.0, les cellules endothéliales sont présentes en excès et ne s organisent pas en vaisseaux fonctionnels. Les souris déficientes pour la partie intracellulaire du récepteur sont viables et fertiles pour moitié -> rôle dans la séquestration extracellulaire du VEGF? Une forme soluble existe, fortement exprimé par les trophoblastes et endothéliales du placenta, qui joue un rôle dans l établissement de la barrière materno/fœtale Shibuya M. Angiogenesis. (2006) 9:225-230

VEGFR-2 et signalisation Holmes K. et al Cell Signal 2007

Mise en évidence des tip cells. A- Plexus vasculaire d une rétine de souriceau de 5 jours révélé avec un marquage isolectine B4 : les tip cells sont présentes au niveau du front de migration du réseau vasculaire (flèches). B- Détail de tip cells (flèches) montrant les filopodes (têtes de flèche) qui s étendent vers les territoires à vasculariser. C- Chez un embryon de caille dont le réseau endothélial est marqué par QH1, de nombreuses tip cells sont visibles dans le plexus vasculaire primitif avant l apparition du flux (têtes de flèche). D- Les tip cells sont alors beaucoup moins nombreuses (tête de flèche) lorsque le flux est établi.

Phng et al. Dev Cell 16 2009

Phng et al. Dev Cell 16 2009 Tip Stalk

Phng et al. Dev Cell 16 2009 Tip Tip

Rôle de dll4 dans l angiogenèse. A- Détail du réseau vasculaire d une rétine de souriceau de 5 jours montrant l alternance artères (a), veines (v) et la présence de nombreuses tip cells au front de migration du réseau (têtes de flèche). B- Sur cette même région, dll4 (coloration noire) est exprimé spécifiquement au niveau des artères (a) et des tip cells (têtes de flèche) mais est absent des veines (v). C- L invalidation de dll4, chez la souris, induit la fusion démesurée des capillaires et un nombre accru des branchements endothéliaux.

autres acteurs moléculaires Adams et al. Nat Rev Mol Cell Biol 2007

Adams et al. Nat Rev Mol Cell Biol 2007 Parker et al. Nature 2004

Formation de vaisseaux «non-angiogénique»: l intussusception Adams et al. Nat Rev Mol Cell Biol 2007

ECM EC SMC Digestion ECM Prolifération Migration Stimulus angiogénique Recrutement SMC Maturation vasculaire PDGF-BB FGF Ang-1 TGFβ Ang-2 VEGF

day 2 day 4 day 6 day 8 day 10 day 12

Mimétisme vasculaire (vascular mimicry), vaisseaux mosaïques Marquages: CD31/PECAM CD105/Endoglin Chang et al. PNAS 2000

Co-option vasculaire

Participation de l endothélium à l immunité anti-tumorale Séquence d événements permettant le recrutement des leukocytes au cours de l inflammation. Les leucocytes sont capturés par roulement (rolling) grâce à leurs récepteurs P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) and E-selectin ligand-1 (ESL-1) reconnus respectivement par les P- et E-sélectines exprimées par les cellules endothéliales. Certains leucocytes tels les lymphocytes ou les cellules souches hématopoïétiques reconnaissent la vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) sur les endothéliales via les intégrines α4. La L-selectine est essentielle pour le rolling des lymphocytes sur les endothéliales des tissus lymphoïdes. Au cours de la progression de l'inflammation, le rolling des leucocytes ralentit, ce qui permet l'intégration des signaux médiés par les ligands des selectines aux G- protein coupled receptors (GPCRs). Ces signaux d'activation entraînent la polarisation des leucocytes et le clustering de L-selectin et PSGL-1 qui vont former des pôles d adhérence favorisant le recrutement d'autres leucocytes par interaction directes leucocytes-leucocytes. L'activation des leucocytes augmente l'affinité des intégrines entrainant une adhérence plus ferme sur intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) exprimée par les endothéliales. Les leucocytes adhérents migrent latéralement sur l'endothélium à la recherche de sites de transmigration. Les leucocytes peuvent migrer classiquement entre les jonctions intercellulaires (paracellulaire) en interagissant aves les protéines de jonction junctional adhesion molecules (JAMs), CD99, platelet/endothelial-cell adhesion molecule-1 (PECAM- 1), endothelial cell selective adhesion molecule (ESAM), ou à travers les cellules endothéliales (transcellulaire). Wagner DD., Frenette PS Blood (2008) 111:11 5271-

Echappement à l immunité anti-tumorale Endothélium normal, flux laminaire Endothélium tumoral, flux perturbé Castermans K., Griffioen AW BBA (2007) 1776:160-174

800 2 * * Tumor volume, mm 3 600 400 200 Tumor weight, g 1 4T1 Ctrl 4T1 Egfl7 * * * 5 10 15 20 25 Days post-injection Tumor volume, mm 3 800 600 400 200 Tumor weight, g 1.5 1.0 0.5 4T1 Ctrl 4T1 Egfl7 4T1-Egfl7, SCID-Bg 4T1-Ctrl, SCID-Bg 4T1-Egfl7, Balb/c 4T1-Ctrl, Balb/c 5 10 15 20 25 Days post-injection

4T1-Ctrl 4T1-Ctrl ICAM-1/DAPI 4T1-Egfl7 CD3ε 4T1-Egfl7 ICAM-1/DAPI CD3ε

Cible thérapeutique dans la lutte contre le cancer ECM EC SMC Digestion ECM Prolifération Migration Intérêt de cibler l endothélium tumoral: - tissu génétiquement stable (issu de l hôte) - facilement accessible - offrant peu de résistance aux drogues Stimulus angiogénique Recrutement SMC Maturation vasculaire PDGF-BB FGF Ang-1 TGFβ Ang-2 VEGF

Bevacizumab (Avastin Roche) Maturation vasculaire PDGF-BB FGF Ang-1 Cible spécifiquement le VEGF Action anti-angiogénique TGFβ Ang-2 VEGF VEGF 165b AMM pour K colorectal métastatique, (sein métastatique), poumon métastatique, rein métastatique ou non, en combinaison à une chimiothérapie, en monothérapie pour les glioblastomes

Bevacizumab (Avastin Roche) Cancer colorectal métastatique première ligne : impact d un traitement par chimiothérapie associé ou non au bevacizumab (AVF2107). La médiane de survie est de 15,6 mois sous chimiothérapie IFL + placebo et de 20,3 mois sous chimiothérapie IFL associée au bevacizumab. IFL : irinotecan + 5FU + leucovorine.

VEGF-Trap (Aflibercept Regeneron/Sanofi) PDGF-BB FGF Ang-1 Protéine de fusion entre les domaines extracellulaires des VEGFR-1 et VEGFR2 avec la partie Fc d IgG1 Cible le VEGF et le PlGF Action anti-angiogénique TGFβ Ang-2 VEGF? VEGF 165b Approuvé aux USA pour la DMLA

Sorafenib (Nexavar - Bayer Pharma) PDGF-BB FGF Ang-1 TGFβ Ang-2 VEGF Cible VEGF-Rs, PDGF-Rs, raf-kinase, KIT, FLT-3, RET et RAF/MEK/ERK Action anti-angiogénique et anti-maturation vasculaire + anti-tumorale directe AMM pour K rein avancé et hépatocarcinome en monothérapie

Sorafenib (Nexavar - Bayer Pharma) Etude de phase III dans le cancer du rein métastatique comparant le sorafenib à un placebo

Sunitinib (Sutent Pfizer) PDGF-BB FGF Ang-1 Cible PDGFRs, VEGFRs, KIT, FLT3, CSF-1R, RET TGFβ Ang-2 VEGF Action anti-tumorale directe + anti-angiogénique et anti-maturation vasculaire AMM pour le cancer du rein avancé ou métastatique, GIST en monothérapie, tumeur neuroendocrine du pancréas

Sunitinib (Sutent Pfizer) Etude de phase III dans le cancer du rein métastatique comparant le sunitinib à l interféron

Pazopanib (Votrient Glaxo) PDGF-BB FGF Ang-1 Cible PDGFRs, VEGFRs, KIT TGFβ Ang-2 VEGF Action anti-tumorale directe + anti-angiogénique et anti-maturation vasculaire Cancer du rein avancé

VEGFR-targeted antiangiogenic agents currently approved or in phase III trials for the treatment of cancer. Drug name Mechanism of action Indications US FDA-approved for the treatment of cancer Bevacizumab Anti-VEGF-A mab Metastatic CRC, Non-squamous NSCLC, Metastatic BC, Glioblastoma, Metastatic RCC Pazopanib Small molecule multi-tki Advanced RCC Sorafenib Small molecule multi-tki Unresectable HCC, Advanced RCC Sunitinib Small molecule multi-tki Gastrointestinal, stromal tumor after disease progression/intolerance with imatinib, Advanced RCC, Pancreatic neuroendocrine tumor Investigational (Phase III) a AMG 386 Angiopoietin 1/2-neutralizing peptibody Recurrent partially platinum sensitive or resistant, epithelial ovarian, primary peritoneal or fallopian tube cancers Apatinib (AG-013736) Small molecule multi-tki Advanced or metastatic gastric cancer, Metastatic RCC, Advanced pancreatic cancer Axitinib (AG-013736) Small molecule multi-tki Metastatic RCC, Advanced pancreatic cancer BIBF 1120 Small molecule TKI NSCLC, Ovarian cancer Brivanib alaninate (BMS-582664) Small molecule multi-tki Metastatic CRC, HCC Cediranib (AZD2171) Small molecule multi-tki Metastatic CRC, Recurrent glioblastoma, Ovarian cancer, Advanced biliary tract cancers NSCLC, Fallopian tube cancer, Primary peritoneal cavity cancer E7080 Small molecule multi-tki Thyroid cancer Linifanib (ABT-869) Small molecule multi-tki Advanced HCC Motesanib (AMG 706) Small molecule multi-tki NSCLC PI-88 Heparanase inhibitor; may also bind to VEGF HCC Ramucirumab (IMC-1121B) Anti-VEGFR2 mab Gastric cancer and adenocarcinoma, HCC, BC, NSCLC, Metastatic CRC Ranibizumab b Anti-VEGF-A mab Choroidal melanoma Tivozanib (AV-951) Small molecule multi-tki Advanced RCC Vandetanib (AZD6474) Small molecule multi-tki NSCLC, Thyroid cancer Vatalinib (PTK787/ZK222584) Small molecule multi-tki Metastatic CRC BC = breast cancer; CRC = colorectal cancer; HCC = hepatocellular carcinoma; mab = monoclonal antibody; NSCLC = non-small cell lung cancer; RCC = renal cell carcinoma; TKI = tyrosine kinase inhibitor. a All phase III studies are from Clinicaltrials.gov. b Approved by the FDA for the treatment of neovascular (wet), age-related macular degeneration and macular edema follow ing retinal vein occlusion. Canc Treat Rev 2012 38(5):484-93

Wen et al CA Cancer J Clin 2009

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