Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production Samples

GUIDE DE L UTILISATEUR Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production Samples Catalog Number 4428176 (PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit, 300 rxns), 4480466 (PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit, 100 rxns), 4426715 (PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit - Extra Clean with Proteinase K), 4403930 (MicroSEQ Salmonella spp. Detection Kit) Publication Number 4484068 Revision A Réf. attestation (ABI 29/02 09/10) METHODES ALTERNATIVES D ANALYSE POUR L AGROALIMENTAIRE Certifié par AFNOR Certification www.afnor-validation.org Uniquement réservé aux échantillons de production primaire.

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Further information regarding 5 nuclease licensing program and commercial service licenses may be obtained by contacting the Director of Licensing, Life Technologies, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA. TRADEMARKS The trademarks mentioned herein are the property of Life Technologies Corporation and/or its affiliate(s) or their respective owners. NF Validation is a registered trademark of Association Francaise de Normalisation (AFNOR). Stomacher is a registered trademark of Seward Limited, UK. 2013 Life Technologies Corporation. All rights reserved. Translated from English Publication Number 4476867 Rev. A

Sommaire Informations sur le produit....................................... 9 Présentation.......................................................................... 9 Description....................................................................... 9 Utilisateurs visés.................................................................. 9 Durée de vie...................................................................... 9 Spécificité........................................................................ 9 Validation ISO 16140............................................................. 10 Date d expiration................................................................. 10 Conditions de fonctionnement..................................................... 11 Définition de termes.............................................................. 11 Processus........................................................................... 12 CHAPITRE 1 PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit: Salmonella spp................................................. 13 Présentation......................................................................... 13 Matériel et équipement................................................................ 13 Contenu du kit................................................................... 13 Matériel non inclus............................................................... 14 Préenrichissement d échantillons de production primaire.................................. 16 Homogénéisation et enrichissement primaire....................................... 16 Enrichissement secondaire........................................................ 16 Préparation automatique des échantillons à l aide du PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit.... 16 Préparation du matériel du PrepSEQ kit........................................... 16 Préparation des plaques de traitement MagMAX Express-96......................... 18 Traiter les échantillons sur le MagMAX Express-96 Instrument....................... 18 Résolution des problèmes............................................................. 19 CHAPITRE 2 PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K: Salmonella spp.................... 21 Présentation......................................................................... 21 Matériel et équipement................................................................ 21 Contenu du kit................................................................... 21 Matériel non inclus............................................................... 22 Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production Samples 5

Sommaire Préenrichissement d échantillons au stade de production primaire......................... 23 Avant de commencer............................................................. 23 Homogénéisation et enrichissement primaire....................................... 23 Enrichissement secondaire....................................................... 23 Préparation d échantillons à l aide du PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K..................................................................... 23 Résolution des problèmes............................................................. 26 CHAPITRE 3 MicroSEQ Salmonella spp. Detection Kit........... 29 Présentation......................................................................... 29 Matériel et équipement............................................................... 29 Contenu du kit................................................................... 29 Matériel non inclus............................................................... 30 Préparation de la PCR................................................................ 31 Préparation de la PCR............................................................ 31 Préparation des tubes pour le 7500 Fast System, le StepOne System et le StepOnePlus System.......................................................... 34 Exécution des réactions............................................................... 35 Avant de commencer............................................................. 35 Exécution des réactions de 8 tubes sur le 7500 Fast System (uniquement) sans RapidFinder Express Software............................................... 35 Affichage des résultats................................................................ 36 Présentation.................................................................... 36 Procédure générale sans RapidFinder Express Software............................. 36 Ressources d affichage des résultats............................................... 37 Confirmation des résultats........................................................ 37 Résolution des problèmes............................................................. 38 ANNEXE A StepOne et StepOnePlus Systems................. 39 Exécution des réactions de 8 tubes sur le StepOne System................................ 39 Exécution des réactions de 8 tubes sur le StepOnePlus System............................ 40 ANNEXE B Bonnes pratiques en matière de PCR................ 41 Présentation.................................................................... 41 Bonnes pratiques de laboratoire en matière de PCR.................................. 41 Configuration de plaques suggérées............................................... 42 ANNEXE C Sécurité.......................................... 43 Sécurité chimique.................................................................... 44 Manipulation spécifique des produits chimiques..................................... 44 Sécurité en matière de dangers biologiques.............................................. 45 6 Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production Samples

Sommaire Références.................................................... 47 Documentation et support....................................... 49 Obtention d une FDS.................................................................. 49 Obtention de certificats d analyse....................................................... 49 Obtention d assistance................................................................ 49 Support relatif à la sécurité alimentaire................................................. 50 Garantie limitée...................................................................... 50 Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production Samples 7

Sommaire 8 Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production Samples

Informations sur le produit IMPORTANT! Avant d utiliser ce produit, lire les informations décrites dans l annexe «Sécurité» et s assurer de les avoir bien comprises. Présentation Description Utilisateurs visés Durée de vie Spécificité Life Technologies a développé une procédure de préparation d échantillons pour la détection de Salmonella spp. dans des échantillons de production primaire. Cette procédure s articule autour de l enrichissement, la préparation des échantillons et la détection par la PCR en temps réel. Les méthodes de préparation d échantillons suivantes peuvent être employées lors de la détection du Salmonella spp. dans des échantillons de production primaire après enrichissement : Méthode basée sur des billes magnétiques voir «PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit: Salmonella spp.», page 13 Méthode basée sur des colonnes de centrifugation voir «PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K: Salmonella spp.», page 21 Les deux méthodes ont recours à un enrichissement en deux étapes avant l extraction d ADN des échantillons Le MicroSEQ Salmonella spp. Detection Kit est destiné aux microbiologistes qui doivent rechercher la présence de Salmonella spp. dans des échantillons alimentaires et environnementaux. Le MicroSEQ Salmonella spp. Detection Kit n est pas destiné à un usage diagnostic ou thérapeutique chez les animaux ou les hommes. Voir la date de péremption indiquée sur l emballage externe. Le MicroSEQ Salmonella spp. Detection Kit permet la detection de toutes les espèces de Salmonella enterica testées et n a détecté aucune autre espèce. Cette méthode ne permet pas la détection de Salmonella bongori. Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production Samples 9

Informations sur le produit Présentation Validation ISO 16140 Réf. attestation (ABI 29/02 09/10) METHODES ALTERNATIVES D ANALYSE POUR L AGROALIMENTAIRE Certifié par AFNOR Certification www.afnor-validation.org] Le PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit et le PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K font partie de la procédure validée par l AFNOR Certification couvrant l ADN du Salmonella spp. dans les bouillons de cultures d échantillons environnementaux de production primaire fréquemment trouvés. La certification se base sur la norme ISO 16140 pour la validation de méthodes alternatives (Alternative Analytical Methods for Agribusiness. Certifié par NF Certification ; www.afnor-validation.org). Ce kit a été comparé à la méthode de référence ISO 6579 et jugé équivalent. Le protocole validé inclut : Un des protocoles de préparation d échantillon suivants : PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K MicroSEQ Salmonella spp. Detection Kit Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR Instrument RapidFinder Express Software v1.1 Méthode de référence Deux méthodes de référence ont été employées pendant l étude de validation : NF EN ISO 6579:2002/Amd 1:2007 : Microbiologie des aliments. Méthode horizontale pour la recherche des Salmonella spp. Recherche des Salmonella spp. dans les matières fécales des animaux et dans des échantillons environnementaux au stade de la production primaire NF U47-100 : Norme française pour l isolement et l identification du Salmonella spp. dans l environnement et des échantillons de productions animales : «Recherche par l isolement et l identification de tout sérovar ou de sérovar(s) spécifié(s) de salmonelles dans l environnement des productions animales» Matrice Échantillons environnementaux : pédichifonnettes (volaille et porcs), matières fécales (volaille et porcs), litière, eau potable pour animaux et éponges Le PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit et le PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K ont tous deux été certifiés «NF Validation» pour les échantillons environnementaux de production primaire. Remarques générales et recommandations : Respecter les bonnes pratiques de laboratoire (se référer à la norme NF EN ISO 7218) Il est recommandé de suivre les modalités décrites dans les normes ISO 6579 et ISO 6887 pour la préparation de la suspension mère Dans le cadre de la certification NF VALIDATION, les prises d essai supérieures à 25 g n ont pas été testées Date d expiration Pour plus d informations sur la date d expiration de la certification «NF Validation», se reporter au certificat ABI 29/02 09/10, disponible à l adresse www.afnorvalidation.org. 10 Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production Samples

Informations sur le produit Présentation Conditions de fonctionnement Altitude Les systèmes 7500 Fast Real-Time PCR System d Applied Biosystems sont réservés à un usage en intérieur et à des altitudes qui n excèdent pas 2 000 m (6 500 pieds) au-dessus du niveau de la mer. Température et humidité requises Condition Température Humidité Plage acceptable 15 à 30 C (50 à 90 F) Variation maximale inférieure à 15 C (59 F) par 24 heures 20 à 80 % d humidité relative, sans condensation Définition de termes Dans ce protocole, les termes suivants sont utilisés : Amplification : processus de création de copies d une séquence d ADN spécifique, et donc multiplication de cette séquence. Contrôle positif interne (IPC) : contrôle dans tous les puits de réaction qui devrait donner une amplification. S il ne donne pas d amplification, cela signifie qu il y a un problème au niveau de l amplification. La présence d un inhibiteur dans l échantillon inconnu est indiquée si le signal IPC est significativement réduit. Contrôle négatif : mélange réactif qui ne contient pas de séquence cible. Ce contrôle indique une contamination si une amplification se produit ou un problème d amplification si le signal IPC est réduit ou absent. Le Pathogen Detection Negative Control est fourni dans le kit comme contrôle négatif. Un contrôle négatif au moins est requis pour chaque série analytique. Réaction en chaîne à la polymérase (PCR, Polymerase chain reaction) : technologie permettant d amplifier ou de multiplier une séquence d ADN. Contrôle positif : contrôle qui établit l amplification attendue d une cible. L absence d un signal cible dans un puits de contrôle positif indique une erreur de pipetage ou un problème d amplification. Un contrôle positif est fourni par le chercheur et est recommandé, mais n est pas obligatoire pour chaque série analytique. Amorce : segment d ADN complémentaire de la séquence d ADN cible ou de la séquence d ADN IPC. Ce segment est nécessaire pour commencer l amplification. Sonde : segment d ADN complémentaire de la séquence d ADN cible ou de la séquence d ADN IPC. La sonde est couplée à un fluorochrome. Quand la sonde se lie à la cible ou à l IPC pendant l amplification, la fluorescence est émise. Le système Sequence Detection System (SDS) ou Real-Time PCR System détecte la fluorescence, indiquant la présence de la séquence d ADN cible ou IPC. Cible : bactérie dépistée. Échantillon inconnu : échantillon d ADN prélevé sur un produit alimentaire soumis au dépistage de plusieurs agents pathogènes alimentaires. Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production Samples 11

Informations sur le produit Processus Processus Une procédure de préparation d échantillon est illustrée ci-dessous pour la méthode basée sur les billes magnétiques (voir page 13) ainsi que pour la méthode basée sur les colonnes de centrifugation (voir page 21). Diluer l échantillon avec du bouillon TT selon un rapport 1:9. (p. ex. 25 g ou 25 ml d échantillon pour 225 ml de bouillon TT) Incuber les enrichissements à 37 C pendant 16 à 20 heures Diluer l enrichissement selon un rapport 1:9: Transférer 1 ml de bouillon TT enrichie dans 9 ml d'ept Incuber les bouillons à 37 C pendant 4 à 6 heures PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit automatisé sur MagMAX Express-96 PrepSEQ Rapid Spin Extra Clean Kit with Proteinase K Real-time PCR: utiliser MicroSEQ Salmonella spp. Detection kit avec 7500 Fast Instrument 12 Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production Samples

1 PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit: Salmonella spp. IMPORTANT! Avant d utiliser ce produit, lire les informations décrites dans l annexe «Sécurité» et s assurer de les avoir bien comprises. Présentation Le PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit permet de préparer facilement l ADN à partir d échantillons environnementaux de production primaire pour 300 réactions. L utilisation du PrepSEQ Kit avec des échantillons environnementaux de production primaire est validée. La procédure du kit implique les tâches suivantes : Enrichissement de Salmonella spp. ; enrichissement primaire en bouillon de tétrathionate (bouillon TT) suivi d une dilution et d un enrichissement secondaire en eau peptonnée tamponnée (EPT) Extraction automatique des échantillons à l aide du MagMAX Express-96 Magnetic Particle Processor Les échantillons de départ recommandés sont pris en charge : Pédichiffonnettes et éponges : 100 à 150 ml de bouillon TT (veillez à l'immersion complète des échantillons) Écouvillons : 10 ml de bouillon TT Autres échantillons environnementaux (tels que des matières fécales) : Bouillon TT selon un rapport 1:10 ; par exemple, 25 g d échantillon avec 225 ml de bouillon TT Matériel et équipement Contenu du kit Le PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit contient des réactifs pour 300 réactions. Les composants du kit et leurs conditions de conservation sont décrits dans le tableau ci-dessous. Pour plus d informations sur le contenu du kit, se reporter à la section «Matériel fourni» de la notice qui accompagne le kit. PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit ; Cat. nos. 4480466 (100 rxns), 4428176 (300 rxns ) Élément Quantité ou volume Conservation Lysis Buffer Magnetic Particles 2 flacons, 50 ml/flacon 2 tubes, 1,5 ml/tube Température ambiante (23 ± 5 C) 5± 3 C Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production Samples 13

1 Chapitre 1 PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit: Salmonella spp. Matériel et équipement PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit ; Cat. nos. 4480466 (100 rxns), 4428176 (300 rxns ) Élément Quantité ou volume Conservation Binding Solution (Isopropanol) 1 flacon vide Température ambiante (23 ± 5 C) Wash Buffer Concentrate 2 flacons, 26 ml/flacon Température ambiante (23 ± 5 C) Elution Buffer 1 flacon, 25 ml Température ambiante (23 ± 5 C) Proteinase K (PK) Buffer 1 flacon, 50 ml Température ambiante (23 ± 5 C) Proteinase K (20 mg/ml) 1 tube, 1,25 ml En-dessous de -18 C Le kit pour 300 réactions (Cat. no. 4428176) contient 3 fois les quantités et volumes indiqués dans le tableau ci-dessus. Pour plus d informations sur la conservation du contenu du kit, se reporter à la section «Conservation» de la notice qui accompagne le kit. Remarque : Des réactifs peuvent être expédiés séparément, selon des conditions de stockage des différentes parties du kit Matériel non inclus Le tableau suivant indique le matériel et l équipement nécessaires (mais non inclus) pour l utilisation du PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit for Food Testing. Sauf indication contraire, bon nombre des éléments indiqués sont disponibles auprès des principaux fournisseurs de matériel de laboratoire (MLS, Major Laboratory Supplier). Équipement, consommables et réactifs Élément Source Équipement 96-Well Magnetic Ring Stand Life Technologies Cat. no. AM10050 Bloc chauffant ou bain-marie à (37 50 C) Centrifugeuse de plaque MagMAX Express-96 Deep Well Magnetic Particle Processor Homogénéisateur (mélangeur de laboratoire, type Stomacher 400) Mélangeur de type Vortex Eppendorf 5804 ou équivalent Life Technologies Cat. no. 4400079 Seward Cat. no. 0400/001/AJ ou équivalent MLS 14 Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production Samples

Chapitre 1 PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit: Salmonella spp. Matériel et équipement 1 Équipement, consommables et réactifs Élément Source Consommables Gants jetables Embouts de micropipettes, résistants aux aérosols Multipipettes : À piston À air comprimé Multicanal MLS MLS MLS MagMAX Express-96 Deep Well Tip Combs Life Technologies Cat. no. 4388487 MagMAX Express-96 Deep Well Plates Life Technologies Cat. no. 4388476 MagMAX Express-96 Standard Plates Life Technologies Cat. no. 4388475 Sacs à filtre Whirl-Pak, 15,2 cm 22,8 cm (6" 9"), 680 g (24 oz.), 250/pkg (sacs Stomacher avec tamis) Sacs à filtre Whirl-Pak, 15,2 cm 22,8 cm (6" 9"), 680 g (24 oz.), (sacs Stomacher sans tamis) Tubes Microcentrifuge, PCR-Clean, 1,5 ml Tubes stériles, 15 et/ou 50 ml Nasco Cat. no. BO1348WA ou équivalent Nasco Cat. no. BO1297WA ou équivalent MLS MLS Réactifs Bouillon d enrichissement : eau peptonée tamponnée (EPT) Bouillon tétrathionate (TT) Nuclease-Free Water Éthanol à 95 % MLS MLS Life Technologies Cat. no. AM9938 MLS Isopropanol à 100 % Fisher Chemical Cat. no. A464-1 Sigma-Aldrich Cat. no. 190764-1L Ou équivalent Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production Samples 15

1 Chapitre 1 PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit: Salmonella spp. Préenrichissement d échantillons de production primaire Préenrichissement d échantillons de production primaire Homogénéisation et enrichissement primaire 1. Diluer l échantillon avec du bouillon tétrathionate (Bouillon TT) selon un rapport 1:9 dans un sac à filtre de type Stomacher (Nasco WhirlPak Cat. no. B01488WA ou équivalent) ; par exemple, diluer 25 grammes d échantillon avec 225 ml de bouillon TT. 2. Homogénéiser l échantillon dans un mélangeur de laboratoire de type Stomacher 400 (ou équivalent) pendant 1 minute environ à vitesse normale. 3. Incuber l échantillon à 37 ± 1 C pendant 16 à 20 heures. Enrichissement secondaire 1. Diluer l échantillon enrichi avec l eau peptonnée tamponnée (EPT) selon un rapport 1:9 ; Transférer, 1 ml d échantillon dans 9 ml d EPT. 2. Incuber l échantillon à 37 ± 1 C pendant 5 ± 1 heure dans des conditions statiques. 3. Mélanger brièvement l échantillon pour s assurer que les bactéries se trouvent dans la solution ; par exemple, mélanger au vortex pendant 5 secondes environ. 4. Procéder à la préparation des échantillons. Remarque : Conserver les enrichissements EPT pour confirmer les positifs présumés à 5 ± 3 C pendant 72 heures maximum. Préparation automatique des échantillons à l aide du PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit IMPORTANT! Lors de la manipulation des échantillons, respecter les techniques d asepsie appropriées afin d éviter toute contamination croisée. Préparation du matériel du PrepSEQ kit 1. Régler la température du bloc chauffant sur 37 C. 2. Binding Solution (Isopropanol) : Ajouter 35 ml d isopropanol à 100 % dans le flacon Binding Solution vide. Étiqueter le flacon de manière à indiquer que de l isopropanol y a été ajouté. 3. Wash Buffer : Ajouter 74 ml d éthanol à 95 % dans un flacon Wash Buffer Concentrate, bien mélanger, puis étiqueter le flacon de manière à indiquer que de l éthanol y a été ajouté. 4. Magnetic Particles : Incuber le tube Magnetic Particles à 37 ± 1 C pendant 8±2minutes, puis mélanger au vortex pendant 10 secondes environ ; conserver à température ambiante (23 ± 5 C) jusqu au moment de l utilisation. Si, au bout de l incubation initiale, le précipité blanc n est pas complètement dissous, un temps d incubation plus long et des températures supérieures (jusqu à 50 C) peuvent être appliqués en vue de dissoudre le précipité. IMPORTANT! Un précipité blanc peut parfois se former dans le tube Magnetic Particles. Il ressort des expériences en matière d extraction que la formation du précipité n affecte pas les performances du système, à condition que ce précipité soit dissous avant utilisation et que le tube Magnetic Particles soit remis en 16 Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production Samples

Chapitre 1 PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit: Salmonella spp. Préparation automatique des échantillons à l aide du PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit 1 suspension. Avant utilisation, toujours incuber le tube Magnetic Particles à 37±1 C pendant 10 minutes, puis le mélanger au vortex pour le remettre complètement en suspension. Si, au bout de 10 minutes, le précipité blanc n est pas complètement dissous, il est recommandé d appliquer un temps d incubation plus long et des températures supérieures ( 50 C), puis de remélanger au vortex afin de remettre complètement les particules en suspension. Remarque : Les Magnetic Particles sont le réactif limitatif du PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit. S assurer qu il y a suffisamment de Magnetic Particles pour le nombre d échantillons à traiter ; 25 µl de billes magnétiques par échantillon sont requis. 5. Binding Premix Solution : a. Prémélanger 450 µl de PK Buffer avec 325 µl de Binding Buffer et 25 µl de Magnetic Particles par échantillon dans un récipient approprié. Remarque : Lors de la préparation de la Binding Premix Solution pour plusieurs échantillons, multiplier les volumes par le nombre d échantillons (y compris les contrôles) plus 10 % supplémentaires pour la variation des échantillonnages. Remarque : Utiliser la Binding Premix Solution dans l heure qui suit sa préparation. Conserver à température ambiante. b. Bien mélanger au vortex pendant 5 secondes environ jusqu à la fin de la remise en suspension. c. Ajouter 800 µl de Binding Premix Solution dans chaque puits de la Lysis Plate (échantillon). d. Charger la plaque dans l instrument quand le MagMAX Express-96 magnetic particle processor le demande. Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production Samples 17

1 Chapitre 1 PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit: Salmonella spp. Préparation automatique des échantillons à l aide du PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit Préparation des plaques de traitement MagMAX Express-96 1. Préparer les plaques de traitement comme décrit dans le tableau ci-dessous. Ajouter des réactifs aux plaques comme décrit à la section «Action». Plaque Type de plaque MagMAX Express-96 Action Tip Plate Standard Placer un 96-well Deep Well Tip Comb dans une plaque standard MagMAX Express-96. Elution Plate Standard Ajouter 120 µl d Elution Buffer par puits. Wash Plate I Deep well plate (Cat. no. 4388476) Remarque : Pour inclure le contrôle Elution Buffer, aliquoter 120 µl d Elution Buffer dans un puits vide supplémentaire de l Elution Plate. Ajouter 300 µl du Wash Buffer. Wash Plate II Deep well plate Ajouter 300 µl du Wash Buffer. Lysis Plate (échantillon) Deep well plate Ajouter 100 µl d EPT enrichi à la Lysis Plate (échantillon) contenant 800 µl du Binding Premix. Traiter les échantillons sur le MagMAX Express-96 Instrument 1. Sélectionner le programme 4428176DWPrepSEQFA sur le MagMAX Express-96 Magnetic Particle Processor. Appuyer sur Start. 2. Charger les plaques dans le MagMAX Express-96 Instrument selon la mesure indiquée. Vérifier chaque orientation de la plaque {A1 à A1}. Plaque Action Tip Plate Elution Plate Wash Plate II Wash Plate I Lysis Plate (échantillon) Charger la Tip Plate, puis appuyer sur Start. Charger l Elution Plate préparée, puis appuyer sur Start. Charger la Wash Plate II préparée, puis appuyer sur Start. Charger la Wash Plate I préparée, puis appuyer sur Start. Charger la Lysis Plate (échantillon), puis appuyer sur Start. Remarque : Il n y a aucune autre intervention manuelle quand on utilise la procédure automatique, jusqu à la fin de la procédure de purification. 18 Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production Samples

Chapitre 1 PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit: Salmonella spp. Résolution des problèmes 1 3. Quand la préparation des échantillons est terminée, le message «Enjoy your DNA» s affiche à l écran. Retirer l Elution Plate. Remarque : L Elution Plate contient l ADN purifié. Remarque : Retirer et éliminer les plaques utilisées sur le MagMAX Instrument : La Lysis Plate contient du guanidinium et les Wash Plates contiennent de l alcool. Eliminer de manière appropriée (voir «Sécurité chimique», page 44). POINT D'ARRÊT Poursuivre avec l exécution de la MicroSEQ Salmonella spp. real-time PCR (comme indiqué) ou sceller l Elution Plate avec du film adhésif transparent et conserver à 4 C (pendant toute une nuit) ou en dessous de -18 C (pendant une période prolongée). Résolution des problèmes Observation Cause possible Action recommandée L inhibition de la PCR est indiquée par l absence de détection de réaction IPC. Présence de Magnetic Particles sur l Elution Plate. L Elution Plate contient des résidus particulaires qui n ont pas été éliminés complètement de l échantillon alimentaire. Éviter de mettre en suspension les Magnetic Particles lors du prélèvement d extrait d ADN. Facultatif : Faire tourner la plaque à environ 4 000 g pendant 30 secondes pour culotter les Magnetic Particles au fond de la plaque. ou Placer l Elution Plate sur le 96-Well Magnetic Ring Stand (Cat. no. AM10050) lors du prélèvement de l extrait d'adn. Eviter de prélever des résidus lors du prélèvement de l extrait d ADN. Facultatif : Faire tourner la plaque à 4 000 g pendant 30 secondes pour culotter les résidus alimentaires au fond de la plaque. Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production Samples 19

1 Chapitre 1 PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit: Salmonella spp. Résolution des problèmes 20 Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production Samples

2 PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K: Salmonella spp. IMPORTANT! Avant d utiliser ce produit, lire les informations décrites dans l annexe «Sécurité» et s assurer de les avoir bien comprises. Présentation Le PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K permet de préparer facilement l ADN à partir d échantillons environnementaux de production primaire pour 100 réactions. L utilisation du PrepSEQ Kit avec des échantillons environnementaux de production primaire est validée. La procédure du kit implique les tâches suivantes : Enrichissement de Salmonella spp. ; enrichissement primaire en bouillon tétrathionate (bouillon TT) suivi d une dilution et d un enrichissement secondaire en eau peptonnée tamponnée (EPT) Préparation d échantillons à l aide de colonnes de centrifugation Le mode de préparation suivant est recommandé : Pédichiffonnettes et éponges : 100 à 150 ml de bouillon TT (veillez à l immersion complète de l échantillon) Écouvillons : 10 ml de bouillon TT Autres échantillons environnementaux (tels que des matières fécales) : Bouillon TT selon un rapport 1:10 ; par exemple, 25 g d échantillon avec 225 ml de bouillon TT Remarque : Pour la préparation d échantillons à partir d échantillons de production primaire, Applied Biosystems recommande un volume d échantillon de 750 µl (chargé dans la colonne de centrifugation). Matériel et équipement Contenu du kit Le PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K (Cat. no. 4426715) contient des réactifs pour 100 préparations d échantillons. Les composants du kit sont décrits dans le tableau ci-dessous. Pour plus d informations sur le contenu du kit, se reporter à la section «Matériel fourni» de la notice qui accompagne le kit. Élément Quantité ou volume Conservation Colonnes de centrifugation 100 Température ambiante Tubes de microcentrifugeuse, 1,5 ml 2 x 100 (23 ± 3 C) Lysis Buffer, 1 flacon 5 ml 5 ± 3 C Proteinase K (20 mg/ml), 1 tube 1,25 ml En-dessous de -18 C Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production Samples 21

2 Chapitre 2 PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K: Salmonella spp. Matériel et équipement Pour plus d informations sur la conservation du contenu du kit, se reporter à la section «Conservation» de la notice qui accompagne le kit. Remarque : Des éléments peuvent être expédiés séparément, selon la configuration commandée et les conditions de conservation. Matériel non inclus Le tableau suivant indique le matériel et l équipement nécessaires (mais non inclus) pour l utilisation du PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K. Sauf indication contraire, de nombreux composants indiqués sont disponibles auprès des principaux fournisseurs de matériel de laboratoire (MLS, Major Laboratory Supplier). Équipement, consommables et réactifs Élément Source Équipement Bloc chauffant, 97 C MLS Bloc chauffant, 56 C MLS Portoir pour tubes de 1,5 ml MLS Microcentrifugeuse de laboratoire Eppendorf 5415 D ou équivalent Homogénéisateur (mélangeur de laboratoire de type Stomacher 400) Seward Cat. no. 0400/001/AJ ou équivalent Multipipettes : MLS À piston À air comprimé Mélangeur de type Vortex MLS Consommables Gants jetables MLS Embouts de pipette résistant aux aérosols MLS Sacs à filtre Whirl-Pak, 25,5 cm 38 cm, (10" 15"), 2,6 kg (92 oz.) (sacs Stomacher avec tamis) Sacs à filtre Whirl-Pak, 15,2 cm x 22,8 cm (6" 9"), 680 g (24 oz.), 250/pkg (sacs Stomacher avec tamis) Sacs à filtre Whirl-Pak, 15,2 cm 22,8 cm (6" 9"), 680 g (24 oz.) (sacs Stomacher sans tamis) Eau peptonée tamponnée (EPT) Bouillon de tétrathionate (TT) Nuclease-Free Water Réactifs Nasco Cat. no. BO1488WA ou équivalent Nasco Cat. no. BO1348WA ou équivalent Nasco Cat. no. BO1297WA ou équivalent MLS MLS Life Technologies Cat. no. AM9938 22 Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production Samples

Chapitre 2 PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K: Salmonella spp. Préenrichissement d échantillons au stade de production primaire 2 Préenrichissement d échantillons au stade de production primaire Avant de commencer Homogénéisation et enrichissement primaire Préparation des réactifs de préparation d échantillons Régler la température de chauffage d un bloc sur 97 C et celle d un deuxième bloc sur 56 C. Étiqueter les tubes de microcentrifugation de 1,5 ml. Pour le traitement de plusieurs échantillons, nous recommandons de préparer un mélange Proteinase K-Lysis Buffer : prémélanger 5 µl de Proteinase K (20 mg/ml) avec 50 µl de Lysis Buffer pour chaque échantillon (utiliser un récipient propre de taille appropriée pour le mélange). Multiplier les volumes par le nombre d échantillons plus 10 % pour les pertes. Bien mélanger pour disperser la Proteinase K dans le Lysis Buffer. Utiliser immédiatement ou conserver sur glace jusqu au moment de l utilisation. 1. Diluer l échantillon avec du bouillon tétrathionate (Bouillon TT) selon un rapport 1:9 dans un sac à filtre type Stomacher (Nasco WhirlPak Cat. no. B01488WA ou équivalent) ; par exemple, diluer 25 grammes d échantillon avec 225 ml de bouillon TT. 2. Homogénéiser l échantillon dans un mélangeur de laboratoire Stomacher 400 (ou équivalent) pendant 1 minute environ à vitesse normale. 3. Incuber l échantillon à 37 ± 1 C pendant 16 à 20 heures dans des conditions statiques. Enrichissement secondaire 1. Diluer l échantillon enrichi avec l eau peptonnée tamponnée (EPT) selon un rapport 1:9 ; Transférer 1 ml d échantillon dans 9 ml d EPT dans un récipient approprié. 2. Incuber l échantillon à 37 ± 1 C pendant 5 ± 1 heures dans des conditions statiques. 3. Mélanger brièvement l échantillon pour s assurer que les bactéries se trouvent dans la solution ; par exemple, mélanger au vortex pendant 5 secondes environ. 4. Procéder à la préparation des échantillons. Remarque : Conserver les enrichissements EPT pour confirmer les positifs présumés à 5+/- 3 C pendant 72 h maximum. Préparation d échantillons à l aide du PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K IMPORTANT! Lors de la manipulation des échantillons, respecter les techniques d asepsie appropriées afin d éviter toute contamination croisée. 1. Insérer une colonne de centrifugation dans un tube étiqueté. 2. Charger 750 µl d échantillon enrichi dans la colonne de centrifugation et boucher la colonne. Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production Samples 23

2 Chapitre 2 PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K: Salmonella spp. Préparation d échantillons à l aide du PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K 3. Charger le tube avec la colonne de centrifugation dans la microcentrifugeuse. Orienter la charnière du bouchon du tube vers l intérieur du rotor (voir la figure de droite ci-dessous). Sinon, la charnière du bouchon gênera la mise en place du couvercle du rotor. Positionnement incorrect du bouchon du tube Positionnement correct du bouchon du tube 4. Microcentrifuger le tube pendant 3 minutes à 12 000 16 000 g. 5. Retirer le tube de la microcentrifugeuse, puis éliminer la colonne de centrifugation usagée. 6. Aspirer, puis éliminer le surnageant. IMPORTANT! Retirer le surnageant de manière aussi complète que possible, y compris tous les excédents de liquide éventuels sur les côtés du tube. Éliminer les gouttelettes en cerclant l intérieur du tube avec la multipipette et en l enfonçant dans le surnageant en vue de son élimination par aspiration. 7. Ajouter 55 µl du mélange PK Lysis Buffer (50 µl de Lysis Buffer + 5 µl de Proteinase K) par échantillon au culot. Remarque : Voir les instructions de préparation du mélange Proteinase K-Lysis Buffer lors du traitement de plusieurs échantillons dans «Avant de commencer», page 23. IMPORTANT! Conserver le mélange Proteinase K-Lysis Buffer sur glace jusqu au moment de son utilisation. 8. Remettre en suspension en retournant la pipette ou mélanger au vortex jusqu à ce que le culot soit bien dispersé dans le mélange Lysis Buffer. 9. Transférer le mélange Proteinase K-Lysis Buffer contenant le culot bactérien remis en suspension dans un tube propre de 1,5 ml. Le culot doit être bien dispersé dans le Lysis Buffer avant le transfert. IMPORTANT! Le mélange Lysis Buffer doit être transféré dans un tube propre. Pendant le transfert, le résidu gras sera laissé sur les côtés du tube d origine. Éviter tout contact avec cette graisse et transférer uniquement le Lysis Buffer contenant le culot remis en suspension dans un tube propre. 24 Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production Samples

Chapitre 2 PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K: Salmonella spp. Préparation d échantillons à l aide du PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K 2 10. Boucher le tube, puis incuber à 56 ± 1 C pendant 30 minutes environ pour activer la Proteinase K. 11. Incuber à 97 ± 2 C pendant 10 minutes. 12. Laisser l échantillon refroidir pendant 2 minutes approximativement à température ambiante. 13. Microcentrifuger le tube pendant 1 minute à 12 000 16 000 g pour réduire la condensation après l étape de chauffage à 97 ± 2 C. 14. Ajouter 250 µl d eau de qualité PCR sans nucléase. Bien mélanger. IMPORTANT! Utiliser de l eau de qualité PCR-clean (Part no. AM9938). L eau traitée en autoclave ne doit pas être considérée comme de l eau de qualité PCR-clean. 15. Microcentrifuger le tube à 12 000 16 000 g pendant 90 ± 30 secondes afin de réduire toutes les matières particulaires dérivées de la colonne de centrifugation, qui peuvent interférer avec l amplification. L ADN microbien est en phase aqueuse. Remarque : Les échantillons peuvent être conservés à 5 ± 3 C pendant toute une nuit, ou en dessous de -18 C pendant une période prolongée. Avant l exécution de la PCR, les échantillons stockés doivent être centrifugés pendant 1 minute environ à vitesse maximale afin de culotter les matières particulaires dans la colonne. 16. Poursuivre la PCR ou stocker le tube à une température inférieure à -18 C. IMPORTANT! Pour la PCR, ajouter 30 µl de surnageant aux billes lyophylisées. Pour obtenir les instructions détaillées, se reporter au protocole MicroSEQ Salmonella spp. Detection Kit (voir «MicroSEQ Salmonella spp. Detection Kit», page 29). IMPORTANT! En cas d inhibition de la PCR, indiquée par l absence d amplification de la cible ou de l IPC, diluer l échantillon avec de l eau. Nous recommandons l ajout de 5 µl d échantillon et de 25 µl d eau aux billes lyophylisées pour lever l inhibition. Voir «Résolution des problèmes», page 26 pour plus de détails. Real-Time PCR Detection of Salmonella spp. in Primary Production Samples 25