2010 La Chromatographie Liquide haute Performance (HPLC) Salle de TP de Génie Analytique Présentation Théorique de la HPLC TYPE DE DOCUMENT : DT N 5 PAGE : 57 IND.REV/DATE : 2 22/08/2010 ETABLI PAR : Véronique JACOB VERIFIE PAR : V.JACOB APPROUVE PAR : V. JACOB DESTINATAIRES : Utilisateurs du laboratoire de Génie Analytique n 001 V. JACOB IUT de Chimie de Grenoble 22/08/2010
TABLE DES MATIERES 1 Généralités et appareillage... 1 1.1 La phase mobile... 2 1.2 Le réservoir de solvant... 3 1.3 Le système de pompage... 4 1.3.1 Les pompes... 4 1.3.2 Le gradient d élution... 5 1.4 L injecteur... 6 1.5 Les colonnes... 7 1.6 Les détecteurs... 9 1.6.1 Détecteurs par absorption dans l ultraviolet et le visible... 9 1.6.2 Détecteurs spectrofluorimétriques... 13 1.6.3 Détecteurs par réfractométrie différentielle... 16 1.6.4 Détecteurs par conductimétrie... 19 1.6.5 Détecteurs par spectrométrie de masse... 20 2 Les principales chromatographies liquides... 21 2.1 La chromatographie d adsorption... 22 2.2 La chromatographie de partage... 22 2.2.1 les gels de silice greffés... 23 2.2.2 Mécanisme de rétention... 23 2.3 La chromatographie d échange d ions... 26 2.3.1 L échangeur d ions... 26 2.3.2 Mécanisme de séparation... 28 2.3.3 Choix de la phase mobile... 29 2.3.4 Mise en œuvre de la chromatographie ionique... 30 2.4 La chromatographie de paires d ions ou d appariement d ions... 36 2.4.1 Description du système chromatographique... 37 2.4.2 Mécanisme de rétention... 37
2.4.3 Exemples de séparation... 39
1 GENERALITES ET APPAREILLAGE En raison de sa polyvalence et du vaste domaine de ses applications, la chromatographie liquide haute performance (CLHP ou HPLC) est actuellement la plus utilisée de toutes les techniques de séparation. Le champ d application de ce type de chromatographie recouvre une grande partie du domaine de la chromatographie en phase gazeuse auquel s ajoute l analyse : des composés thermosensibles des composés très polaires ainsi que des composés de masses molaires élevées. Un appareil d HPLC comprend différents modules : un réservoir à solvant contenant la phase mobile, un système de pompage permettant d effectuer des élutions graduées, un injecteur, une colonne, un détecteur et un système d acquisition de données. 1 FIGURE 1 : COMPOSITION D UNE CHAINE HPLC Les différents modules sont reliés par des canalisations courtes et de très faible diamètre interne (0,1 mm). Les différentes parties de l appareillage en contact avec la phase mobile sont généralement construites en acier inoxydable type 316 qui présente l avantage de la tenue à la pression et d une bonne résistance à la corrosion chimique. Les canalisations sont soit en acier inoxydable soit en polymère de type PEEK (polyetheretherketone) qui est un polymère souple plus économique que l acier et pouvant résister aux solvants sous des pressions élevées jusqu à 350 bars.
1.1 LA PHASE MOBILE Contrairement à la chromatographie gazeuse où la nature du gaz est peu importante pour la séparation des composés (interaction soluté-phase stationnaire), en HPLC la séparation des composés se fait par des interactions avec la phase stationnaire et avec la phase mobile. Ces interactions sont primordiales Une bonne séparation d un mélange dépendra donc d une bonne adéquation soluté-phase stationnaire-phase mobile. De nombreux solvants sont disponibles, mais seuls quelques uns pourront être utilisés car en chromatographie liquide il existe de nombreuses limitations. compatibilité avec le système de détection : avec des détecteurs par absorption (les plus courants) on utilisera des solvants qui absorberont peu aux longueurs d onde où les solutés absorbent. Pour les détecteurs réfractométriques, il faudra choisir une phase éluante dont l indice de réfraction est différent de ceux des composés de l échantillon à analyser. miscibilité des solvants et solubilité des solutés : si la phase mobile est constituée par plusieurs solvants, ceux-ci doivent être totalement miscibles et les composés à analyser doivent y être solubles. viscosité : La viscosité de la phase mobile a une influence : o o sur la cinétique de transfert de masse : une augmentation de la viscosité diminue les coefficients de diffusion et de transfert de masse des solutés c est-à-dire qu elle diminue le nombre de plateaux théoriques. sur la pression en tête de colonne. La pression d entrée de colonne augmente proportionnellement à la viscosité de la phase éluante. En général, on utilise des solvants dont la viscosité est inférieure à 10-3 Pa s. température d ébullition : Dans la mesure du possible, on évite des solvants trop volatils à la température ambiante car il peut se produire un phénomène de dégazage au niveau du système de détection, ce qui rend la détection impossible. Le solvant passe alors d une pression très élevée (100 200 bars) à la pression atmosphérique. pureté des solvants : La pureté des solvants est indispensable pour la chromatographie liquide pour améliorer le seuil de détection. Par exemple : o o les alcanes sont transparents jusqu à une longueur d onde de 190 nm mais il peuvent contenir des traces d oléfines qui limitent la transparence de la phase éluante à 250 nm. l oxygène dissous augmente la longueur d onde limite de détection, il devra être éliminé. 2
toxicité : de façon générale, les solvants utilisé sont modérément toxiques. Des précautions particulières doivent être prises avec les solvants chlorés et les solvants aromatiques. Choix du solvant : Le choix du solvant se fera en fonction des interactions soluté solvant. En général ces interactions sont dues à des forces de Van der Waals (interactions dipôle-dipôle ou électrostatiques ) et aux liaisons hydrogène qui vont définir les paramètres de solubilité des composés dans la phase mobile. On classe donc les solvants par leur polarité, et la modification de la polarité. Parmi les solvant utilisés on a l hexane (ou les hycdrocarbures saturés (pentane, cyclohexane ) pour les solvants les moins polaires et l eau pour les solvants le plus polaire. Entre les deux, on a toute une série de composés qui peuvent être utilisés. Pour modifier la polarité de la phase mobile, on peut réaliser des mélanges de solvants (à condition que ceux-ci soient miscibles) 1.2 LE RESERVOIR DE SOLVANT Les appareils sont équipés d un ou plusieurs réservoirs en verre ou parfois en acier inoxydable de contenance d environ 1 litre, ce qui permet de réaliser un nombre important d analyses sans interruption. Ces réservoirs sont souvent étanches afin d éviter l évaporation des solvants (et ainsi la modification de la composition du mélange) ou leur contamination. Ils peuvent être équipés de dispositifs de dégazage (barbotage d hélium ou mise sous vide) permettant d éliminer les gaz dissous et en particulier l oxygène. L oxygène est souvent nuisible à l analyse chromatographique : il augmente le risque de dégradation des échantillons et abrège la durée de vie des colonnes car les phases stationnaires sont facilement oxydables. il augmente le risque de formation de bulles gazeuses dans le détecteur ce qui conduit à un bruit de font important et rend l analyse impossible. il diminue le seuil de détection lors d une analyse par spectroscopie d absorption à faible longueur d onde, par fluorimétrie ou par électrochimie. il contribue à la corrosion des pièces en contact avec la phase mobiles. La corrosion augmentant avec la pression, les pistons et les joints des pompes sont souvent en saphir, agate, Téflon ou en alliages spéciaux. Il est donc préférable de dégazer les solvants soit par ultrasons soit par barbotage d hélium soit par filtration avant d introduire les solvants dans leur réservoir. 3
1.3 LE SYSTEME DE POMPAGE 1.3.1 LES POMPES La pompe d un chromatographe a pour rôle d assurer l écoulement de la phase mobile dans la colonne. Ces pompes doivent être très puissantes car la viscosité des solvants et la granulométrie très fine des phases stationnaires entraînent des différences de pression ou des pertes de charges entre le sommet et l extrémité des colonnes qui peuvent parfois être importantes (50 à 100 bars). Les plus usuelles permettent d obtenir des pressions de 420 bars (ou 6000 PSI (1 PSI = 0,07 bar)). Les pompes sont très onéreuses et interviennent pour une très grande part dans le coût élevé des appareils. Il faut noter que les pressions très élevées engendrées par les pompes HPLC ne présentent aucun danger d explosion car les liquides ne sont pas très compressibles. La rupture d une pièce mécanique n entraîne qu une fuite de solvant. La grande majorité des appareils est équipé par des pompes à pistons alternatifs. Leur avantage réside principalement dans : leur petit volume interne, leur pression de sortie élevée (jusqu'à 700 bars), leur adaptabilité à la technique de gradient d élution, la constance de leur débit qui est pratiquement indépendante de la pression dans la colonne et de la viscosité du solvant. Afin d éviter l écoulement pulsé qui est propre au mouvement de va-et-vient du piston (remplissage-expulsion), les constructeurs ont mis au point des pompes à deux pistons qui fonctionnent soit en mode série soit en mode parallèle. En mode série, le piston amont (piston A) refoule une quantité de solvant deux fois plus importante que le piston aval, soit parce que son diamètre est plus important, soit parce que sa course est plus grande. Les deux pistons sont déphasés : lorsque l un aspire, l autre refoule. Dans ce système, pendant que le piston A aspire une quantité d éluant, le piston B refoule la phase mobile dans la colonne. Ensuite, lorsque le piston A refoule l éluant, une partie de ce dernier vient remplir le cylindre du piston B qui règle ainsi le débit nominal et l autre partie est refoulée dans la colonne. Ces montages nécessitent des vannes en amont et en aval de chaque piston. 4
FIGURE 2 : MONTAGE A PISTON DOUBLE En mode parallèle le système de pompage est constitué de deux têtes de pompe fonctionnant en opposition permettant d obtenir un débit de phase liquide sans pulsations. FIGURE 3 : MONTAGE A DEUX TETES DE POMPE (POMPES BINAIRES HAUTE PRESSION) 1.3.2 LE GRADIENT D ELUTION L élution graduée lors de la séparation de mélanges complexes permet, en modifiant la composition de l éluant, d optimiser les facteurs de capacité et de réduire les temps d analyse. Les gradients peuvent être réalisés de deux manières différentes : 5
les solvants sont dosés et mélangés en amont de la pompe en programmant le temps d ouverture de vannes proportionnelles (système basse pression). Ce système nécessite d intercaler un système de dégazage en ligne des solvants (souvent effectué par dépression). les solvants sont dosés et mélangés en aval des pompes (système haute pression). Dans ce dispositif, il est nécessaire d avoir autant de pompes que de solvants. Le gradient est obtenu simplement en modifiant, à débit total constant, le rapport des débits des pompes. FIGURE 4 : POMPES BINAIRES (HAUTE PRESSION) ET QUATERNAIRES (BASSE PRESSION) Parmi les avantages de ces systèmes : le système haute pression donne la possibilité de transformation en deux chromatogrammes après l ajout d un détecteur et d un injecteur. dans le système basse pression, le nombre de pièce mobile est moindre. Ce système donne la possibilité de réaliser des gradients quaternaires. Notons enfin qu un prémélange des solvants avant pompage permet de s affranchir des phénomènes de contraction de volume. 1.4 L INJECTEUR L injection doit se faire en un temps très bref afin de ne pas perturber le régime d écoulement dans la colonne et le détecteur. La difficulté consiste à introduire en tête de colonne un volume d échantillon là ou la pression atteint plusieurs dizaines de bars. On utilise pour cela une vanne haute pression à plusieurs voies (vanne à boucle d injection). Ce type de vannes peut être utilisé soit manuellement soit commandé par un passeur automatiques d échantillons. Le principe de fonctionnement de ces vannes est le suivant : l échantillon est introduit avec une seringue à la pression atmosphérique dans la boucle (position chargement ou load), puis il est mis en communication par rotation de la vanne avec la phase mobile et la colonne (position inject). 6
FIGURE 5 : VANNE D INJECTION HPLC Ce système évite les brusques variations de pression dans l appareil et est d une grande reproductibilité car il y a peu d irrégularité dans les injections étant donné que la quantité introduite est obligatoirement celle du volume de la boucle. Les volumes injectés sont fixés par la capacité de la boucle qui a des volumes variables allant du microlitre au millilitre. 1.5 LES COLONNES Les colonnes d HPLC sont généralement courtes et droites en acier inoxydable 316 capable de résister aux fortes pressions. La plupart des colonnes ont une longueur de 10 à 25 cm et un diamètre de 4 à 5 mm. Ces colonnes sont remplies de phase stationnaire, maintenue entre deux disques poreux situés aux extrémités et dont la taille des particules varie de 5 à 10 µm. Ce type de colonne offre souvent de 40 000 à 60 000 plateaux par mètre. Le débit de la phase mobile ne peut dépasser quelques ml/min. 7
La colonne est souvent précédée par une colonne de garde ou précolonne. Ces colonnes ont pour rôle d'augmenter la durée de vie de la colonne d analyse en retenant tous les composés qui ne sont pas élués. Elle est plus courte (0,4 à 1 cm) et est remplie de la même phase stationnaire. Cette colonne sera changée périodiquement. FIGURE 6 : COLONNE HPLC Depuis peu de temps est apparu sur le marché des microcolonnes de diamètre intérieur de 0,3 mm et de longueur de 5 cm. La taille des particules varie de 3 à 5 µm et les débits atteignent à quelques µl/min. La colonne et l injecteur doivent être adaptés. Ces colonnes ont l avantage : de la rapidité de l analyse, de consommer moins de solvant (les solvants de haute pureté pour l HPLC sont très coûteux), de conduire à une meilleure résolution de l analyse (par suite d une moindre diffusion), de permettre de faire du couplage HPLC/MS. 8
1.6 LES DETECTEURS En HPLC, il n existe pas de détecteurs universels aussi sensibles que ceux utilisés en chromatographie gazeuse mais des détecteurs spécifiques de grande sensibilité. Dès lors, le dispositif utilisé dépend de la nature de l échantillon. le tableau ci-dessous présente quelques détecteurs courants et leurs propriétés. FIGURE 7 : PERFORMANCE DES DETECTEURS POUR HPLC Les détecteurs absorptiométriques dans l ultraviolet ou le visible et le réfractomètre différentiel sont les plus utilisés. 1.6.1 DETECTEURS PAR ABSORPTION DANS L ULTRAVIOLET ET LE VISIBLE Ces détecteurs sont les plus couramment utilisés en HPLC car ils sont peu sensibles aux fluctuations de débit et de température et un grand nombre de solvants ont une bonne transparence dans l UV. 9 FIGURE 8 : LIMITES D UTILISATION DE DIVERS SOLVANTS DANS L ULTRAVIOLET
On mesure en permanence l absorbance de la phase mobile en sortie de la colonne à une ou plusieurs longueurs d onde. Le signal donné par ces détecteurs est proportionnel à la concentration du soluté dans l effluent de la colonne chromatographique. En effet, l absorbance A est liée à la concentration par la relation de Beer Lambert : Avec : ε λ : coefficient d absorption molaire l : trajet optique A = ε λ l C C : concentration du soluté dans l éffluent La sensibilité est d autant plus grande que l est grand, mais il faut dans le même temps que le volume soit aussi faible que possible pour ne pas affecter l efficacité du système chromatographique. Les cellules ont en général un volume de quelques microlitres (5 à 10 µl) et ont un trajet optique de l ordre de 1 cm. FIGURE 9 : CELLULE D UN DETECTEUR UV-VISIBLE 10
La limite de détection dépend : du coefficient d absorption du soluté, de sa concentration dans l effluent lors de la traversée dans la cellule de mesure c est-àdire de la dilution apportée par la colonne, du bruit de fond du détecteur. Avec un bruit de fond de 10-4 UA, un trajet optique de 1 cm et un coefficient d absorption de 10 4 l mol -1 cm -1, le seuil de détection est de : C 210 = moll 10 *1 4 min = 2. 10 8 4 Ceci correspond, en prenant un facteur de dilution f lors de l introduction dans la colonne chromatographique de 25 et en faisant une injection de 5 µl, à une quantité minimale détectable de 2,5 10-12 mole, soit pour une masse molaire de 300 g mol -1, à une quantité détectable de 0,75 ng. Il existe trois types de détecteurs équipant les chromatographes : Les détecteurs monochromatiques : ce type de détecteur est le modèle de base, il se compose d une source au deutérium ou à vapeur de mercure, d un monochromateur pour isoler une bande passante (10 nm) ou une raie (254 nm (vapeur de Hg HP) ou 280 nm (vapeur de Hg MP)), d une cellule de circulation et d un détecteur optique : 1 FIGURE 10 : SCEMA DE PRINCIPE D UN DETECTEUR PHOTOMETRIQUE A UNE SEULE LONGUEUR D ONDE 11
Ce type de détecteur est très limité et est progressivement remplacé par des spectrophotomètres polychromatiques. Les spectrophotomètres polychromatiques : on peut les classer en trois catégories : les spectrophotomètres monochromatiques à longueur d onde variable (190 à 700 nm) les spectrophotomètres multi-longueurs d onde qui permettent soit de changer de longueur d onde au cours de l analyse soit d enregistrer l absorbance à plusieurs longueurs d onde simultanément. Ces détecteurs permettent non seulement d obtenir un chromatogramme mais ils fournissent des renseignements spectraux pouvant servir à l identification des composés. Les spectrophotomètres à barrette de diodes permettant l enregistrement tridimensionnel absorbance-temps-longueur d onde. De ce fait, on dispose à tout moment du spectre UV-Visible de la phase mobile éluée, ce qui est une aide à l identification de solutés inconnus par comparaison des spectres UV des solutés avec ceux des composés purs stockés en bibliothèque. Ce type de détecteur permet de sélectionner la longueur d onde optimale de détection pour chaque soluté. FIGURE 11 : SCEMA DE PRINCIPE D UN DETECTEUR A BARETTE DE DIODES 12
FIGURE 12 : PRESENTATION SOUS FORME TRIDIMENTIONNELLE DU CHROMATOGRAMME 1.6.2 DETECTEURS SPECTROFLUORIMETRIQUES Ce mode de détection a une grande sélectivité et une grande sensibilité. Il exploite les propriétés qu ont certaines molécules en solution d absorber des radiations dans l ultraviolet (passage à un état excité) et de reémettre une fraction de la lumière absorbée donc à une longueur d onde supérieure, l autre fraction étant convertie en énergie interne (conversion interne) : FIGURE 13 : ABSORPTION ET FLUORESCENCE 13
On obtient pour une molécule deux spectres différents : un spectre d absorption (excitation) et un spectre d émission (désexcitation radiative) : La loi fondamentale en fluorimétrie est que l intensité I f du rayonnement émis par fluorescence est proportionnelle pour un volume donné, à l intensité lumineuse absorbée : I f = k I abs = k(i o I t) En remplaçant l intensité transmise I t par son expression donnée par la loi de Beer-Lambert, on peut calculer I f : If = kio(1 10 -lε C ) Si l absorption de la solution est faible (solution diluée) et le trajet optique petit alors 10 -lε C 1 2,3*l ε C et If 2,3*l ε C = a C La réponse de ce type de détecteur est linéaire qu aux faibles concentrations, ce qui justifie l emploi de ce mode de détection pour l analyse de traces où la sensibilité est supérieure à celle de l absorption. En fluorimétrie on effectue une mesure directe de l intensité lumineuse tandis qu en absorption on effectue une mesure relative A = logi o/i t. Ainsi les quantité minimales détectables des composés présentant une forte fluorescence peuvent être de l ordre de quelques femtomoles (10-15 mole) injectées. Le schéma de principe des spectrofluorimètres est le suivant : FIGURE 14 : SCHEMA DE PRINCIPE D UN SPECTROFLUORIMETRE 14
Il existe trois types d appareillage : les spectrofluorimètres munis d un monochromateur à l excitation et d un filtre à l émission, les spectrofluorimètres munis de monochromateurs à l excitation et à l émission, les spectrofluorimètres programmables en longueur d onde dans le temps. Ceci permet d optimiser la sensibilité et la sélectivité. Exemple d analyse d un mélange de seize hydrocarbures polyaromatiques avec programmation des longueurs d onde à l émission et à l excitation : FIGURE 15 : SEPARATION PAR CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE A POLARITE DE PHASE INVERSEE D UN MELANGE D HAP La fluorimétrie est un mode de détection très sensible mais très sélectif car il y a peu de molecules qui sont naturellement fluorescentes. On peut étendre le domaine d application de la spectrofluorimétie grâce aux techniques de dérivatisation pré ou post-colonne qui permettent de modifier les molécules afin de les rendre fluorescentes. En mode pré-colonne : le soluté est modifié avant son injection En mode post-colonne : le réactif est ajouté en continu en sortie de colonne et la réaction se développe dans un réacteur 15
FIGURE 16 : SCHEMA DE PRINCIPE D UN DISPOSITIF DE DERIVATION POST-COLONNE 1.6.3 DETECTEURS PAR REFRACTOMETRIE DIFFERENTIELLE Le principe repose sur les lois de Fresnel de transmission de la lumière dans les milieux transparents dont l indice de réfraction est n. Schématiquement, un faisceau lumineux (mono ou polychromatique) passe à travers une cellule comportant deux compartiments dont l un est rempli avec l éluant seul et l autre avec la phase mobile en sortie de colonne. La différence de l indice entre les deux liquides, qui apparaît lorsqu un composé est mélangé à l éluant se traduit par un déplacement angulaire du rayon réfracté. 16
FIGURE 17 : MODELE DE DETECTEUR REFRACTOMETRIQUE La limite de détection de la réfractométrie n est pas très bonne. Elle dépend à la foi de la nature du soluté et de celle de la phase éluante. La réponse du réfractomètre est donnée par la relation : Avec R1 = Z(n - no) Z : constante caractéristique de l appareil n : indice de réfraction de l effluent n o : indice de réfraction de la phase éluante L indice de l effluent peut être calculé en première approximation par la relation : Avec n i : indice de réfraction du soluté i N = n ip i + n o(1-p i) p i : fraction massique du soluté i dans l effluent Des deux relations précédentes, il s en suit que R 1 = Z p i (n i - n o) Supposons un bruit de fond (R 1/Z) égal à 10-7 et une différence d indice de réfraction entre la phase éluante et l effluent égal à 0,1 unité, la fraction massique minimale détectable est de 17 210 7 pmin= = 210 6soit2ppm 0,1
En considérant un facteur de dilution imposé par la colonne de 25, une injection de 5 µl et une masse volumique de la phase éluante de 0,7 g cm -3, la quantité détectable est de : 2 10-6 *25*5 10-3 * 0,7 = 175 10-9 g soit 175 ng. La limite de détection de la réfractométrie est environ 100 fois plus grande que celle de l absorption Autres inconvénient de cette méthode : Cette mesure est sensible aux variations de température et de pression en raison de la variation de l indice de réfraction en fonction de la densité des solvants. Le réfracromètre devra être thermostaté (0,1 C) ainsi que la colonne. Elle conduit à des pics soit négatifs soit positifs, ce qui implique le réglage de la ligne de base à mi-hauteur du graphe. Les indices de réfraction pouvant varier de plusieurs dixièmes d unité d un solvant à un autre, on ne peut utiliser le réfractomètre en gradient d élution. La principale qualité du réfractomètre est son caractère quasi-universel, sauf dans le cas rare où l indice de réfraction de la phase éluante est identique à celui du soluté. Ce type de détecteur sera utilisé comme un détecteur complémentaire au détecteur à absorption lumineuse lorsque celui-ci ne convient pas. Il est surtout utilisé en chromatographie d exclusion (analyse des distributions de masses moléculaires de polymères) et en chromatographie préparative. FIGURE 18 : INDICES DE REFRACTION DE QUELQUES SOLVANTS 18
1.6.4 DETECTEURS PAR CONDUCTIMETRIE Ce détecteur est limité à la détection des espèces ionisées et est surtout utilisé en chromatographie ionique. Son principe repose sur la mesure, en sortie de colonne, de la conductance de la phase mobile riche en composé ionique. La difficulté dans cette analyse est de reconnaître dans le signal global la part de conduction due aux ions ou substances ioniques faiblement chargées appartenant à l échantillon de celle de l électrolyte contenu dans la phase mobile. La conductance d une solution est donnée par la relation : Avec : G : conductance de la solution µs G = λ i i i z Ci 10 3K λ i : conductivité ionique de l ion i (S cm 2 mol -1 ) C i : concentration de l ion i (mol l -1 ) z i : valeur absolue de la charge de l ion i K : constante de la cellule conductimétrique (cm -1 ) Lors de l élution d un soluté, la variation de la conductance S x- sera donnée par l expression : G = x( λs λe ) [ S 3 10 K x ] Avec λ S : la conductivité ionique de l espèce S x-, λ E : la conductivité ionique de la phase mobile. La réponse du détecteur est proportionnelle à la différence des conductivités ioniques des anions de l échantillon et de l éluant. Une bonne détection implique que : la différence (λ S - λ E) soit aussi grande que possible en valeur absolue. [S x- ] soit le plus grand possible, c est à dire que la dilution apportée par l ensemble du système chromatographique soit faible (ceci est vrai pour tout type de détection). la conductance de l éluant soit très stable. Pour cela, il est nécessaire d avoir une thermorégulation de l ensemble du système, la conductivité des ions variant avec la température (les variations de λ i sont de l ordre de 2% par C). la conductance de l éluant soit très faible pour permettre une forte amplification du signal au passage du soluté. 19
Deux voies ont été développées dans la recherche d une bonne détection : dans la première on dispose, entre la colonne de séparation et la cellule de détection, un dispositif de neutralisation par lequel on élimine les ions de l éluant (suppressed ion chromatography), généralement par réaction acide-base. Si le conducteur ionique du solvant est acide, on ajoute une base. Si c est une base, on ajoute un acide. La détection des ions de l échantillon a lieu dans une phase mobile rendue aussi peu conductrice que possible. dans la deuxième méthode dite sans neutralisation, on utilise comme ion éluant un ion organique volumineux donc peu mobile et par conséquent de faible λ E. La détection s effectue directement à la sortie de la colonne de séparation. 1.6.5 DETECTEURS PAR SPECTROMETRIE DE MASSE Le couplage HPLC/MS est en plein essor et devient un outil puissant d identification et de détection. Cependant deux caractéristiques de HPLC rendent le couplage difficile : 1) les méthodes d ionisation de la spectrophotométrie de masse nécessitent que l échantillon soit vaporisé sous un vide poussé d où une décomposition possible du produit pendant ce processus. En fait l ionisation chimique du soluté par les molécules de solvant protège celui-ci de toute dégradation. Des composés de masse moléculaire aussi élevée que 1500 ont déjà été détectés. 2) la quantité de phase mobile utilisée est beaucoup plus grande que celle pouvant être raisonnablement introduite dans la chambre du spectromètre. 20
2 LES PRINCIPALES CHROMATOGRAPHIES LIQUIDES Les domaines d application de la chromatographie liquide sont représentés sur le graphique ci-dessous. 21 FIGURE 19 : DOMAINES D APPLICATION DE LA CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE La connaissance des masses molaires, des polarités et des caractères ioniques des solutés va orienter le choix de la méthode chromatographique à mettre en œuvre pour réaliser leur séparation. Suivant la polarité et la masse molaire des composés on utilise différents type de chromatographie: Pour les molécules de masses molaires élevées (> à 10 000 g mol -1 ), on utilise généralement une des deux méthodes d exclusion : la perméation de gel pour les espèces non polaires et la filtration de gel pour les composés polaires ou ioniques. Pour les espèces ioniques de faibles masses molaires, on utilisera la chromatographie par échange d ions Pour les petites molécules non ioniques on préférera les analyser par des méthodes de partage. Dans ce cours, nous développerons uniquement la chromatographie d adsorption, de partage et ionique.
2.1 LA CHROMATOGRAPHIE D ADSORPTION La chromatographie d adsorption met en œuvre des phases stationnaires ayant des propriétés adsorbantes, principalement les gels de silice poreuse et les gels d alumine. On parle aussi de chromatographie liquide-solide. La chromatographie liquide d adsorption s applique surtout à la séparation des composés organiques relativement non polaires, insolubles dans l eau et dont les masses molaires sont inférieures à environ 5000 g mol -1. Sur ces phases, les molécules polaires sont souvent adsorbées de façon irréversible. Cette technique est utilisée essentiellement pour fractionner les mélanges de composés présentant des groupements fonctionnels différents et des isomères de position tels que les dérivés du benzène substitués en méta et en para. Étant donnée la faible application de cette technique dans le domaine de l analyse de l eau, cette technique ne sera pas développée dans ce cours. 2.2 LA CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE C est la technique chromatographique la plus utilisée de toutes les méthodes chromatographiques en phase liquide. Elle met en œuvre des phases stationnaires greffées ; La séparation des solutés dépend des différences de solubilité des solutés dans la phase mobile, et des différentes interactions des solutés avec la phase stationnaire (force de Van der Waals, forces électrostatiques). La phase stationnaire est un liquide immobilisé par greffage sur gel de silice. La phase mobile est un liquide dont les interactions avec la phase stationnaire doivent être faibles, ce qui est obtenu lorsque leurs polarités sont différentes. On distinguera donc deux types de chromatographie de partage : la chromatographie de partage classique (ou phase normale) dans laquelle la phase stationnaire est polaire (elle contient par exemple des groupements CN, - NH2) et la phase mobile est apolaire ou peu polaire (hexane pur ou en mélange avec un solvant chloré, ou du méthanol ou de l acétonitrile). la chromatographie de partage à polarité de phase inversée dans lequel la phase stationnaire est apolaire (chaîne alkyle, polystyrène-divinyl benzène) et la phase mobile est polaire (mélanges eau-méthanol, eau-acétonitrile). On considère que 80% des séparations chromatographiques en phase liquide sont effectuées sur des colonnes à phase inverse. 22
23 2.2.1 LES GELS DE SILICE GREFFES Excepté quelques nouvelles phases constituées par des polymères organiques, le gel de silice est le matériau de base des phases stationnaires des colonnes HPLC. Ce matériau doit être exempt de tout ion métallique et les grains doivent être de dimension régulière. Ces gels de silices : sont résistants à la pression (ils résiste à l écrasement sou 1000 bar) ont des surfaces spécifiques de l ordre de 350 m 2 g -1 comportent des groupements silanol (groupement Si-OH) à leur surface à raison de 5 groupements par µm 2 environ, ce qui confère au gel de silice ses propriétés polaires. L utilisation de la silice est limitée par sa solubilité en milieu alcalin (ph > 8). Il faudra donc respecter la condition d un milieu acide lorsqu on utilise des colonnes chromatographiques avec silice. La plupart des silices greffées sont préparées par la réaction d un organochlorosilane avec les groupements silanols à la surface du gel de silice. Cette réaction se fait par hydrolyse dans l acide chlorhydrique dilué et chaud : Si(-)2-OH + Cl-Si(CH3)2R Si(-)2-O-Si(CH3) 2R Où R est un groupement n-octyle (-C8H17, ou RP8), un groupement octadécyle (-C18H37, ou RP18). D autres groupements fonctionnels peuvent être greffés (amines aliphatiques, éthers, nitriles, hydrocarbures aromatiques) pour étendre la gamme de polarité des phases stationnaires. Ces supports chromatographiques sont stables thermiquement et difficilement hydrolysables dans le domaine de ph compris entre 2 et 7. 2.2.2 MECANISME DE RETENTION Chromatographie de partage phase normale (polaire) Dans ce type de chromatographie, la phase stationnaire est polaire et elle peut être schématisée sous la forme : On utilise comme phase mobile : Si(-)3-CH2-CH2-CH2-NH2 soit des solvants apolaires : hexane, heptane, cyclohexane, isooctane, soit des mélanges hexane avec un solvant peu ou polaire (chloroforme, dichlorométhane, tétrahydrofuranne, éthanol, méthanol, acétonitrile).
Sur ce type de phase : les composés apolaires seront élués avant les composés polaires puisqu ils sont plus solubles dans la phase mobile. Si R est un groupement alkyl par exemple : tr R-CH3 < tr R-Cl < tr R-OH pour un soluté donné, la rétention d un soluté (k ou tr) diminuera lorsque la polarité de la phase mobile augmente. en présence d un modificateur dans la phase éluante (mélange de solvants), le facteur de capacité du soluté S (ou son temps de rétention) diminue lorsque la concentration du modificateur polaire P augmente. Cet effet sera d autant plus important que la force éluante du modificateur sera importante : Le tableau ci-dessous rassemble quelques valeurs de force éluante sur silice greffée aminopropyle : Solvant εo Tétrachlorure de carbone 0,067 Acétate d éthyle 0,110 Tétrahydrofuranne 0,115 Dichlorométhane 0,124 Chloroforme 0,130 TABLEAU 1 : FORCE ELUANTE SUR SILICE GREFFEE AMINOPROPYLE 2.2.2.1 CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE PHASE INVERSE (APOLAIRE) En chromatographie de partage phase inverse : la phase stationnaire est apolaire et peut être schématisée sous la forme : - Si(CH3)2-C18H37 la phase mobile est constituée de mélanges eau-méthanol ou eau-acétonitile. Qualitativement, la rétention d un soluté en chromatographie à polarité inverse est d autant plus importante que sa solubilité dans la phase mobile est plus faible, il s ensuit que : les composés polaires seront élués avant les composés apolaires puisqu ils sont plus solubles dans la phase mobile, 24
la rétention est d autant plus importante que la polarité de l éluant est plus grande, c est-à-dire que la proportion en eau sera importante. L addition aux mélanges eau-méthanol ou eau-acétonitrile d un troisième solvant, dit solvant secondaire, modifie la force éluante et la sélectivité de la séparation. Quand les espèces étudiées comportent des groupements acide ou basique, il est nécessaire de contrôler le ph de l éluant. Plus le soluté est ionisé, plus son temps de rétention diminue (forte solubilité en phase aqueuse). Les variations des temps de rétention sont très importantes lorsque le ph varie autour du pka d une espèce : les acides seront chromatographiés à un ph inférieur d au moins 2 unités en se basant sur le pka de l espèce la plus acide. les bases seront chromatographiées à un ph supérieur d au moins 2 unités de ph par rapport au pka de l espèce la plus basique. On ne peut cependant opérer en milieu trop basique (ph > 7) car alors il y a attaque du réseau de la silice. Lorsque l échantillon étudié est composé de solutés de polarité très différentes, on utilisera un gradient d élution eau-méthanol ou eau-acétonitrile. On commencera toujours par une phase mobile très polaire (très riche en eau) pour retenir les solutés sur la phase stationnaire puis on diminuera graduellement la polarité de la phase mobile (augmentation de la proportion de solvant organique) pour accroître la force éluante. Les composés polaires sont élués les premiers. Lorsque les composés sont très polaires, ils peuvent avoir une rétention insuffisante sur les silices alkylées. On utilisera alors des silices greffées amino ou cyano. Dans le cas des solutés ionisables ou ionisés, on préférera souvent utiliser la chromatographie ionique. Remarque sur la pureté des solvants : L eau utilisée doit être rigoureusement exempte de matières organiques. Ces substances peuvent être retenues par la phase stationnaire puis être éluées lorsque la teneur en solvant organique augmente, d où l apparition de pics parasites ou de dérive de la ligne de base. L eau simplement déminéralisée sur résine échangeuse d ions contient souvent des traces de matières organiques provenant du relargage des résines. Elle devra donc être déminéralisée sur REI puis : soit être distillée, soit provenir d appareil de production d eau ultra pure (passage sur diverses résines et charbons actifs). Cette eau doit être stockée exclusivement dans des récipients en verre. 25
2.3 LA CHROMATOGRAPHIE D ECHANGE D IONS La séparation des ions ou de molécules ionisables présents dans un échantillon résulte de leur interaction avec des sites ioniques de la phase stationnaire. La phase stationnaire est un échangeur d ions, c est-à-dire un solide comportant des groupements fonctionnels ionisés, fixes, porteurs de charges positives ou négatives, et des ions mobiles de signe contraire assurent l électroneutralité. Les ions sont retenus au voisinage du groupement fonctionnel par des forces électrostatiques. Lors de l échange, il se crée des équilibres du type : (R - X + )S + A + M (R - A + )S + X + M Où S représente la phase stationnaire et M la phase mobile. Selon les proportions de A + et de X + à l équilibre, on dit que l échangeur a plus d affinité pour l espèce A que pour X ou inversement. La phase mobile est une solution aqueuse contenant un électrolyte (généralement un tampon de ph) contenant l ion présent dans l échangeur. La séparation résulte de la différence d affinité des ions de l échangeur et de la phase mobile pour les groupements fonctionnels. 2.3.1 L ECHANGEUR D IONS Un échangeur d ion est constitué de deux parties : la matrice (ou support) sur laquelle seront greffés les groupements fonctionnels, et les groupements fonctionnels. On distingue : 2.3.1.1 LES GROUPEMENTS FONCTIONNELS les échangeurs de cations pour lesquels les groupements fixes sont chargés négativement. Les plus utilisés sont les groupements du type sulfonate RSO3 -, qui agissent comme des acides forts lorsqu ils sont protonés. L ions H3O + sera l ion échangeable contre un autre cation : 2 RSO3H + Ca 2+ (RSO3)2Ca + 2 H + Ces échangeurs sont susceptibles de fixer tous les cations et de les échanger avec des protons. les échangeurs d anions dont les groupements fixes sont chargés positivement. Ce sont généralement des ions ammonium quaternaire du type triméthyl ammonium : N(CH3)3 + qui agissent comme des bases fortes lorsqu ils sont sous forme OH et l ion OH - sera l ion échangeable contre un autre anion : 26 R N(CH3)3OH + Cl - R N(CH3)3Cl + OH -
Ces échangeurs sont susceptibles de fixer tous les anions et de les échanger avec des ions OH -. Il existe également des échangeurs d ions dont les groupements ont le caractère d acides ou de bases faibles (R-COOH ou R-NR2). La capacité d échange des échangeurs d ions faibles dépend du degré d ionisation des groupements fonctionnels donc du ph de la phase éluante : les groupements carboxyliques ne pourront échanger que les cations liés aux anions d acides faibles (HCO3 -, SiO3 - ). les échangeurs faiblement basiques fixent uniquement les anions liés aux anions d acides forts tels que Cl -, SO4 2- et NO3 -. FIGURE 20 : CLASSIFICATION DES GROUPEMENTS FONCTIONNELS DES ECHANGEURS D IONS 2.3.1.2 LA MATRICE La matrice est constituée par un réseau tridimensionnel macromoléculaire, le plus souvent un copolymère styrène-divinylbenzène sur lequel sont greffés les groupements fonctionnels. Elle se présente sous forme de petites sphères d un diamètre de quelques micromètres qui sont généralement d une très grande dureté pour résister à l écrasement dans la colonne. 27
FIGURE 21 : PHASE STATIONNAIRE EN CI. SCHEMA D UNE PARTICULE SPHERIQUE DE POLYSTYRENE A USAGE D ECHANGE DE CATIONS La structure du polymère détermine les propriétés mécaniques du support et la facilité d accès des différentes espèces aux sites échangeurs. Cette structure conditionne donc à la fois la sélectivité de la résine et la cinétique d échange. La sélectivité et la résistance à la pression augmentent avec la réticulation du polymère mais la cinétique diminue du fait de l accroissement de la résistance au transfert de masse, diminue. Il faut trouver un compromis entre les deux. En présence d eau, ces résines gonflent c est-à-dire que les molécules d eau pénètrent à l intérieur des grains et solvatent les groupements fonctionnels provoquant leur ionisation et leur dissociation en un ion fixe (RSO3 - par exemple) et un ion libre échangeable (H3O + par exemple). 2.3.2 MECANISME DE SEPARATION Le mécanisme principal observé sur les phases stationnaires est un mécanisme d échange d ions. Dans certains cas, on peut observer un mécanisme de partage d espèces non ionisées entre la phase stationnaire et la phase mobile (grosses molécules organiques ionisées). Il s établit sur la colonne une suite d équilibres réversibles régis par la constante K d équilibre ionique (loi d action de masse) : AS - + E - M A - M + E - S Cet équilibre est caractérisé par la constante d échange (sélectivité) [ E KA et KE sont les coefficients de partage α ] [ A ] S M = [ E ] M [ A ] S = K K E A Dans ce cas, les différences d affinité dépendent essentiellement des caractéristiques physiques des ions solvatés. En général, l échangeur d ions marque une préférence pour : 28
les ions porteurs de la charge la plus grande (charge), les ions de plus petites dimensions (ions solvaltés) (dimension), les ions de plus forte polarisabilité (polarisabilité). Ainsi pour un échangeur d anions de type ammonium quaternaire, l ordre d affinité sera le suivant : Citrate > SO4 2- > oxalate > I - > NO3 - > Br - > SCN - > Cl - > formiate > acétate > OH - > F - Pour un échangeur de cations de type sulfonate, l odre d affinité est : Ba 2+ > Pb 2+ > Sr 2+ > Ca 2+ > Ni 2+ > Cd 2+ > Cu 2+ > Co 2+ > Zn 2+ > Mg 2+ > Ag + > Cs + > Rb + > K + > NH4 + > Na + > H + > Li + Cet ordre est important car il définit en partie la force éluante des phases mobiles utilisées. Par exemple, dans le cas d échange d anions, l utilisation de l ion nitrate dans la phase éluante conduira à une élution beaucoup plus rapide que l utilisation de l ion chlorure. De même pour un échangeur de cations, une solution d un tampon de ph préparée à partir de sel de potassium aura une force éluante plus élevée que la même solution préparée à partir de sel de sodium ou a fortiori de lithium. 2.3.3 CHOIX DE LA PHASE MOBILE On utilise souvent une solution aqueuse en raison du caractère ionisant et dissociant de l eau. Parfois, l addition de solvants organiques tels que l éthanol ou le méthanol permet simultanément d accroître la solubilité de certains composés et la sélectivité de la résine. Ce dernier effet est généralement dû a une modification du partage des espèces entre les deux phases. La rétention des espèces est régie à la fois par la concentration des ions dans la solution (déplacement de l équilibre d échange) et par le ph de celle-ci (ionisation des espèces à séparer). On utilise généralement des solutions tampons de ph. Trois facteurs déterminent le choix de la phase mobile : 2.3.3.1 LA VALEUR DU PH C est le facteur le plus important qu il faut optimiser en premier puisqu il régit la sélectivité. En effet un accroissement du taux d ionisation conduit à une rétention plus importante des espèces. Le degré d ionisation sera défini par la valeur du pka des espèces acido-basiques. 29
Il est difficile d établir une règle quant au choix du ph. Souvent on opère à un ph voisin du pka des espèces à séparer, légèrement supérieur pour les composés basiques et légèrement inférieur pour les composés acides. Certains préconisent un écart de 1 à 2 unités de ph par rapport au pka, ce qui permet d obtenir une variation rapide des caractéristiques de rétention par changement du ph dans la mesure où la fraction ionisée initiale est faible. 2.3.3.2 LA FORCE IONIQUE Une augmentation de la force ionique, par accroissement de la concentration en tampon ou l addition d un électrolyte est comparable à une augmentation de la force éluante du solvan. Eelle entraîne une diminution de la rétention. 2.3.3.3 LA NATURE DE L ION DEVELOPPEUR La rétention des espèces dépend de la nature de l ion développeur. Plus la résine a d affinité pour celui-ci plus faible est la rétention. Les composés les plus souvent utilisés pour préparer les solutions tampons sont : pour les échangeurs de cations : le phosphate, l acétate, le borate et le formiate de sodium, de potassium ou d ammonium pour les échangeurs d anions : carbonate ou bicarbonate, l ammoniaque, la pyridine. 2.3.4 MISE EN ŒUVRE DE LA CHROMATOGRAPHIE IONIQUE Par ce terme, on entend une chromatographie qui associe un échange d ions avec une détection conductimétrique. La détection des composés ioniques de l échantillon est rendue difficile par suite de leur faible concentration au sein de la phase mobile aqueuse chargée d une grande quantité d ions. Deux voies ont été développées dans la recherche d une bonne détection la détection : conductométrique avec ou sans neutralisation. 30
2.3.4.1 DETECTION AVEC NEUTRALISATION Le principe consiste à disposer entre la colonne de séparation et la cellule de détection un dispositif de neutralisation par lequel on élimine les ions de l éluant (suppressed ion chromatography), généralement par réaction acide base. La détection des ions de l échantillon a lieu dans une phase mobile rendue aussi peu conductrice que possible. Par exemple : supposons l analyse d un mélange de cations Li +, Na + et K +. la séparation s obtient aisément sur une colonne avec une résine échangeuse de cations de type sulfonate comme phase stationnaire et d une solution d acide fort (acide chlorhydrique par exemple). L ordre d affinité des ions pour la résine étant : K + > Na + > H + > Li + L ion Li + ne sera pas retenu et migre à la même vitesse que la phase mobile dans la colonne tandis que K + et Na + migrent plus lentement. En sortie de colonne chaque ion sera en mélange avec la phase mobile (H + et Cl - ). Pour éliminer l acide chlorhydrique, on fait percoler l effluent de la colonne sur une seconde colonne placée en série contenant une REI de type anionique forte sous forme OH. On observe deux réactions : une réaction de permutation des ions Cl - par les ions OH - une réaction de neutralisation des ions H + de la phase mobile par les ions OH -. En sortie, ne subsisteront que les espèces (Li + OH - ), (Na + OH - ), (K + OH - ). La neutralisation joue donc un double rôle : éliminer les ions de l éluant ce qui permet de diminuer la conductivité de l effluent. 31
augmenter la réponse due aux solutés du fait de la permutation Cl - /OH -. La conductivité ionique de OH - est en effet 2,6 fois celle de Cl -. Pour la séparation d anions, la colonne de neutralisation est une résine échangeuse de cations mise sous forme acide et l éluant sera une solution de carbonate ou d hydrogénocarbonate de sodium. L acide carbonique très peu dissocié ne contribue pratiquement pas à la conductivité de la solution aqueuse. 32
L inconvénient de ces colonnes de neutralisation est la nécessité de les régénérer périodiquement afin que le support reste soit sous forme acide, soit sous forme basique. Ces colonnes sont maintenant remplacées par des supresseurs à fibres ou à micromembranes de forte capacité ionique. On fait passer l effluent sortant de la colonne de chromatographie ionique dans une membrane échangeuse d ions ultramince (volume mort de l ordre de 50 µl) qui le sépare d une solution régénérante qui s écoule à contre courant. Par exemple, les ions Na + de la phase éluante sont échangés par des ions H + à la surface interne de la membrane et diffusent ensuite vers l autre surface où il seront échangés avec des ions H + de la solution acide de régénération. Les ions H + de cette solution migrent dans le sens opposé afin de maintenir l électroneutralité. Plus récemment sont apparus des suppresseurs autorégénérés par une réaction d électrolyse de l eau : 33
Les performances de ces systèmes sont telles qu elles permettent la mise en œuvre de gradient d élution, ce qui n est pas permis en analyse sans neutralisation. 34 2.3.4.2 DETECTION SANS NEUTRALISATION C est une méthode plus simple que la précédente mais elle impose : d utiliser un éluant peu conducteur (ce qui implique une faible concentration ionique et, par suite, la mise en œuvre d une colonne de faible capacité. que l ion développeur ait une faible conductivité ionique λe On utilise généralement un ion organique volumineux, donc peu mobile, mais présentant une forte affinité pour la phase stationnaire, de façon à limiter sa concentration dans l éluant. La détection s effectue directement à la sortie de la colonne de séparation.
Par exemple : l analyse des anions organiques peut être effectuée en utilisant l ion benzoate comme ion développeur. Cet ion a une conductivité ionique de 32 S cm 2 mol -1 qui est largement inférieure à celle des anions organiques courants tels Cl -, NO3 -, SO4 2- pour lesquels elle est de l ordre de 70 S cm 2 mol -1. La variation de la conductance sera suffisante pour pouvoir détecter ces espèces. 35
La détection peut être améliorée en utilisant l acide benzoïque qui n est que partiellement dissocié en solution aqueuse. Une solution d acide benzoïque à 8,4 10-4 mol l -1 contient 2 10-4 mol l -1 d ions benzoate (taux de dissociation est de 24%) et présente une force éluante très proche de celle d une solution de benzoate de sodium à la même concentration. Le remplacement de l ion sodium par un proton exalte la réponse chromatographique par mesure conductimétrique la conductivité ionique de H + est beaucoup plus élevée que celle de Na + ). 2.3.4.3 ASPECTS PRATIQUES ET APPLICATIONS La mise en œuvre de phases mobiles soit très acides soit fortement basiques demande d accorder une attention particulière à la corrosion et aux risques de contamination des échantillons. La chromatographie ionique est souvent utilisée pour l analyse de traces dans le domaine des eaux : eaux de grande pureté eaux naturelles (surface, souterraine) eaux de rejets industriels (industrie alimentaire, pharmaceutique, traitements de surface ). 2.4 LA CHROMATOGRAPHIE DE PAIRES D IONS OU D APPARIEMENT D IONS On appelle paire d ions ou appariement d ions, une entité formée par l association de deux ions de charges opposées. Cette association peut être due : soit à des interactions électrostatiques : ces paires d ions s observent dans des solvants de faible constante diélectrique. Exemple : on peut extraire par un solvant organique de faible constante diélectrique comme un mélange chlorure de méthylène hexane la paire d ions formée par le mélange en phase aqueuse d une amine protonée à chaîne courte RNH3 + avec des ions perchlorate ClO4 - : 36 RNH3 + aq + ClO4 - aq [RNH3 +, ClO4 - ]org soit à des effets hydrophobes : les ions organiques de grande taille comportent une partie apolaire et un groupement ionique s associent en paire d ions en solution aqueuse. Exemple : soit en phase aqueuse à ph 7-8 un ion carboxylate RCOO - en présence d un cation ammonium quaternaire comportant des chaînes alkyle hydrophobes, par exemple l anion tétrabutylammonium Bu4N +. Il y a formation d une paire d ions en phase aqueuse en raison du caractère hydrophobe du cation ammonium quaternaire.