Secrétariat Général Direction générale des ressources humaines Concours du second degré Rapport de jury Session 2007 AGREGATION Interne BIOCHIMIE GENIE BIOLOGIQUE Rapport de jury présenté par Madame Françoise GUILLET Présidente de jury Les rapports des jurys des concours sont établis sous la responsabilité des présidents de jury 1
SOMMAIRE page Composition du jury 3 Renseignements statistiques 4 Epreuves d admissibilité - Première épreuve : Dossier technique relatif à un problème biotechnologique o Sujet 4 o Rapport de l épreuve 24 - Seconde épreuve : Questions Biochimie, biologie cellulaire, microbiologie o Sujet 29 o Rapport de l épreuve 29 Epreuves d admission - Travaux pratiques : Exploitation de documents techniques et pédagogiques. o Sujets 32 o Rapport de l épreuve 51 - Epreuve sur dossier : Soutenance d'un dossier relatif à un projet. o Rapport de l épreuve 53 Résultats des concours Conclusion générale 53 2
Composition du jury Président : Mme GUILLET Françoise, Inspecteur général de l'éducation nationale Vice-président : M. DANIEL Jean-Yves, professeur des universités - Université Bordeaux II Secrétaire du jury : M. VANNESTE Patrick, professeur agrégé - E.N.C.P.B. Académie : PARIS Membres : Mme. BENAYOUN Christine, professeur agrégé - E.N.C.P.B. Académie : PARIS M.CNOKAERT Joël, inspecteur d'académie- inspecteur pédagogigaque régional - Académie d aix Marseille M. DUCANCEL Frédéric, Ingénieur de recherche - CEA gif Sur Yvette Académie : Versailles Mme. ETIENNE Isabelle, professeur agrégé - E.N.C.P.B. Académie : PARIS M. PERRIN Jean-François, professeur agrégé - lycée Saint louis Académie : BORDEAUX M. PLAS Christian, professeur agrégé - E.N.C.P.B. Académie : PARIS M. TELLIER Charles, professeur des universités - UMR-CNRS Académie : NANTES Mme. WALTHER Claudine, professeur agrégé - E.N.C.P.B. Académie : PARIS 3
STATISTIQUES NOMBRE DE CANDIDATS INSCRITS Agrégation interne : 77 CAER : 14 NOMBRE DE CANDIDATS PRESENTS PREMIERE EPREUVE Agrégation interne : 49 CAER : 6 SECONDE EPREUVE Agrégation interne : 48 CAER : 6 AGREGATION DE BIOCHIMIE - GENIE BIOLOGIQUE Concours interne Session 2007 PREMIERE EPREUVE Durée : 6 heures Coefficient : 1 Dictionnaire bilingue anglais français autorisé. L usage de tout ouvrage de référence, de tout autre dictionnaire et de tout matériel électronique est rigoureusement interdit. Si les lipides occupent une place de plus en plus importante dans le domaine alimentaire (produits allégés, produits enrichis en acides gras polyinsaturés ) et médical (obésité, risques cardiovasculaires ), les domaines d applications couverts par la lipochimie sont très vastes : parmi ceux-ci nous pouvons mentionner les cosmétiques, les détergents, les peintures Le sujet propose différents thèmes relatifs aux lipides : analyses médicales, fabrications et contrôles de produits cosmétiques et alimentaires, agronomie, génie fermentaire. 4
PARTIE A : détermination de la triglycéridémie Le dosage des triglycérides est couramment pratiqué en classe de BTS Analyses Biologiques. Cette partie propose l étude de deux méthodes de dosage (documents 1 et 2). QUESTION A1 Indiquer les réactions mises en jeu dans les deux méthodes de dosage. QUESTION A2 Dans la première méthode plusieurs témoins sont effectués. Montrer la nécessité de ces témoins. Démontrer la formule de calcul C = F. A. Expliciter A et calculer F. QUESTION A3 Dans les deux méthodes le résultat peut être corrigé de 0,11 mmol.l -1. Justifier cette correction. PARTIE B : fabrications et contrôles de produits alimentaires et cosmétiques QUESTION B1 Le beurre doit contenir moins de 16 % d eau. Cette teneur en eau peut être contrôlée par la méthode de Dean Stark. L appareil utilisé est représenté ci-dessous : Une masse voisine de 50 g de beurre est introduite dans le ballon. Du xylène, quelques parcelles de paraffine (anti-mousse) et une ou deux billes de verre sont ajoutés. L ébullition est maintenue à allure lente et régulière. Le volume d eau dans l éprouvette est noté lorsque celui-ci est constant. Le résultat est exprimé en grammes d eau dans 100 g de beurre. Rédiger le principe de cette méthode. QUESTION B2 Le cholestérol peut être éliminé du beurre en le traitant par des cyclodextrines. La structure des cyclodextrines est présentée dans le document 3. A partir des données de ce document, présenter, à l aide de schémas légendés, le principe de ce traitement. QUESTION B3 5
Une crème hydratante est constituée d une phase lipophile protégeant la peau du dessèchement, d une phase aqueuse contenant au moins une substance hydrophile de petit poids moléculaire, de stabilisants, de conservateurs et de parfum. La stabilité de l émulsion est obtenue grâce à des tensio-actifs (TA). Ceux-ci sont caractérisés par leur HLB (hydrophilic lipophilic balance) compris entre 1 et 20. Les TA dont le HLB est inférieur à 10 sont lipophiles alors que les TA dont le HLB est supérieur à 10 sont hydrophiles. Les matières grasses ont un HLB requis (rhlb), HLB du mélange de TA nécessaire pour obtenir une émulsion stable. Les HLB ainsi que les rhlb sont additifs. Lors d une séance de travaux pratiques en BTS bioanalyses et contrôles, les élèves, pour préparer une crème, doivent choisir les TA et calculer les proportions à utiliser (document 4). Rédiger un corrigé justifiant ce choix et démontrant le calcul des proportions à utiliser. PARTIE C : découverte du gène CUT1 d'arabidopsis thaliana codant pour une enzyme nécessaire pour la biosynthèse des cires cuticulaires Les plantes terrestres sécrètent des couches de cires déposées sur les surfaces en contact avec le milieu aérien extérieur et essentielles pour leur survie (limitation des pertes en eau, protection contre les radiations U.V., facteur de résistance aux pathogènes, déterminant des relations plantes insectes...). Les cires sont des lipides dérivés d'acides à très longues chaînes (VLCFA, very long chain fatty acids). En 1999, Millar, Clemens, Zachgo, Giblin, Taylor et Kunst ont publié un article présentant la découverte du gène CUT1 chez Arabidopsis thaliana (arabette rameuse) et mettant en évidence sa fonction dans la production des VLCFAs précurseurs des cires au niveau des tiges notamment. La découverte de CUT1 a été réalisée grâce à l'analyse d'une base bioinformatique des marqueurs des séquences exprimées obtenue par séquençage partiel des éléments d'une banque de cdna d'arabidopsis. Les questions de cette partie demandent l'utilisation des documents 5 à 7. Ces documents présentent des extraits de l'article de Millar, Clemens, Zachgo, Giblin, Taylor, Kunst : «CUT1, an Arabidopsis gene required for cuticular wax biosynthesis and pollen fertility, encodes a very-lon-chain fatty acid condensing enzyme.», Plant cell. (1999), vol. 11, 825-838. 6
QUESTION C1 Les cires ne figurent pas au chapitre intitulé «Les lipides» dans le programme des classes terminales STL-BGB. Néanmoins, dans le cadre d'une séance de travaux dirigés, il est possible de présenter très brièvement la fonction des cires végétales aux élèves afin de leur proposer le document 5 à annoter lors d'un travail collectif. Vers quelles annotations essaiera-t-on de diriger le groupe de travail? Document 5 à rendre annoté avec la copie. QUESTION C2 Le logiciel TBLASTN est présenté dans le document 6. Construire un document destiné à être remis à des élèves et expliquant pourquoi une séquence nucléique propose 6 phases de lecture par «transcription puis traduction informatiques». QUESTION C3 Résumer en quelques lignes le type de travail réalisé par un logiciel d'alignement de séquences (qu ils alignent des séquences nucléiques ou protéiques, type BLASTN, TBLASN, BLASTX ). QUESTION C4 Utiliser les documents 6 et 7. Dans le cadre de la recherche d'un nouveau gène fortement homologue à FAE1 quels sont les intérêts et les limites d'utiliser la base informatique des marqueurs des séquences exprimées (expressed sequence tags, ESTs) obtenue par les séquençages partiels d'une banque de clones de cdna? QUESTION C5 Commenter la figure 1 du document 7. QUESTION C6 En quoi l'analyse présentée à la figure 2 du document 7 montre-t-elle l'unicité du gène CUT1 dans le génome? Donnée : les séquences reconnues par les enzymes XbaI, EcoRV, NdeI, SphI et BcII ne sont pas présentes dans CUT1. QUESTION C7 Proposer une définition pour le mot gène au niveau BTS. QUESTION C8 Le document 7, dans le paragraphe intitulé «Obtention d'une plante transgénique 35S-CUT1 de phénotype dépourvue de cires», propose la réalisation de plantes Arabidopsis transgéniques présentant le phénotype «tige dépourvue de cires». De façon surprenante, le phénotype est obtenu avec une construction dans laquelle le promoteur 35S (promoteur fort) et le transgène sont en orientation sens. Ce phénomène appelé «suppression sens de l'expression» (sense suppression of expression) est classique dans le monde végétal et est très étudié, il a une origine postranscriptionnelle complexe. On envisage de proposer le document 7 comme sujet de travail à des élèves en section BTS biotechnologie. En quoi le paragraphe intitulé «Obtention d'une plante transgénique 35S-CUT1 de phénotype dépourvue de cires» est-il à la fois pédagogiquement dangereux et pédagogiquement intéressant? QUESTION C9 Le document 7, dans le paragraphe intitulé «Obtention d'une plante transgénique 35S-CUT1 de phénotype dépourvue de cires», propose la réalisation de plantes Arabidopsis transgéniques présentant le phénotype «tige dépourvue de cires». Le phénotype «tige dépourvue de cires» se révèle aisément en exposant les plantes à un éclairage puissant en lumière blanche : les plantes de phénotype sauvage montrent une tige «blanche» et celles de phénotype «tige dépourvue de cires» une tige verte. Justifier. PARTIE D : production d une lipase fongique au laboratoire 7
Cette partie propose l étude des conditions de la production, au laboratoire, d une lipase fongique par Candida lipolytica en fermenteur et milieu non renouvelé. Le protocole expérimental est présenté dans le document 8 ; les résultats obtenus dans les documents 9 et 10. QUESTION D1 Indiquer les principales applications industrielles des lipases produites par les micro-organismes sachant que leur activité catalytique est mise à profit pour des réactions d hydrolyse mais aussi pour des réactions de synthèse ou de trans-estérification. QUESTION D2 Analyse du protocole : 1. Quel est l intérêt d ajouter dans le milieu de fermentation les constituants suivants : corn steep liquor et tween 80 (oléate de sorbitane polyoxyéthyléné)? 2. La détermination de la concentration en oxygène dissous est réalisée à l aide d une électrode de Clark. Expliquer le principe de la mesure. Pourquoi la valeur mesurée est-elle exprimée en pourcentage? 3. Indiquer la composition d un milieu d isolement qui permettrait d effectuer le contrôle de pureté du milieu de fermentation (absence de contaminants) et de visualiser la production d une lipase par la souche de Candida lipolytica. QUESTION D3 Exploitation des résultats : 1. Donner une valeur approchée de la vitesse spécifique maximale de croissance et du temps de génération. Comment procéder pour obtenir des valeurs plus précises? 2. Analyser les variations du ph et de la concentration en oxygène dissous. Comment les interpréter? 3. Que peut-on déduire de la cinétique de production de la lipase? 4. A l aide du document 10 déterminer la productivité volumique horaire globale et la productivité volumique horaire maximale. Quel est l intérêt de ces deux valeurs? Document 1 Test-Combination Triglycérides enzymatique Réactifs Concentrations des solutions prêtes à l'emploi R1 Substrat/enzymes Tampon Tris-citrate ph 8,2 74 mmol.l -1 Mg 2+ 30,8 mmol.l -1 cholate de sodium 7,9 mmol.l -1 monoéther isotridécanolique de polyéthylène glycol 0,2 % ATP 0,05 mmol.l -1 PEP 0,3 mmol.l -1 NADH 0,25 mmol.l -1 lipase 3 U.L -1 PK 4 U.L -1 LDH 0,5 U.L -1 R2 Glycérokinase 8
GK 250 U.L -1 La solution réactionnelle est obtenue en mélangeant 10 ml de solution R1 avec 0,5 ml de solution R2. Mode opératoire Longueur d'onde : 340 nm Trajet optique : 10-2 m d'épaisseur Température d'incubation : 20-25 C Mesurer contre l'air. Effectuer un témoin-réactifs (TR) par série en remplaçant dans la manipulation l'échantillon par de l'eau distillée. Introduire dans des tubes à essais : Témoin-essai (TE) Essai Solution 1 1000 µl - Solution réactionnelle - 1000 µl Echantillon 20 µl 20 µl Mélanger et incuber env. 10 min. à 20-25 C. Lire les absorbances. Calcul Calculer la concentration (C) en triglycérides dans l'échantillon : Longueur d'onde 340 nm C (mmol.l -1 ) F x A Données : ε NADH à 340 nm : 630 m 2.mol -1 Trajet optique = 10-2 m Remarque : soustraire 0,11 mmol.l -1 de la concentration en triglycérides calculée ci-dessus. 9
Document 2 Détermination enzymatique des triglycérides Réactifs Réactif 1 étalon Concentration dans le test : Réactif 2 tampon glycérol 2,29 mmol.l -1 ou 2.L -1 de triglycérides (PM = 875) tampon tris ph 7,6 parachlorophénol magnésium 100 mmol.l -1 2,7 mmol.l -1 4 mmol.l -1 Réactif 3 amino-antipyrine 0,4 mmol.l -1 lipase 1000 U.L -1 glycérokinase 200 U.L -1 glycérol 3 phosphate oxydase 2000 U.L -1 peroxydase 200 U.L -1 ATP 0,8 mmol.l -1 Mode opératoire Solution de travail : reprendre 1 flacon de Réactif 3 par 25 ml de Réactif 2 (agitation douce). Longueur d'onde : 505 nm (492-550) Zéro de l'appareil : témoin réactif Témoin Etalon Dosage réactif Etalon (Réactif 1) - 10 µl - Echantillon - - 10 µl Solution de travail 1 ml 1 ml 1 ml Mélanger. Mesurer les absorbances après une incubation de 5 min à 37 C ou de 10 min à 20-25 C. Stabilité de la coloration : 30 min. Linéarité : 11,4 mmol.l -1 (70 g.l -1 ) Remarque : en routine, sur les sérums de patients, il est fréquemment admis d'effectuer une correction systématique de -0,11 mmol.l -1. 10
Document 3 CYCLODEXTRINES Les cyclodextrines sont des polyosides cycliques constitués de 6 à 8 résidus glucose. 11
Document 4 La formule de la crème, émulsion L/H (lipophile dans hydrophile), fournie aux élèves est la suivante : Huile de vaseline 10 % Alcool cétylique 5 % Stéarate de butyle 5 % Huile de germe de blé 5 % Propylène glycol 2 % Glycérol 1 % Extrait de lierre 1 % Parahydroxybenzoate de méthyl sodé 0,2 % Parahydroxybenzoate de butyl sodé 0,2 % Mélange de TA 7 % Parfum 0,5 % Eau qsp 100 % HLB requis de quelques matières grasses rhlb Huile de vaseline 12 Alcool cétylique 15 Huile de germe de blé 9,5 Stéarate de butyle 11 HLB de quelques tensio-actifs HLB SPAN 80 Monooléate de sorbitanne 4,3 SPAN 40 Monopalmitate de sorbitanne 6,7 TWEEN 85 Trioléate de sorbitanne polyoxyéthyléné 11 TWEEN 40 Monopalmitate de sorbitanne polyoxyéthyléné 15,6 TWEEN 20 Monolaurate de sorbitanne polyoxyéthyléné 16,7 12
Document 5 Schéma métabolique des voies de biosynthèse des cires végétales de la tige chez Arabidopsis Les acides gras à très longues chaînes sont convertis en cires diverses par deux voies distinctes. L'épaisseur des flèches indique l'importance relative du flux métabolique. 13
Document 6 Quelques données concernant TBLASTN, les marqueurs de séquences exprimées, les ARNm et le code génétique A propos de TBLASTN TBLASTN est un logiciel de comparaison et d'alignement de séquences protéiques : une séquence protéique donnée (une suite de résidus aminoacides) va être confrontée à des séquences protéiques déduites de la transcription informatique selon les 6 phases de lecture de séquences nucléiques obtenues dans des banques de données informatiques. Les séquences nucléiques sont généralement des marqueurs de séquences exprimées (Expressed Sequence Taged : EST) TBLAST va «aligner» les séquences et donner les scores d'alignement. A propos des marqueurs de séquences exprimées : Expressed Sequence Taged : ESTs Voici, les étapes conduisant à l'obtention d'une base informatique de données d'ests : La première étape consiste à obtenir une banque d'adnc. C'est à partir des ARNm totaux obtenus avec l'être vivant choisi dans les conditions physiologiques déterminées qu'on fabrique la banque d'adnc (obtention de copies double brin ADN des ARNm). Les ADNc sont alors clonés (inserts ADNc dans les vecteurs de clonage) de sorte que l'on obtienne une collection de clones indépendants. La deuxième étape est le séquençage partiel et à grande échelle des clones obtenus : pour chaque clone, quelques centaines de nucléotides (en général 200 à 700) sont séquencés à chaque extrémité des inserts ADNc. L'information peut donc n'être que partielle par rapport à la taille de certains ADNc (qui peut atteindre plusieurs milliers de nucléotides), mais elle est suffisante pour caractériser de manière univoque chaque clone. On obtient donc des 5'-ESTs et des 3'-ESTs. Les séquences (ESTs) sont alors triées (problème des doublons, des chevauchements...), annotées et entrées dans une base de données informatique. A propos des ARNm eucaryotes Schéma de la structure d'un ARNm polyadénylé UTR : région transcrite non traduite (untranslated region). Le code génétique au niveau des ARNm 14
1 nucléotide en 5' 2 nucléotide 3 nucléotide U C U C A G Phe:F Phe:F Leu:L Leu:L Leu:L Ser:S Pro:P Tyr:Y Tyr:Y STOP STOP His:H His:H Gln:Q Gln:Q Cys:C Cys:C STOP Trp:W Arg:R U C A G U C A G A Ile:I Ile:I Ile:I Met:M Thr:T Asn:N Asn:N Lys:K Lys:K Ser:S Ser:S Arg:R Arg:R U C A G G Val:V Ala:A Asp:D Asp:D Glu:E Glu:E Gly:G U C A G 15
Document 7 Découverte du gène CUT1 d'arabidopsis thaliana codant pour une enzyme nécessaire pour la biosynthèse des cires cuticulaires Depuis de nombreuses années, on sait que les VLCFAs sont synthétisés dans un système microsomial d'élongation (système microsomial FAE, fatty acid elongation). Ce système fonctionne par addition successives de résidus en C2 à partir du malonyl-coenzyme A à des acides gras en C16 et C18 préexistants et synthétisés de novo par la voie plastidique. En 1995, un gène fondamental intervenant dans le processus de biosynthèse de VLCFAs a été isolé chez Arabidopsis thaliana : FAE1 (fatty acid elongation 1). FAE1 code une enzyme présente dans les graines et qui, à partir d'acides gras en C18, catalyse la première réaction (condensation) du système microsomial FAE nécessaire à la production des acides gras en C20 et C22 des réserves lipidiques de la graine. En 1997 on a montré que c'est FAE1 qui est déterminant pour la production des VLCFAs des réserves des graines. Les auteurs de l'article dont des extraits sont présentés ci-dessous ont pris comme point de départ le raisonnement suivant : Les cires dérivent de VLCFAs et chez la graine, la biosynthèse des VLCFAs est dépendante des enzymes du système microsomial d'élongation, en particulier le produit de FAE1. En recherchant un gène homologue à FAE1 et codant une enzyme à localisation épidermique chez la plante, on peut espérer découvrir un gène d'importance dans la biosynthèse des cires cuticulaires de la plante. Notes : stem = tige, wax = cire. Pour information CUT1 est désormais (en 2006) sous la nomenclature CER6. Identification du gène CUT1 [......] TBLASTN search for related sequences [...] in the database of expressed sequence tags (ESTs) of anonymous Arabidopsis cdna clones [...], using the deduced amino acid sequence of FAE1, revealed that >15 ESTs had open reading frames with significant sequence similarity. These ESTs did not correspond to known condensing enzymes, such as chalcone synthase or 3-ketoacyl-acyl carrier protein synthase III (KASIII), which had lower similarity scores. Thus, a family of FAE1-related genes exists in Arabidopsis. These genes are likely to encode condensing enzymes, which may be involved in the synthesis of VLCFAs. The expression patterns of several of these FAE1-related genes were examined by using RNA gel blot analyses. One gene, represented by EST T76616, was expressed in stems, leaves, and flowers, but it was not expressed in roots (data not shown). Furthermore, in situ hybridization analysis demonstrated that the transcript corresponding to this gene specifically accumulated in the epidermal cells of the Arabidopsis stem [...Figure 1...]. These are the cells in which wax biosynthesis occurs, suggesting that this gene, CUT1, might be a good candidate for a condensing enzyme involved in wax production. DNA sequencing revealed that the CUTI cdna from this T76616 clone was 1829 nucleotides long, which is a length similar to that of the FAEI transcript [......] the CUTI cdna has a 1494-bp coding region, which is preceded by 58 bp of 5' untranslated region and followed by a 277-bp 3' untranslated region, containing a 23-bp poly(a) tail. This cdna sequence analysis, together with the tact that the FAE1 protein is 506 amino acids in length, suggests that we have identified a full-length cdna. Alignment of the predicted CUT1 amino acid sequence with 16
the FAE1 protein revealed that they share 50.0% amino acid identity and 74.7% amino acid similarity [...], confirming that the protein encoded by CUTI is a putative condensing enzyme, possibly involved in VLCFA biosynthesis. DNA gel blot analysis demonstrated that CUTI is a single copy gene [...Figure 2...], although there was a faintly hybridizing second band when the experiment was performed at low stringency (data not shown). [......] 17
Document 7 Découverte du gène CUT1 d'arabidopsis thaliana codant pour une enzyme nécessaire pour la biosynthèse des cires cuticulaires Figure1. Distribution of the CUT1 Transcript in a Cross-Section of an Arabidopsis stem. The section was hybridized with the digoxigeninlabeled antisense CUT1 transcript, which is shown by the formation of a dark red-brown precipitate. Figure 2. Genomic DNA Gel Blot Analysis of CUT1 Hybridizing sequences. Ten micrograms of Arabidopsis wild-type DNA [...] was digested with the indicated restriction enzyme. The blot was hybridized with the complete CUT1 coding region derived from the EST clone T76166. The positions of molecular length markers in kilobases are indicated at left. Obtention d'une plante transgénique 35S-CUT1 de phénotype dépourvue de cires [...] In an attempt to elucidate the function of CUT1, we generated transgenic Arabidopsis plants harboring the binary vector p35s-cut1, in which the complete CUT1 cdna was subcloned in sense orientation behind the cauliflower mosaic virus 35S promoter. The expression of this transgene in Arabidopsis could result in either the constitutive expression of the CUT1 protein or the sense suppression of the expression of the endogenous CUT1 gene, which occurs efficiently when transgenes are transcribed from a strong promoter (Elmayan and Vaucheret, 1996). In our transformation experiment, we obtained 46 kanamycin-resistant Arabidopsis plants, transferred them to soil, and grew them to maturity. Instead of the typical waxy or glaucous appearance of wild-type inflorescence stems, 36 of the transgenic plants had stems with a shiny bright green appearance, indicating the absence of the epicuticular wax layer [...Figure 3...]. Scanning electron microscopy revealed that the surfaces of these stems completely lacked wax crystals...] 18
Document 7 Découverte du gène CUT1 d'arabidopsis thaliana codant pour une enzyme nécessaire pour la biosynthèse des cires cuticulaires Figure 3. 35-CUT1-plants display a waxless phenotype and are male sterile. (A) Comparison of the woax load on the stems of wild-type (left) to transgenic 35S-CUT1 (right) plants. In strong light, wilde-type plants appear white [......] In contrast, the stems of transgenic 35S-CUT1 plants [......] have a bright green appearance. (B) 35S-CUT1 plants are sterile, as evidence from siliques failing to develop. A fertile wild-plant is shown at left. Figure 4. Stems of transgenic 35S-CUT1 plants are completely devoid of wax crystals. (A) Scanning electron microscopy of the surface of stems from 35S-CUT1 Plants displaying the waxless phenotype. (B) Stems from wilde-type plants. Bars in (A) and (B) = 10 µm. 19
Document 8 Lipase Production in Discontinuous Operation System Using a Candida lipolytica Strain ANA IONIŢĂ, M. MOSCOVICI, AURORA DRĂGOLICI, MIHAELA EREMIA, CĂTĂLINA BUCĂ, RADU ALBULESCU, IOANA PAVEL, MIHAELA CLAUDIA VAMANU Roum. Biotechnol. Lett., Vol. 7, No. 1, 2001, pp 547-552 Microorganism, culture media and cultivation conditions Candida lipolytica ICCF 214 strain selected previously by screening was used. Liquid medium containing (w/v): glucose (2.0 %), corn steep liquor (1.0 %), yeast extract (0.5 %), Tween 80 (1.0 %), mineral salts (K + and Mg 2+ ) and antifoam agent (mineral oil) have been used for the submerged cultivation. The initial ph of the media was 5. The inoculum was prepared on GYP (glucose - yeast - peptone) medium in Erlenmeyer flasks, incubated at 27 o C for 24 hours. The fermenter was inoculated with 10 % (v/v) of inoculum. The submerged cultivation was performed in a 14 L glass fermenter containing 6 L medium, at 27 o C for 24 h. The culture was variously stirred and aerated during fermentation corresponding to the growth phase of the microorganism. Enzyme assay The activity of the extracellular lipase was assayed in the cell-free liquid, after separation of biomass by centrifugation at 3500 rpm for 20 min. The lipolytic activity was determined according to a modified Willstatter method, on olive oil as substrate. One activity unit was defined as the amount of enzyme which hydrolises the vegetable oil, and thus causes the release of 1 µmole equivalent of carboxyl groups per minute, under the reaction conditions (30 o C, ph = 7.2). Other analytical methods Sugar concentration of the culture was determined using a colorimetric method. Biomass concentration was determined measuring the absorbance of the broth by visible spectrophotometry at 600 nm. 20
Document 9 Production d une lipase fongique Résultats expérimentaux Temps Glucose (heure) (g/l) A 600 corrigée Ln (A 600 corrigée) Activité «Lipase» (U/mL) Vitesse %O 2 d'agitation RPM Air Flow (L/min) 0 20 0,2-1,61 0 100 500 2 5 2 18 0,22-1,51 0 80 500 2 5 4 16 0,24-1,43 0 60 700 3 5 6 14 0,6-0,51 2 44 700 3 4 8 10 1,1 0,10 3 38 800 3,5 3,5 10 5 1,4 0,34 12 30 800 3,5 3,6 12 1 1,6 0,47 16 20 800 4 3,7 14 0 1,8 0,59 20 30 900 4 4 16 0 1,8 0,59 22 42 900 4 4,5 18 0 1,8 0,59 26 50 900 4 5 20 0 1,7 0,53 34 64 900 4 5,5 22 0 1,8 0,59 38 84 900 4 5,5 24 0 1,8 0,59 30 88 900 4 5,5 ph [glucose] = f(t) 25 20 15 g/l 10 5 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 temps (h) activité lipase = f(t) 40 30 U/mL 20 10 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 temps (h) 21
Ln (A600) = f(t) 1,00 0,50 0,00-0,50-1,00-1,50-2,00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 temps (h) % O2 dissous = f(t) 100 80 % O2 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 temps (h) 22
Document 10 Suivi de la production de lipase par Candida lipolytica en milieu non renouvelé U/mL activité lipase = f(t) 40 35 30 25 20 RAPPORT SUR LA PREMIERE EPREUVE D'ADMISSIBILITE ETABLI PAR J. CNOKAERT, JF. 15 PERRIN, C. PLAS, P. VANNESTE 10 5 0-6 -4-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 temps (h) temps de préparation du fermenteur 23
Résultats de l épreuve 55 candidats ont composé : - 1 a obtenu une note supérieure ou égale à 12/20 ; - 2 ont obtenu une note supérieure ou égale à 10 et strictement inférieure à 12 ; - 3 ont obtenu une note supérieure ou égale à 8 et strictement inférieure à 10 ; - 10 ont obtenu une note supérieure ou égale à 6 et strictement inférieure à 8 ; - 39 ont obtenu une note strictement inférieure à 6. La moyenne générale de l épreuve est de 4,9/20 et la meilleure note est de 12/20. Malgré un sujet dont la conception était habituelle pour cette épreuve et dont les différentes parties semblaient très accessibles les résultats sont décevants. Le jury tient à rappeler aux candidats qu il faut apprendre à utiliser les données des documents fournis. Ces dernières associées à des connaissances de base permettent de répondre à des questions portant sur des thèmes qui sont à priori inconnus. Il faut absolument respecter le sujet. Ainsi lorsqu un schéma est demandé, il ne s agit pas de rédiger un texte. L usage du vocabulaire scientifique doit être rigoureux. Dans cette épreuve la mobilisation des connaissances de base en chimie et en physique est indispensable. Pour préparer cette épreuve, il est vivement conseillé de travailler les sujets des années antérieures. Dans cette optique, le jury propose des éléments précis relatifs aux différentes questions posées. QUESTION A1 Réactions mises en jeu dans les deux méthodes de dosage. lactate Triglycˇrides lipase glycˇrol glycˇrokinase ADP pyruvate kinase deshydrogˇnase pyruvate lacta 3 H 2 O 3 acides gras ATP glycˇrol 3 phosphate Test-Combination Triglycérides enzymatique PEP ATP NADH,H + NAD + Détermination enzymatique des triglycérides Triglycˇrides lipase glycˇrokinase glycˇrol glycˇrol 3 phosphate glycˇrol 3 phosphate oxydase H 2 O 2 3 H 2 O 3 acides gras ATP ADP dihydroxyacˇtone phosphate 2 H 2 O 2 + parachorophˇnol + 4 amino antipyrine peroxydase quinonˇimine + 4 H 2 O QUESTION A2 Nécessité des témoins : témoin-essai et témoin-réactifs : absorption du sérum et des réactifs Démonstration de la formule de calcul C = F. A. A = A TE - A Essai - A TR 24
C = V. ε l E 1 MR F = 8,1 (avec C en mmol.l -1 ) QUESTION A3 Dans les deux méthodes le résultats peut être corrigé de 0,11 mmol.l -1 pour tenir compte du glycérol libre du sérum QUESTION B1 Le xylène, solvant non miscible à l eau et de densité inférieure, forme avec l eau un azéotrope. Cet azéotrope constitué de 60 % de xylène et de 40 % d eau bout à 95 C. Par distillation en présence de xylène, l eau contenue dans le beurre est entraînée sous forme de vapeur dont la composition et la température sont celles de l azéotrope. Les vapeurs condensées sont recueillies dans un tube gradué. Les deux constituants de l azéotrope se séparent par gravité et le volume d eau est mesuré directement. QUESTION B2 Cyclodextrine et cholestérol forment un complexe, le noyau hydrophobe du cholestérol pénétrant à l intérieur de la molécule de cyclodextrine. Le complexe ainsi formé est alors hydrophile, les groupements OH de la molécule de cyclodextrine et du cholestérol étant situés à la périphérie ; celuici peut alors être éliminé par lavage. QUESTION B3 rhlb de la phase grasse = (12x10/25) + (15x5/25) + (11x5/25) + (9,5x5/25) = 11,9 Choix des tensio-actifs (TA) : L émulsion étant de type L/H les TA choisis seront hydrophiles (HLB > 10). L un ayant un HLB inférieur à 11,9 et l autre un HLB supérieur à 11,9. Donc Tween 85 (HLB = 11) et Tween 40 (HLB = 15,6). Soit x la fraction de Tween 85 dans le mélange actif : 11 x + 15,6 (1-x) = 11,9 x = 0,804 Donc 80,4 % de Tween 85 et 19,6 % de Tween 40 dans le mélange actif. 25
QUESTION C1 Mots clés : élongation des acides gras 2C par 2C, aldéhyde, alcool primaire, ester, alcane, alcool secondaire, cétone, réduction, oxydation. QUESTION C2 Le document, mettant en œuvre des exemples de séquences devait faire ressortir que la lecture d une séquence de nucléotides codant pour une protéine se produit par groupes de trois nucléotides : les triplets, ou codons. Il existe donc trois façons (cadres de lecture) de lire une séquence nucléotidique. Soit : +1 : lecture des triplets débutant au premier nucléotide +2 : lecture des triplets débutant au deuxième nucléotide +3 : lecture des triplets débutant au troisième nucléotide. De plus, l'adn étant formé de deux brins antiparallèles, la protéine synthétisée sera différente selon le brin transcrit en ARNm (ARNm synthétisé dans le sens 5 3 et traduit dans le même sens). Il fallait faire intervenir aussi la notion de phase ouverte de lecture (Open Reading Frame, ou ORF, en anglais) : séquence d'adn délimitée par un codon START et un codon STOP. On recherche les ORF selon les 6 phases de lecture possibles. QUESTION C3 Les programmes BLAST (Basic Local Alignment Search Tool ) comparent des séquences et calculent la signification statistique des concordances. Les régions dont les séquences sont similaires sont révélées en se basant sur le principe de parcimonie, c'est-à-dire en considérant le minimum de changements en insertion, suppression, ou substitution qui séparent deux séquences. Pour qualifier et quantifier la similitude entre séquences, un score est calculé. Ce score repose sur un système qui permet d'attribuer un score élémentaire pour chaque position lorsque les séquences sont éditées l'une sous l'autre. Exemple d'alignement : ATTCGCCGGTGTACTGCA-C-TGGCATCGTTGAC ::::::::: : :: ::: : ::::::::::::: ATTCGCCGG-G-ACCGCATCATGGCATCGTTGAC : identité à une position (le score augmente), - insertion/délétion (le score diminue). Les programmes BLAST sont utilisés pour inférer des relations fonctionnelles ou évolutives entre séquences ou pour identifier des membres de familles de gènes. QUESTION C4 Intérêt fondamental : le cdna, obtenu à partir de l ARNm transcrit, ne contient pas les séquences introns donc on peut chercher ses traductions possibles en séquences protéiques. Limites : essentiellement techniques. L'obtention parcellaire non représentative des ARNm (tous les ARNn ne sont pas 3 poly A ). Il peut toujours exister des gènes très peu exprimés ou exprimés uniquement dans un tissu bien particulier à un instant précis du développement et qui échapperaient ainsi à l étude. QUESTION C5 On construit une sonde marquée qui hybridera spécifiquement les transcrits ARNm de CUT1. L'hybridation in situ conduit manifestement au développement d'un précipité rouge. La région cuticulaire de la tige est fortement marquée, a contrario le signal dans la région centrale de la racine est en comparaison très faible. Conclusion : les ARNm de CUT1 sont accumulés de façon marquée au niveau cuticulaire, une transcription élevée de CUT1 est caractéristique au niveau cuticulaire de la tige. QUESTION C6 On choisit des enzymes de restriction qui vont «encadrer» le gène CUT1 lors de la phase d hydrolyse de restriction de l ADN génomique préparé (les enzymes choisis ne doivent pas hydrolyser CUT1). Si le gène CUT1 est simple copie, pour chaque enzyme, on obtiendra normalement une longueur de fragment unique et caractéristique hybridée par la sonde (si les conditions de stringence sont suffisamment fortes). QUESTION C7 26
Le point de vue historique était important. La notion d'unité fonctionnelle d'hérédité, notion non moléculaire, pouvait être discutée. On pouvait terminer par une définition moléculaire «moderne» simple du type : Unité physique et fonctionnelle fondamentale de l'hérédité. Un gène est une séquence ordonnée de nucléotides (ADN ou ARN) situés sur un point précis (locus) d'une molécule génomique (chromosome eucaryote, chromosome bactérien, plasmide, génome ARN ou ADN viral) donné et qui code pour un produit spécifique, par exemple une protéine ou une molécule d'arn (ARNt ou ARNr). QUESTION C8 En BTS biotechnologie un enseignant tente d inculquer des connaissances fondamentales aux élèves, par exemple «un promoteur constitutif fort (comme le promoteur camv 35S) permet une transcription non régulée continue et important du gène associé». L expérience proposée ici est en contradiction et les élèves risquent d être déstabilisés. Intérêt pédagogique : il est important dans un enseignement de niveau BTS de montrer aux élèves que les connaissances d'un instant ne sont pas un corpus dogmatique. Un scientifique doit savoir se montrer ouvert devant les faits et savoir que la science progresse par réfutation/complexification (les aspects sociaux, politiques, historiques étant ici hors sujet). QUESTION C9 Manifestement les plantes de phénotype sauvage (à la tige recouverte de cires) ont un pouvoir de réflexion de la lumière très élevé devant celui des plantes de phénotype «tige dépourvue de cires» (cires-). En éclairage intense blanc, les plantes sauvages apparaîtront donc blanche par réflexion intense de la lumière blanche éclairante alors que les plantes cires- apparaîtront vertes (teinte due au spectre d'absorption de la chlorophylle). L aspect microscopique est cohérent avec cette explication. QUESTION D1 Applications industrielles des lipases - Lessives : élimination des triglycérides présents dans les matières grasses en association avec les détergents (nécessité de lipases résistantes à un ph alcalin). - Agro-alimentaire : - Traitement des oléagineux ; - Industrie fromagère : maturation des fromages, notamment bleus ou italiens (le goût piquant est donné par des acides gras à chaîne courte) ; - Synthèse d arômes : esters propioniques, butyriques et caproïques du géraniol et du citronnellol. - Tannerie : élimination des graisses de la laine. - Cosmétologie : élaboration d huile enrichie en 1,2-dioléines. QUESTION D2 1. Le corn steep est une source d azote et de facteurs de croissance. Le Tween 80 est un détergent qui facilite l excrétion des produits de fermentation, ici la lipase, en modifiant la perméabilité membranaire. 2. L électrode de Clark est formée d une cathode de platine et d une anode d argent entre lesquelles est maintenue une ddp d environ 0,7 V. Sous l influence de cette tension, le dioxygène dissous dans la solution de KCl est ionisé en hydroxyle au contact de la cathode. Au contact de l anode il y a formation de AgCl et production de 4 electrons. Il en résulte un courant très faible proportionnel à la concentration en dioxygène du milieu dans lequel baigne l électrode. Ce courant est amplifié et mesuré. Une membrane de Téflon perméable au dioxygène mais imperméable à l eau et aux ions isole la solution de KCl du milieu réactionnel. Comme l électrode consomme un peu de dioxygène, la concentration qui est mesurée dépend de la vitesse de renouvellement du dioxygène sous la membrane. Plus l agitation est grande, plus la température est élevée, plus la vitesse de diffusion est grande et plus la valeur mesurée est élevée. La valeur mesurée doit être inférieure au niveau de saturation du milieu. Tous ces paramètres font qu aucune concentration ne peut être raisonnablement exprimée et les valeurs sont exprimées en pourcentage par rapport à un état initial arbitrairement fixé à 100 %. 27
3. Le milieu choisi doit être un milieu non sélectif permettant la croissance des bactéries et des levures, type Sabouraud (sans ATB) ou gélose trypticase soja. L activité lipolytique pourra être visualisée par la présence de tributyrine et rouge de phénol incorporés dans le milieu (acidification et virage au jaune) ou huile d olive et bleu victoria ( précipité bleu dû à l affinité des acides gras pour le colorant). QUESTION D3 1. La phase exponentielle de croissance est effective entre les temps 4 et 6 heures. µ = (-0,51-(-1,43))/120 = 7.66 10-3 min -1 G = Ln(2) /µ = 90 min Pour plus de précision il convient d avoir d avantage de points entre 2 et 4 heures. 2. Première phase de culture (0 à 12 heures) : aération et agitation du milieu limitées. Le glucose est consommé totalement durant cette phase qui correspond à la phase de croissance de la souche. La souche consomme beaucoup de dioxygène et sa concentration baisse progressivement. Le catabolisme glucidique induit la baisse du ph. La cinétique de disparition du glucose est inversement proportionnelle à la cinétique de croissance de la souche. Dans la seconde phase le milieu est d avantage agité et aéré. La souche a terminé sa croissance (plateau) ; le glucose est épuisé et le métabolisme de la souche s oriente vers la consommation d autres substrats (protéines) en aérobiose (désamination oxydative et décarboxylation) qui provoque une alcalinisation du milieu. 3. La production de lipase débute quand la souche a atteint le plateau, en fin de phase exponentielle. La lipase peut être assimilée à un métabolite secondaire. En fin de «fermentation» l activité «lipase» diminue. Il s agit probablement d une régulation de sa synthèse due à l accumulation de la protéine. 4. Les productivités tiennent compte du temps d occupation du fermenteur. La productivité horaire globale se détermine depuis t = -4 h, temps de préparation du fermenteur compris, jusqu à la fin de la fermentation (24 h). La productivité horaire maximale est déterminée à t = 22 h (production maximale de lipase). Productivité horaire globale = 30/28 = 1,07 U.mL -1.h -1 Productivité horaire maximale = 38/26 = 1,46 U.mL -1.h -1 Sur le plan industriel, la productivité horaire maximale sera privilégiée, le fermenteur sera vidangé à t = 22 h et une autre fermentation pourra être conduite rapidement. 28
EPREUVES ECRITES D ADMISSIBILITE : Deuxième épreuve Sujet Première question A partir d'exemples précis, vous décrirez les différents moyens mis en oeuvre par la cellule pour contrôler et réguler l'activité des enzymes Deuxième question L évolution des techniques d identification, depuis l identification phénotypique jusqu à l identification moléculaire, a modifié l approche de la taxonomie bactérienne. Vous exposerez les principes et les techniques de l'identification phénotypique, les cibles et les moyens de l'identification moléculaire. Vous discuterez de l'évolution de la taxonomie bactérienne et de la classification actuelle. Troisième question Les communications cellulaires. Après avoir défini les grandes classes de récepteurs membranaires de surface, vous développerez les caractéristiques et le fonctionnement des voies de signalisation qu ils contrôlent. Rapport sur la seconde épreuve d'admissibilité établi par J. Cnokaert ; J-Y. Daniel ; F. Guillet, C.Tellier Résultats de l épreuve Candidats ayant composé 56 Moyenne de l épreuve : 6,63 Note la plus élevée : 16,5 Notes supérieurs ou égales à 12 : 3 Notes comprises entre 10 et 12 : 8 Notes comprises entre 8 et 10 : 6 Notes comprises entre 6 et 8 : 15 Notes inférieures à 6 : 24 Première question Le sujet se limitait à la régulation de l activité des enzymes. Il était donc inutile de rappeler les notions de structure des protéines et de mécanismes d action des enzymes. L introduction devait présenter l importance de la régulation et du contrôle de l activité des enzymes pour la cellule (adaptation à l environnement, économie d énergie, maintien des conditions hors équilibre ), avant d aborder la présentation générale des moyens mis en œuvre. Une réflexion sur les aspects spatio-temporels de cette régulation (mécanisme de régulation immédiate, à plus long terme, importance de la compartimentation cellulaire) était attendue à ce niveau, et pouvait servir de fil conducteur à l organisation du contenu. Un premier chapitre traitant des phénomènes de régulation immédiate (de la ms à la s) devait permettre de présenter tous les mécanismes impliquant une interaction non-covalente avec l enzyme. 29
Les mécanismes de régulation les plus simples, tels que l effet de la concentration en substrat ou d inhibiteurs réversibles, ont souvent été oubliés (la plupart des candidats semblent ignorer l existence des anti-protéases!). La régulation par allostérie, et son intervention dans les mécanismes de rétrocontrôle, a généralement été bien traitée et illustrée avec des exemples pertinents (phosphofructokinase, glycogène phosphorylase ). La deuxième partie pouvait regrouper les mécanismes de régulation impliquant une modification covalente de la structure de l enzyme. Curieusement, aucun candidat n a mentionné la différence essentielle entre cette régulation de type «tout ou rien» et celle traitée dans la première partie de type progressive. Les mécanismes d activation de zymogènes et de régulation par phosphorylation/déphosphorylation ont généralement été bien illustrés. L intérêt de ce mode de régulation dans les mécanismes d amplification au niveau de cascades enzymatiques pouvait être présenté. Certains candidats ont mentionné très justement que d autres modifications posttraductionnelles (ADP ribosylation, glycosylation, ) pouvaient intervenir dans le contrôle de l activité enzymatique. L importance de la compartimentation dans le contrôle de l activité enzymatique pouvait être évoquée à ce niveau dans la mesure où les modifications post-traductionnelles jouent un rôle fondamental dans l adressage des protéines. Dans une troisième partie, il était possible d aborder, sans les détailler, les mécanismes de régulation à long terme impliquant d une part le contrôle de l expression des gènes et d autre part le contrôle de la dégradation des protéines (ce dernier point semble ignoré de la plupart des candidats). Beaucoup de candidats ont développé exagérément cette partie au détriment des aspects précédents. Une présentation approfondie de ces mécanismes, régulant la quantité de protéines présente dans la cellule, mais non directement l activité des protéines, était hors sujet. En conclusion, la plupart des candidats ont montré qu ils avaient des connaissances dans le sujet proposé, mais beaucoup de présentations ont souffert d un manque d organisation et de structuration. Bien que le sujet insistait sur l illustration des connaissances exposées par des exemples précis, très souvent ceux-ci étaient absents. Le jury tient aussi à rappeler qu un schéma précis et bien légendé remplace souvent avantageusement plusieurs lignes de texte. Deuxième question Le sujet demandait de faire le lien entre l évolution de la taxonomie et les techniques de l identification bactérienne. Aussi, était-il nécessaire en introduction de définir ces notions afin de montrer comment les progrès technologiques, notamment dans le domaine de la biologie moléculaire, contribuent à faire évoluer la classification. Il était utile de souligner également les difficultés rencontrées pour classer les bactéries, du fait de l absence de définition précise des rangs hiérarchiques et du caractère dynamique au sens évolutif du terme de cette science (taxonomique). Le plan pouvait s articuler assez simplement autour de trois parties. Une première partie consacrée aux bases de l identification phénotypique devait permettre aux candidats de mobiliser de nombreuses connaissances acquises à l occasion des travaux pratiques de microbiologie. En effet, après avoir rappelé la nécessité d établir un système de référence sous la forme d une banque de données décrivant le choix des souches et la liste des caractères phénotypiques (morphologiques, biochimiques, immunologiques, culturaux, physiologiques, environnementaux ), il était intéressant de montrer les différentes approches de l identification phénotypique (galerie traditionnelle et clefs dichotomiques, méthodes probabilistes) puis d indiquer comment ces caractères ont été utilisés pour classer les bactéries (stratégies de comparaison, établissement de dendogrammes ). La deuxième partie demandait de faire le point sur les outils et les cibles de l identification moléculaire et leur relation avec l évolution de la taxonomie. Dans ce cadre, on pouvait présenter les apports de la biologie moléculaire à l origine de l évolution de la classification (GC%, hybridations, séquençage de l ARN 16S) puis indiquer les techniques spécifiques développées pour l identification (PCR, RFLP, profils protéiques ). Enfin, une troisième partie devait faire le point sur la classification actuelle des bactéries en montrant d une part la volonté de maintenir le système binomial fondé principalement sur les caractères phénotypiques et d autre part les conséquences de l avènement de la biologie moléculaire sur ce 30
système. Un point sur les différents rangs hiérarchiques actuellement utilisés allant du domaine (Archaeabacteria et Eubacteria) à la notion d espèce, de sous-espèce voire de rang inférieur (pathotype, lysotype ) était attendu. Dans l ensemble, les candidats ont présenté des connaissances précises sur certains aspects du sujet mais rares ont été ceux qui ont mis en relation les différentes parties pour présenter un ensemble cohérent. Quelques techniques particulières de biologie moléculaire ont été parfois extrêmement développées au détriment d une approche plus globale demandée par le sujet Troisième question Sujet classique, de type question de cours, traité dans tous les manuels recommandés pour la préparation de cette épreuve. Le jury attendait des candidats qu ils décrivent les récepteurs canaux, les récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G hétérotrimériques, et les récepteurs à un domaine transmembranaire couplés à une activité enzymatique. A chacun de ces types de récepteur devait être associées différentes voies de signalisation connues, Dans le cas des récepteurs canaux, les mécanismes contrôlant leur activation et les conséquences de cette activation sur la polarité des membranes et l activation des synapses. Pour les récepteurs à sept domaines transmembranaires, les voies passant par l activation de l adélynate cyclase et la protéine kinase A ou par l activation de la phospholipase Cb qui clive des phosphoinositides en diacylglycérol et IP3 eux même à l origine d une signalisation intracellulaire via la protéine kinase C et la libération dans le cytosol du Ca 2+ du réticulum endoplasmique. Pour les récepteurs à un domaine transmembranaire, il fallait établir la différence entre ceux qui possèdent une activité enzymatique propre au niveau de leur domaine intracellulaire et ceux qui sont associés à une enzyme cytoplasmique. Ensuite, il fallait décrire l activation de la voie des MAP kinases dans le premier cas et la signalisation Jak-STAT dans le second. Les candidats particulièrement bien préparés pouvaient signaler qu il existe d autre types de signalisation : les activités enzymatiques associées aux récepteurs sont principalement des tyrosines kinases mais que l on connaît des voies de signalisation utilisant récepteurs couplés à d autres activités enzymatiques. Enfin, il existe des voies reposant sur des hydrolyses spécifiques de protéines cellulaires. En conclusion, les candidats devaient insister sur les interrelations qui existent entre toutes ces voies, et montrer qu elles sont des facteurs puissants d intégration d une cellule dans un organisme. Ils pouvaient terminer en indiquant des pathologies liées au dysfonctionnement de ces voies de signalisation 31
EPREUVES D ADMISSION AGREGATION DE BIOCHIMIE - GENIE BIOLOGIQUE CONCOURS INTERNE Session 2007 EPREUVE PRATIQUE Durée : 8 heures Valorisation des coproduits de l industrie agroalimentaire Le lactosérum est l un des coproduits de l industrie agroalimentaire. L industrie laitière produit annuellement environ 650 000 tonnes de poudre de lactosérum. Classiquement deux types de lactosérum sont produits suivant le traitement du lait : acide et doux. Le lactosérum acide peut être utilisé directement en alimentation animale, alors que le lactosérum doux est transformé par concentration, séchage, ultrafiltration... Dans cette dernière technique, deux fractions sont obtenues. Le rétentat, riche en protéines, est utilisé en alimentation animale ou humaine, tandis que le perméat à haute teneur en lactose est valorisé pour des applications en pharmacie ou en alimentation humaine. Le Corn Steep est un autre coproduit de l industrie agroalimentaire. L extraction de l amidon et du gluten de maïs comporte une première étape de trempage destinée à ramollir le grain. Durant cette opération qui dure 30 à 40 heures à 50 C, 6% de la matière sèche du grain s échappe dans l eau de trempage, alors commercialement appelée "Corn Steep Liquor". Les produits de valorisation de cette dernière serviront de base en alimentation animale, ou encore de milieux dans les fermentations après concentration. Le sujet propose lors de cette séance de travaux pratiques : - le contrôle, préalable à son utilisation, d une micropipette par méthode photométrique ; - une ultrafiltration du lactosérum suivie d un dosage des protéines ainsi que d un dosage de la vitamine B1 par fluorimétrie ; - l étude de l'influence d'un paramètre physico chimique sur la croissance et le métabolisme d'une levure, Pichia ohmeri, productrice de polyols, cultivée sur un milieu Corn Steep - glucose. 32