MARQUAGE AU FLUOR 18 DE LA MÉTHIONINE POUR L'IMAGERIE PAR ÉMISSION DE POSITONS

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1 MINISTÉRE DE L'ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR ET DE LA RECHERCHE ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES Sciences de la Vie et de la Terre MÉMOIRE Présenté par : Delphine VIMONT pour l obtention du diplôme de l École Pratique des Hautes Études MARQUAGE AU FLUOR 18 DE LA MÉTHIONINE POUR L'IMAGERIE PAR ÉMISSION DE POSITONS soutenu le 29 octobre 2010 devant le jury suivant : M. VEYRET Bernard (DR-EPHE) - Président M. LE BARS Didier (MCU-PH) - Rapporteur M. LOISEAU Hugues (PU-PH) - Examinateur Mémoire préparé sous la direction de : Mme SZLOSEK-PINAUD Magali (MCU) (Tutrice scientifique) Laboratoire de Radiochimie Université Bordeaux 2 ISM, UMR-CNRS 5255, Groupe Synthèse-Molécules bioactives Université Bordeaux1 351, Cours de la libération TALENCE cedex [email protected] et de Mme CATHELINE Gwénaëlle (MCU) (Tutrice pédagogique) Laboratoire de Neuroimagerie intégrative CNRS UMR Imagerie Moléculaire et Fonctionnelle 146, rue Léo Saignat - Case BORDEAUX CEDEX [email protected] EPHE (Sciences de la Vie et de la Terre) EPHE Banque de Monographies SVT 1

2 ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE MARQUAGE AU FLUOR 18 DE LA MÉTHIONINE POUR L'IMAGERIE PAR ÉMISSION DE POSITONS VIMONT Delphine 29 Octobre 2010 Depuis plusieurs années, la Tomographie par Emission de Positons (TEP) est devenue un outil performant pour visualiser de nombreux processus biochimiques ainsi que leurs dysfonctionnements in vivo, chez l homme et chez l animal. Son principe repose sur la détection in vivo de molécules caractéristiques de ces processus portant un élément radioactif. Les radioéléments les plus fréquemment utilisés actuellement sont le fluor 18 et le carbone 11. Le développement de l'imagerie TEP, en particulier en oncologie, s accompagne de nombreux travaux de recherches dans le domaine des radiopharmaceutiques, dans le but d améliorer le diagnostic et de déterminer les patients susceptibles de répondre à un traitement particulier et de suivre l efficacité de ce traitement. Si l Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) est la technique de choix pour la détection des tumeurs cérébrales, elle ne permet pas une délimitation précise de ses contours. En revanche, la méthionine, marquée au carbone 11 s est révélée efficace pour l'imagerie TEP, dans la délimitation précise du volume des tumeurs cérébrales, grâce à un excellent rapport signal sur bruit. En effet les cellules cancéreuses induisent une augmentation de la synthèse protéique et donc augmentent l incorporation intracellulaire de la méthionine, ce qui aide à mieux définir le périmètre de la tumeur à irradier. Cependant la [ 11 C]-méthionine ne peut pas être utilisée en routine clinique du fait de la décroissance rapide du radioélément carbone 11 (20 min). C est dans ce contexte que nous avons cherché à développer une méthode de fluoration d un analogue de la méthionine. En effet, le fluor 18 est un radioélément dont la décroissance est plus lente (109 min). Son utilisation pour le radiomarquage de la méthionine permettra de fournir plus facilement en radiopharmaceutiques, des services de médecine nucléaire distants du lieu de production. Les résultats obtenus lors de ce travail de recherche ont montrés que malgré la modification de la structure chimique de la méthionine ces propriétés biologiques n étaient pas modifiées. Les rendements de synthèses obtenus sont encourageants pour envisager, si les tests in vivo confirment son efficacité dans l imagerie des tumeurs cérébrales, une utilisation de cette molécule pour pallier à la méthionine marquée au carbone 11. MOTS-CLÉS : Tomographie par Emission de Positons, Oncologie, Fluor 18, Méthionine, Radiomarquage. EPHE Banque de Monographies SVT 2

3 SOMMAIRE ABRÉVIATIONS A : INTRODUCTION ET POSITION DU PROBLÈME LA TOMOGRAPHIE PAR ÉMISSION DE POSITONS I. GÉNÉRALITÉS I.1 Principe I.2 Les émetteurs β II. TEP ET IMAGERIE CHEZ L'HOMME II.1 Mise en place d un examen TEP II.3.1 Le 2-désoxy-2-[ 18 F]fluoro-D-glucose ([ 18 F]FDG) a) Les propriétés biologiques du [ 18 F]FDG b) La synthèse du [ 18 F]FDG II.3.2 La 6-[ 18 F]fluoro-L-DOPA ([ 18 F]FDOPA) a) Les propriétés biologiques de la [ 18 F]FDOPA b) Synthèse de la [ 18 F]FDOPA II.3.3 La [ 18 F]fluorocholine ([ 18 F]FCH) a) Les propriétés biologiques de la [ 18 F]FCH b) Synthèse de la [ 18 F]FCH II.4.1 La 2 -désoxy-2 -[ 18 F]fluorothymidine ([ 18 F]FLT) a) Les propriétés biologiques de la [ 18 F]FLT b) Synthèse de la [ 18 F]FLT II.4.2 Le [ 18 F]-fluoromisonidazole ([ 18 F]FMISO) a) Les propriétés biologiques du [ 18 F]FMISO b) Synthèse du [ 18 F]FMISO III. CONCLUSION LA MÉTHIONINE, UN MARQUEUR DES TUMEURS CÉRÉBRALES I. GÉNÉRALITÉS I.1 Acides aminés et protéines I.2 La méthionine II. LA MÉTHIONINE AU CARBONE II.1 Généralités sur le carbone II.2 Synthèse de la méthionine marquée au 11 C EPHE Banque de Monographies SVT 3

4 II.3 Intérêt de l utilisation de la méthionine fluorée B : MISE AU POINT D'UN NOUVEAU TRACEUR FLUORÉE : LA FLUOROMÉTHIONINE FLUORATION DE LA MÉTHIONINE I. STRATÉGIE ENVISAGÉE I.1 Substitution nucléophile d'un groupement -NO I.2 Substitution nucléophile avec le groupement silylé I.3 Les essais biologiques II. MODULE DE SYNTHÈSE : LE Fx F-N III. LES DIFFÉRENTES ÉTAPES DE LA RADIOSYNTHÈSE III.1 Stratégies envisagées IV. RADIOMARQUAGE AVEC DIVERS PRÉCURSEURS IV.1 Méthionine para-nitro : 4-nitrobenzamido-méthionine IV.1.1 Synthèse du précurseur 51 : 4-nitrobenzamido-méthionine IV.1.2 Radiomarquage de la 4-[ 18 F]fluorobenzamido-méthionine IV.2 Méthionine SiH : 4-(di-tert-butylsilanyl)benzamido-méthionine IV.2.1 Synthèse du précurseur 60 : 4-(di-tert-butylsilanyl)benzamido-méthionine IV.2.2 Radiomarquage de la 4-(di-tert-butyl([ 18 F]fluoro)silyl)benzamido-méthionine IV.3 Méthionine SiOH : 4-(di-tert-butyl(hydroxy)silyl)benzamido-méthionine IV.3.1 Synthèse du précurseur 62 : 4-(di-tert-butyl(hydroxy)silyl) benzamido-méthionine IV.3.2 Radiomarquage de la 4-(di-tert-butyl([ 18 F]fluoro)silyl)benzamido-méthionine IV.3.3 Conclusion V. OPTIMISATION DES CONDITONS DE FLUORATION SUR LA MÉTHIONINE SiOH V.1 Choix du solvant de réaction V.2 Influence de la température et du temps de fluoration V.3 Influence de l acide acétique V.4 Influence de la quantité de précurseur V.5 Radioactivité spécifique V.6 Conclusion VI. PURIFICATION DU PRODUIT VI.1 Étapes de purification VI.1.1 CLHP préparative VI.1.2 Cartouche Sep-pak C VI.1.3 Analyse du produit final EPHE Banque de Monographies SVT 4

5 VI.2 Identification de l impureté VI.2.1 Synthèse du sulfoxyde "froid" [ 19 F] : 4-(di-tert-butyl(fluoro)silyl)benzamido-méthionine sulfoxyde VI.2.2 Synthèse de la sulfone : 4-(di-tert-butyl(fluoro)silyl)benzamido-méthionine sulfone VI.2.3 Conclusion VII. ESSAIS DE STABILITÉ VII.1 Acide ascorbique VII.2 Éthanol VII.3 Analyse de la pureté du produit par Chromatographie sur Couche Mince (CCM) VII.4 Conclusion LES PREMIERS ESSAIS BIOLOGIQUES I. LA MÉTHIONINE SiOH I.1 La cytotoxicité de la L-Si-[ 19 F]méthionine I.1.1 Essais au MTT sur les cellules BMG, U-87 MG et C I.1.2 Essai de macrocolonie I.1.3 Résultats I.2.1 Trans-stimulation de l efflux de [ 35 S]L-méthionine I.2.2 Résultats II. LA SULFONE II.1.1 Trans-stimulation de l efflux de [ 35 S]L-méthionine II.1.2 Résultats C : CONCLUSION ET PERSPECTIVES EPHE Banque de Monographies SVT 5

6 ABRÉVIATIONS [ 18 F]FCH : [ 18 F]fluorocholine [ 18 F]FDG : 2-désoxy-2-[ 18 F]fluoro-D-glucose [ 18 F]FDOPA : 6-[ 18 F]fluoro-L-DOPA [ 18 F]FLT : 2 -désoxy-2 -[ 18 F]fluorothymidine [ 18 F]FMISO : [ 18 F]fluoromisonidazole [ 18 F]MPPF : 4-[ 18 F]fluoro-N-[2-[4-(2-méthoxyphenyl)-1-pipérazinyl]ethyl]-N-(2- pyridyl)benzamide ACN : acétonitrile ADN : acide 2 -désoxyribonucléique AMM : autorisation de mise sur le marché ARN : acide ribonucléique ATP : adénosine triphosphate BPF : bonnes pratiques de fabrication Bq : becquerel CCM : chromatographie sur couche mince CDMT : chlorodiméthoxytriazide CLHP : chromatographie liquide haute pression DCM : dichlorométhane DMF : N,N-diméthylformamide DMSO : diméthylsulfoxyde DMTr : diméthoxytrityle EOB : end of beam (fin de tir) EOS: end of synthesis (fin de synthèse) HCl : acide chlorhydrique IRM : imagerie par résonance magnétique K : kryptofix (4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosane) kev : kilo électron-volt MTT : 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl bromure de tetrazolium N A : nombre d'avogadro EPHE Banque de Monographies SVT 6 6

7 NMM : N-méthylmorpholine RAS : radioactivité spécifique RMN : résonance magnétique nucléaire RRC : rendement radiochimique corrigé SAM : S-adénosyl méthionine t.a. : température ambiante TEMPO : tétraméthyl pipéridine-1-oxyl TEP : tomographie par émission de positons THF : tétrahydrofurane EPHE Banque de Monographies SVT 7 7

8 A : INTRODUCTION ET POSITION DU PROBLÈME EPHE Banque de Monographies SVT 8

9 INTRODUCTION Depuis plusieurs années, la Tomographie par Emission de Positons (TEP) est devenue un outil performant pour visualiser de nombreux processus biochimiques ainsi que leurs dysfonctionnements in vivo, chez l homme et chez l animal. Son principe repose sur la détection in vivo de molécules caractéristiques de ces processus portant un élément radioactif. Les radioéléments les plus fréquemment utilisés actuellement sont le fluor 18 et le carbone 11. Ces radioéléments doivent être fixés chimiquement sur la molécule spécifique du processus biochimique de façon rapide et avec une radioactivité spécifique élevée, pour donner un radiotraceur détectable in vivo par imagerie TEP. Le développement de ce type d imagerie, en particulier en oncologie, s accompagne de nombreux travaux de recherches dans le domaine des radiopharmaceutiques, dans le but d améliorer le diagnostic et de déterminer les patients susceptibles de répondre à un traitement particulier et de suivre l efficacité de ce traitement. Si l Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) est la technique de choix pour la détection des tumeurs cérébrales, elle ne permet pas une délimitation précise de ses contours. Il reste donc difficile, pour le radiothérapeute, de définir précisément la zone du cerveau à irradier. Or le pronostic de tumeurs cérébrales de bas grade est très dépendant de l "élimination" la plus complète possible des cellules tumorales, tout en limitant au minimum le volume irradié pour éviter des séquelles fonctionnelles aux patients. Depuis plusieurs années, un acide aminé : la méthionine, marquée au carbone 11 s est révélée efficace, dans la délimitation précise du volume des tumeurs cérébrales, grâce à un excellent rapport signal sur bruit. En effet les cellules cancéreuses induisent une augmentation de la synthèse protéique et donc augmentent l incorporation intracellulaire de la méthionine, ce qui aide à mieux définir le périmètre de la tumeur à irradier. Cependant la [ 11 C]méthionine ne peut pas être utilisée en routine clinique du fait de la décroissance rapide du radioélément, carbone 11 (20 min). C est dans ce contexte que nous avons cherché à développer une méthode de fluoration d un analogue de la méthionine. En effet, le fluor 18 est un radioélément dont la décroissance est plus lente (109 min). Son utilisation pour le radiomarquage de la méthionine permettra de fournir plus facilement en radiopharmaceutiques, des services de médecine nucléaire distants du lieu de production. L'objectif de notre travail à été de développer une méthode de marquage de la méthionine avec du fluor 18. Ainsi dans ce mémoire avant d'exposer notre travail de recherche, nous présenterons le principe de l imagerie TEP, les différents radiopharmaceutiques utilisés actuellement dans les services de médecine nucléaire, nous évoquerons également l utilisation de la méthionine marquée au carbone 11. Puis nous présenterons dans la partie B, le travail de recherche en radiochimie réalisé au cours de ce mémoire, ainsi que la validation biologiques réalisées en collaboration avec Anil Mishra. Enfin nous discuterons des perspectives ouvertes pour ce nouveau traceur de l'imagerie des tumeurs cérébrales. EPHE Banque de Monographies SVT 9 9

10 LA TOMOGRAPHIE PAR ÉMISSION DE POSITONS EPHE Banque de Monographies SVT 10

11 LA TOMOGRAPHIE PAR ÉMISSION DE POSITONS I. GÉNÉRALITÉS I.1 Principe La Tomographie par Emission de Positons (TEP) est une technique d imagerie in vivo, fonctionnelle non invasive. Elle repose sur l utilisation de molécules marquées par un radioélément, émetteur de positons β +, appelées radiotraceurs, ou radiopharmaceutiques s ils sont injectés à l'homme. Grâce à la détection du radioélément émetteur β +, il est possible de suivre leur distribution in vivo au cours du temps aussi bien chez l homme que chez l animal. La TEP permet ainsi de mettre en évidence des phénomènes biologiques au niveau moléculaire tels que le métabolisme énergétique, la division cellulaire ou encore l activité de macromolécules biologiques (récepteurs, enzymes, anticorps). Elle peut également apporter des données concernant la pharmacocinétique et le mode d action d un principe actif, facilitant ainsi son développement et la détermination de la dose minimum efficace. 1 L image obtenue en TEP repose sur la détection, par une caméra, de paires de photons γ de 511 KeV, émis en coïncidence (à 180 l un de l autre). Ceux-ci sont produits lors du phénomène d annihilation résultant de la rencontre entre une particule β + (ou e + ), générée au cours de la désintégration du radioélément, et d un électron de la matière (e - ). Les coïncidences sont converties en images tomographiques grâce à l utilisation de techniques de reconstruction mathématique. L enregistrement de millions de coïncidences est nécessaire pour reconstruire une image TEP tridimensionnelle. Les contraintes de la TEP tiennent principalement à la courte période, caractérisant les radionucléides utilisés, et au coût engendré par la production et la radiosynthèse des radiopharmaceutiques. Ainsi, il est nécessaire que la synthèse du radiopharmaceutique, son injection au patient ainsi que l acquisition des images TEP soient réalisées dans un temps très court : inférieur à 8 demi-vies en moyenne (15 heures pour le fluor 18 et un peu moins de 3 heures pour le carbone 11). Néanmoins, la courte demi-vie des radioisotopes représente également un avantage car elle limite l irradiation du patient et les quantités de radiopharmaceutiques injectées ( nmoles) grâce à une radioactivité spécifique (RAS) très élevée. De plus, la TEP est une technique d imagerie in vivo présentant une bonne résolution spatiale puisqu elle est théoriquement de l ordre de 3-4 mm. 2 Longtemps limitée à la recherche chez l homme, depuis une dizaine d année elle s est largement répandue en routine clinique, particulièrement en oncologie. En 2010, la France compte 21 cyclotrons à usage médical et prés de 45 centres médicaux équipés de caméra TEP. I.2 Les émetteurs β + Prés de 40% des atomes constitutifs des molécules du vivant possèdent des atomes pour lesquels il existe des isotopes émetteurs β +, on peut citer en particulier le 11 C, 13 N et 15 O. Ils peuvent être produits par réaction nucléaire au sein d un cyclotron. EPHE Banque de Monographies SVT 11 11

12 LA TOMOGRAPHIE PAR ÉMISSION DE POSITONS Comme tout radioélément, les émetteurs β + sont caractérisés par : Un temps de demi-vie ou période (temps au bout duquel la moitié des atomes sont désintégrés) calculé à partir de la constante de désintégration λ, caractéristique du noyau radioactif considéré. Un mode de décroissance. Les émetteurs β + se désintègrent en émettant un positon, un neutrino (n) et l élément situé à gauche dans la classification périodique des éléments. Par exemple, le carbone 11 se désintègre en bore 11 et le fluor 18 en oxygène 18. Une radioactivité spécifique (RAS) qui est le nombre de désintégrations par unité de temps et par mole. Elle est inversement proportionnelle au temps de demi-vie du radioélément. Les émetteurs de positons ont donc une RAS élevée. En raison de leur période trop courte, la chimie impliquant l oxygène 15 et l azote 13 reste très limitée à l inverse de celle du carbone 11 et du fluor 18, qui sont aujourd hui les deux éléments les plus utilisés pour l imagerie TEP. Il y a de plus en plus d intérêt pour le gallium 68 produit à partir d un générateur. Il est particulièrement attractif pour les services de médecine nucléaire qui n ont pas d accès direct au fluor 18 produit par des cyclotrons pour effectuer des radiosynthèses. Il n est, en effet, pas envisageable d attendre une à deux heures de décroissance pendant le transport du fluor 18 avant l étape de radiosynthèse, alors que les rendements de radiosynthèse de nombreux traceurs TEP, autres que le FDG, sont souvent faibles. Ainsi, le générateur 68 Ge/ 68 Ga permet de disposer sur place et en permanence d un émetteur de positons dans les services de médecine nucléaire. La présence d atomes de carbone dans les molécules naturelles et pharmaceutiques font du carbone 11 un émetteur de positons très attractif. En effet, les molécules marquées au carbone 11 se comporteront de la même façon, biologiquement et chimiquement que leurs homologues non-radiomarqués. De plus, la chimie du carbone étant très vaste, elle offre la possibilité d un large éventail de réactions pour introduire un atome de 11 C. Néanmoins, du fait de sa courte demi-vie (t 1/2 = 20,4 min), le radiomarquage au 11 C doit être réalisé à la dernière étape de synthèse. La radiosynthèse multi-étapes sera donc difficilement envisageable. Concernant le fluor 18, les molécules organo-fluorées naturelles biologiquement actives sont peu nombreuses. Cela implique l'incorporation d'un atome de fluor sur une molécule n en contenant pas initialement ; soit par fluoration directe soit en faisant intervenir un groupement prosthétique (comme par exemple un groupement alkyl ou aryl synthétisé en quelques étapes) contenant un atome de fluor. Les effets de cette modification sur les propriétés biologiques devront être étudiés et ces propriétés devront être comparées à celles de la molécule biologique non fluorée. EPHE Banque de Monographies SVT 12 12

13 LA TOMOGRAPHIE PAR ÉMISSION DE POSITONS II. TEP ET IMAGERIE CHEZ L'HOMME II.1 Mise en place d un examen TEP Dans sa globalité l examen TEP se déroule en 5 étapes : 1) Le cyclotron génère le radioélément nécessaire à la réaction nucléaire. Dans le cas du 11 C seuls les précurseurs primaires ( 11 CH 4, 11 CO 2 ) sont produits. 2) Le radiochimiste synthétise le radiochimique adapté en incorporant le radioélément par réaction chimique avec un ligand choisi pour sa pertinence à visualiser le phénomène biologique d'intérêt. La radiosynthèse, la purification et le conditionnement sont réalisés dans une cellule blindée au plomb. 3) Le radiopharmacien valide que le radiopharmaceutique a été fabriqué dans les conditions de bonnes pratiques de fabrication (BPF) et accepte son expédition au vu des résultats du contrôle qualité. 4) Le médecin nucléaire injecte le traceur radioactif au patient et le place au centre de la couronne de détecteurs de la caméra TEP qui détectent les rayonnements γ émis à la suite de la désintégration du radioélément. 5) Le traitement informatique des enregistrements des détecteurs permet d élaborer des images tridimensionnelles de la zone où le radiopharmaceutique s est accumulé. Le médecin peut alors analyser les images dans un contexte clinique. La TEP est utilisée par différentes spécialités de la médecine : En oncologie pour le diagnostic et le bilan d'extension de tumeurs. L accumulation et la métabolisation du radiopharmaceutique au sein de l organisme permet de visualiser la présence, ainsi que la progression, des cellules tumorales. 3,4,5 En cardiologie pour mettre en évidence la viabilité ou l'ischémie myocardique. 6,7,8 En neurologie pour étudier des neuropathologies telles que la maladie d Alzheimer ou de Parkinson, ainsi qu'en psychiatrie. 9,10 II.2 Conditions requises pour l exploitation optimale d un radiopharmaceutique pour l'imagerie TEP Les radiopharmaceutiques doivent répondre à plusieurs exigences : EPHE Banque de Monographies SVT 13 13

14 LA TOMOGRAPHIE PAR ÉMISSION DE POSITONS L échange d un isotope stable par son radioisotope ne doit pas modifier l activité in vivo de la molécule. Néanmoins, si on réalise l incorporation d un radioélément dont l'isotope stable n est pas présent initialement dans la molécule, le radiochimique devra être étudié tout d abord in vitro afin de déterminer son affinité et sa spécificité pour la cible considérée. Le radiochimique doit présenter une sélectivité et une affinité élevées vis-à-vis de sa cible. Sa stabilité et sa toxicité dans les conditions physiologiques doivent être étudiées. Sa métabolisation dans le corps humain par l action d enzymes peut être une limite à son utilisation. En effet, les radiométabolites générés peuvent interférer avec les mesures et donc fausser la quantification du signal. Le radiochimique doit avoir une pharmacocinétique appropriée par rapport à la période du radioisotope. La radioactivité spécifique du radiochimique synthétisé doit être la plus élevée possible afin que les quantités injectées au patient soient les plus faibles. Une injection importante pourra causer une saturation dans le cas de l étude de récepteurs présents en faible quantité. La production du radionucléide par le cyclotron, le temps de synthèse et la pureté radiochimique du radioligand font l objet d optimisation permanente. Pour une utilisation optimale du radiopharmaceutique, le temps qui s écoule entre la production du radionucléide, la synthèse, le contrôle qualité et le conditionnement du radiopharmaceutique ne doivent pas dépasser 3 temps de demi-vie du radioélément. On distingue principalement trois types de radiopharmaceutiques utilisés en médecine nucléaire et particulièrement en TEP pour le diagnostic en fonction de la nature du ligand : de substances endogènes telles que des aminoacides ou peptides, neurotransmetteurs ou hormones, des composés spécialement synthétisés pour réaliser des mesures physiologiques (oxygénation, prolifération cellulaire), des ligands spécifiques de protéines, récepteurs ou inhibiteurs d enzymes. II.3 Les radiopharmaceutiques qui ont une Autorisation de Mise sur le Marché L Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) est une autorisation nationale, européenne ou mondiale pour la commercialisation après évaluation de la qualité, de la sécurité et de l'efficacité d'une spécialité pharmaceutique. Ce document officiel est constitué d'une décision et d'annexes dont le résumé des caractéristiques du produit, la notice et l'étiquetage. (Art. L EPHE Banque de Monographies SVT 14 14

15 LA TOMOGRAPHIE PAR ÉMISSION DE POSITONS du Code de la Santé Publique). L'efficacité d'un radiopharmaceutique est évaluée sur les résultats des essais cliniques de phase 3. A ce jour plus de 600 composés ont déjà été marqués par un émetteur de positons mais seulement trois d entre eux ont reçu une AMM en France afin d être utilisés en routine dans les services de médecine nucléaire pour le diagnostic : le 2-désoxy-2-[ 18 F]fluoro-D-glucose ([ 18 F]FDG), la 6-[ 18 F]fluoro-L-DOPA ([ 18 F]FDOPA) et la [ 18 F]fluorocholine ([ 18 F]FCH). Les autres candidats sont pour l instant utilisés chez l animal ou chez l'homme dans un contexte de recherche clinique. II.3.1 Le 2-désoxy-2-[ 18 F]fluoro-D-glucose ([ 18 F]FDG) a) Les propriétés biologiques du [ 18 F]FDG Le [ 18 F]FDG est un analogue du glucose dont le groupement hydroxyle en position 2 est substitué par un atome de fluor 18. Son comportement in vivo, est similaire à celui de son analogue biologique, le glucose. Il est transporté vers les tissus cibles par le plasma, incorporé dans les cellules et phosphorylé par une hexokinase en position 6. La suite de la métabolisation (conversion glucose/fructose) est alors stoppée du fait de la présence d un atome de fluor 18 à la place du groupement hydroxyle en position 2. Une accumulation du [ 18 F]FDG-6-phosphate, appelée alors impasse métabolique, est donc observée dans la cellule. Un examen par TEP permet de visualiser cette accumulation. Le [ 18 F]FDG est donc un marqueur du métabolisme glucidique cellulaire. En effet le [ 18 F]FDG s accumule dans toutes les cellules dont le métabolisme glucidique est augmenté ce qui est le cas des cellules cancéreuses ou inflammatoires. Le [ 18 F]FDG est donc utilisé en tant que radiopharmaceutique pour le diagnostic en oncologie. Pour cela, il a reçu une AMM en b) La synthèse du [ 18 F]FDG Le [ 18 F]FDG a été synthétisé pour la première fois par Tatsuo Ido et Alfred Wolf en Depuis les méthodes de synthèse ont été constamment optimisées. En 1984, Ehrenkaufer et al. 12 décrivent la synthèse du [ 18 F]FDG par fluoration directe du D-glucal en présence de [ 18 F]- hypofluorite d acétyle avec un rendement radiochimique corrigé de la décroissance (RRC) de 36% et une pureté radiochimique supérieure à 95 %. Le rendement radiochimique corrigé de la décroissance est le rendement chimique de la synthèse. Il prend en compte l activité finale ramenée à l heure de fin de fabrication du radioisotope. Actuellement, le [ 18 F]FDG est synthétisé en routine par substitution nucléophile du 2- triflate-β-mannose tetra-acétylé par le K[ 18 F], suivi de l'hydrolyse des groupements acétate, en 30 minutes avec un RRC de 70% selon la méthode décrite par Hamacher et al. 13 EPHE Banque de Monographies SVT 15 15

16 LA TOMOGRAPHIE PAR ÉMISSION DE POSITONS Le [ 18 F]FDG est considéré comme le radiopharmaceutique de choix pour l évaluation de la tumeur primitive et de ses métastases par TEP, tous types de cancers confondus. Actuellement, plus de 90 % des études TEP en oncologie sont réalisées en utilisant le [ 18 F]FDG. Bien qu il donne des résultats satisfaisants, il présente différentes limitations liées à son manque de spécificité, à l origine de faux positifs. Tout d'abord, certaines cellules saines ou affectées par d autres processus pathologiques (inflammation) consomment également du glucose en grande quantité et seront donc également visibles lors d un examen TEP. De plus, certaines tumeurs ne peuvent pas être détectées, comme les tumeurs cérébrales. En effet, les cellules du système nerveux consomment naturellement beaucoup de glucose et la consommation des cellules tumorales est très faiblement supérieure à celles des cellules normales. Enfin, certaines tumeurs avec un haut potentiel métastatique (cancer de la prostate) incorporent peu de glucose ce qui les rend difficilement détectables par imagerie TEP [ 18 F]FDG. II.3.2 La 6-[ 18 F]fluoro-L-DOPA ([ 18 F]FDOPA) a) Les propriétés biologiques de la [ 18 F]FDOPA La L-DOPA est un précurseur de la dopamine dans les neurones dopaminergiques. C est pourquoi les traceurs fluorés [ 18 F]FDOPA sont utilisés pour visualiser l activité fonctionnelle des ces neurones. En effet, la dopamine est un neurotransmetteur important du système nerveux central. Le dysfonctionnement des neurones dopaminergiques est associé à plusieurs pathologies neurologiques ou psychiatriques. La 6-[ 18 F]fluoro-L-DOPA est donc un traceur particulièrement adapté en neuroimagerie. Par exemple, on observe une diminution de la dopamine due à la dégénérescence des neurones dopaminergiques caractérisant la maladie de Parkinson, et une augmentation de la dopamine dans la schizophrénie. La dopamine est également synthétisée par des neurones du système nerveux périphérique, au départ desquels se développent des tumeurs. Certaines cellules tumorales synthétisent de grandes quantités de dopamine, ce qui oriente les choix thérapeutiques. La 6-[ 18 F]fluoro-L-DOPA a été le premier traceur dopaminergique présynaptique. La première synthèse a été décrite en 1973 par Firnau 14 et les premières imageries chez l homme ont été réalisées en 1983 par Garnett. 15 Depuis elle est indiquée dans le diagnostic du syndrome parkinsonien 16 et des tumeurs neuroendrocrines. Elle a reçu une AMM en France, en mars 2010, pour ces indications. La [ 18 F]FDOPA suit parfaitement les étapes métaboliques de la L-DOPA. De ce fait, la 3- méthoxy-[ 18 F]FDOPA ([ 18 F]3OMFD) ainsi formée pénètre dans le cerveau et est distribuée uniformément. Ceci entraîne une augmentation du bruit de fond et une diminution du contraste compliquant ainsi l analyse des images obtenues. b) Synthèse de la [ 18 F]FDOPA La [ 18 F]FDOPA est synthétisée selon 2 stratégies : 16 EPHE Banque de Monographies SVT 16

17 LA TOMOGRAPHIE PAR ÉMISSION DE POSITONS Par radiofluorodéstannylation : la fluoration est réalisée sur le dérivé stannylé et protégé de la L-DOPA commerciale en présence de fluor électrophile. Une déprotection en milieu acide permet d obtenir la [ 18 F]DOPA avec un RRC de 26 % en 50 minutes à compter de la fin du bombardement. 17 Actuellement, c est la méthode majoritairement utilisée en routine. Par alkylation énantiosélective : en 1994, Lemaire et al. 18 ont décrit l alkylation énantiosélective de l imidazolidinone par l iodure de 2-[ 18 F]fluoro-4,5- diméthoxybenzyle. La [ 18 F]FDOPA est obtenue ensuite par hydrolyse en milieu acide. Cette synthèse est réalisée en 90 minutes avec un rendement radiochimique global corrigé de 23 % et un excès énantiomérique supérieur à 95 %. En 2002, Zhang et al. 19 décrivent la synthèse de la [ 18 F]FDOPA par alkylation énantiosélective en présence d'un agent de transfert de phase chiral élaboré par Lemaire et al. 20 Cette méthode permet d obtenir la [ 18 F]FDOPA en 80 min avec un rendement radiochimique de 15 % et un excès énantiomérique de 98 %. Jusqu'en 2009, Iason était le seul industriel en Europe à détenir une AMM pour la [ 18 F]FDOPA, IBA vient d'obtenir cette dernière en mars II.3.3 La [ 18 F]fluorocholine ([ 18 F]FCH) a) Les propriétés biologiques de la [ 18 F]FCH La choline est un précurseur pour la biosynthèse des phospholipides qui sont des composants essentiels des membranes cellulaires. Les tumeurs malignes caractérisées par un taux de prolifération élevé et une augmentation du métabolisme des composants cellulaires membranaires, présenteront une incorporation accrue de choline. La choline est phosphorylée par la choline kinase (CK) pour donner la phosphorylcholine à l'intérieur des cellules tumorales qui, après plusieurs étapes de biosynthèse, est finalement intégrée dans les phospholipides. 21 Parce que les cellules tumorales ont un taux de prolifération élevé, l'absorption de choline est élevée afin de réaliser la synthèse des phospholipides dans les membranes cellulaires. 22 La [ 18 F]fluorocholine ([ 18 F]FCH) est utile dans les indications où le FDG est peu performant. Les premières études ont porté sur la détection des tumeurs cérébrales 23 mais les résultats actuels de l'imagerie TEP dans cette indication, avec ce radiopharmaceutique, sont discordants. 24 Aujourd hui, les principales études cliniques concernent la prise en charge des cancers de la prostate, à la fois dans le bilan d extension initial et dans le bilan de leurs récidives biologiques. En effet, les performances de la TEP au FDG sont limitées dans cette indication, 25 notamment à cause de la faible activité glycolytique de certains cancers de la prostate et de l excrétion urinaire prédominante du FDG. Le rationnel de l utilisation de la choline dans les EPHE Banque de Monographies SVT 17 17

18 LA TOMOGRAPHIE PAR ÉMISSION DE POSITONS cancers de la prostate est basé sur des études de spectroscopie IRM qui ont montré que les cellules cancéreuses de la prostate contiennent davantage de métabolites de la choline que les cellules normales 26 et que l augmentation de métabolites de la choline est liée à la prolifération cellulaire. 27 À l avenir, d autres indications potentielles de la [ 18 F]fluorocholine devraient émerger pour l imagerie TEP, puisque les métabolites de la choline sont retrouvés en quantité importante dans d autres tumeurs et notamment dans les carcinomes hépatocellulaires (CHC). 28 b) Synthèse de la [ 18 F]FCH La [ 18 F]choline est synthétisée à partir du [ 18 F]fluorobromométhane et de la diméthyléthanolamine par substitution nucléophile, avec une pureté radiochimique supérieure à 98 % et un rendement radiochimique (non corrigé de la décroissance) d'environ %. 29 Une synthèse de [ 18 F]FCH automatisée a été réalisée, en utilisant le [ 18 F]fluorométhyltriflate comme réactif de fluoration sur une cartouche Sep-Pak (cartouche qui permet la purification d'un produit sur phase solide). Le temps total nécessaire pour l'obtention du produit final est de 30 min. Le RRC est de 80 % avec une pureté radiochimique >98 %. 30 Iason a reçu une AMM pour la [ 18 F]fluorocholine en avril 2010 dans la recherche de métastases osseuses du cancer de la prostate et pour les carcinomes hépatocellulaires. Un protocole d'essai clinique local est en cours dans le service de médecine nucléaire du CHU de Bordeaux pour le cancer de la prostate. II.4 Les radiopharmaceutiques utilisés en recherche clinique II.4.1 La 2 -désoxy-2 -[ 18 F]fluorothymidine ([ 18 F]FLT) a) Les propriétés biologiques de la [ 18 F]FLT De nombreux phénomènes biologiques sont perturbés dans les cellules cancéreuses. Visualiser un de ces phénomènes grâce à un radiopharmaceutique spécifique constitue une alternative intéressante à l utilisation du [ 18 F]FDG. Parmi eux, la vitesse de prolifération cellulaire très augmentée, est un bon candidat. Ainsi, le cycle cellulaire produisant l ADN utilise la thymidine phosphorylée en 5, par la thymidine kinase I (TK1), enzyme dont l activité, dans les cellules malignes, est trois fois supérieure à celle des cellules normales. 31 Le radiopharmaceutique de prolifération cellulaire qui a été développé est la 3 -désoxy-3 - [ 18 F]fluorothymidine ou [ 18 F]FLT. Même si l affinité de la thymidine kinase 1 pour la FLT est moins bonne que pour la thymidine, les recherches menées par l équipe de Rasey 32 ont montré que la présence d un atome EPHE Banque de Monographies SVT 18 18

19 LA TOMOGRAPHIE PAR ÉMISSION DE POSITONS de fluor en position 3 sur la thymidine ne modifie pas l activité de la TK1 mais que le métabolisme cellulaire est interrompu après la première phosphorylation. En effet la FLT s accumule dans la cellule après phosphorylation par la TK1, il n y a donc pas de formation de FLT triphosphate (FLT-3 -TP) et pas d incorporation dans l ADN. La FLT s accumule donc dans la cellule sous la forme de son métabolite principal, la FLT monophosphate (FLT-3 -MP). L accumulation de la FLT rappelle l accumulation du FDG sous forme également de métabolite monophosphaté (FDG-6-P). Les études sur la [ 18 F]FLT, utilisée comme radiotraceur de la prolifération cellulaire, montrent une meilleure spécificité mais un manque de sensibilité par rapport au [ 18 F]FDG. 33 Ce défaut de sensibilité peut être expliqué par deux facteurs. Tout d abord, la présence du fluor en position 3 de la thymidine diminue l affinité de la FLT pour les transporteurs spécifiques présents dans les vaisseaux sanguins par rapport à la thymidine. 34 De plus, l affinité de la [ 18 F]FLT pour la TK1 est 30 % inférieure à celle de la thymidine. 35 Ces mécanismes mènent à une meilleure assimilation et phosphorylation de la thymidine par rapport à celle de la [ 18 F]FLT. b) Synthèse de la [ 18 F]FLT La [ 18 F]FLT est synthétisée par fluoration nucléophile selon deux stratégies utilisant deux précurseurs différents : un dérivé protégé de la thymidine et un dérivé de la 2,3 - anhydrothymidine. L approche utilisant le nosylate (Ns) a été publiée pour la première fois par Grierson et Shields 36 en 2000 avec un RRC de 13 % et un temps de synthèse de 100 min. Les optimisations successives 37,38,39,40 ont permis de produire la [ 18 F]FLT avec un RRC de 40 % en 60 min. Actuellement, cette méthode est la plus utilisée. La seconde stratégie fut décrite en 2000 par Machulla et al. quelques mois après la publication de Grierson et Shields. Le précurseur utilisé est l anhydrothymidine protégée. La [ 18 F]FLT est obtenue, dans ces conditions, avec un RRC de 14 %. Actuellement cette molécule est en protocole d'essai clinique national pour le cancer du sein. Il existe également un protocole d'essai clinique local (Service de médecine nucléaire du CHU de Bordeaux) sur les tumeurs cérébrales. II.4.2 Le [ 18 F]-fluoromisonidazole ([ 18 F]FMISO) a) Les propriétés biologiques du [ 18 F]FMISO L'hypoxie cellulaire dans les tumeurs malignes peut influencer l'efficacité des traitements anti-cancéreux. En effet, les tumeurs malignes hypoxiques sont plus résistantes à la chimiothérapie et à la radiothérapie. C'est la raison pour laquelle des efforts ont été effectués en vue de développer des méthodes et des techniques d'imagerie pour mesurer l'oxygénation dans les tissus. Le radiomarquage du composé 2-imidazole a été développé pour détecter spécifiquement l'hypoxie tumorale, offrant une solution non-invasive et moins contraignante sur le plan technique que l'utilisation de la méthode de l'électrode Eppendorf 42,43 (oxygène). La technique d'imagerie permet également d'éviter un biais d'échantillonnage. EPHE Banque de Monographies SVT 19 19

20 LA TOMOGRAPHIE PAR ÉMISSION DE POSITONS Le [ 18 F]fluoromisonidazole ([ 18 F]FMISO) a été proposé pour déterminer l'hypoxie tumorale in vivo en TEP en Depuis, il est devenu le dérivé imidazole le plus utilisé pour cette imagerie. 44,45 Le [ 18 F]FMISO s'est révélé sélectif des cellules hypoxiques in vitro et in vivo. En recherche clinique, il est utilisé pour évaluer, quantitativement l'hypoxie tumorale dans les cancers du poumon, les glioblastomes, les tumeurs des voies aérodigestives supérieures 46,47 ainsi que pour les patients atteints d'ischémie myocardique. 48,49 Une fois dans la cellule, le [ 18 F]FMISO est métabolisé et réduit par la nitroréductase intracellulaire (xanthine oxydase) puis se lie sélectivement aux macromolécules dans les cellules hypoxiques. Bien que le [ 18 F]FMISO soit relativement hydrophile, il diffuse à travers les membranes cellulaires, montrant ainsi une distribution passive dans les tissus normaux. 47 Parce que les mécanismes de réaction sont lents et en l'absence de transport actif des molécules du traceur, l'identification et la quantification des zones tumorales hypoxiques nécessitent des protocoles d'examen très longs. En outre, dans des conditions sévères, l'hypoxie est sous-estimée par les mesures d'absorption du [ 18 F]FMISO. La raison semble être l'existence d'un seuil limite, de concentration d'oxygène dans les cellules, en dessous duquel la bioréduction et l'absorption du [ 18 F]FMISO n'augmentent plus. 50 b) Synthèse du [ 18 F]FMISO Deux grandes stratégies pour la synthèse de [ 18 F]FMISO sont rapportées dans la littérature : l'ouverture du cycle époxyde, 51 avec la production du produit intermédiaire [ 18 F]épifluorohydrin, suivie d'un couplage avec un 2-nitro-imidazole ou une substitution nucléophile sur un précurseur protégé. 52,53 Tout d abord, Grierson et al 54 proposent une synthèse du [ 18 F]FMISO avec le précurseur cyclisé en deux étapes (avec un rendement de 40 % (EOB), une pureté supérieure à 99 %, et une activité spécifique de 37 TBq/mmol). Mais la méthode la plus prometteuse semble être la substitution nucléophile du groupe partant tolysate par un [ 18 F]-fluor sur le précurseur protégé (NITTP), suivie de l'hydrolyse du groupe protecteur. Une synthèse automatisée de [ 18 F]FMISO par cette méthode a été rapportée dans la littérature, en utilisant soit la CLHP soit une cartouche Sep-Pak de silice pour la purification du radiochimique 44,52. Le rendement obtenu lors de l'utilisation du NITTP est de 40 % (et reproductible), avec une pureté radiochimique 97 %, et une activité spécifique d'environ 34 TBq/mmol. 52 Un protocole d'essai clinique local est en cours dans le service de médecine nucléaire du CHU de Bordeaux pour les tumeurs ORL ainsi que pour les glioblastomes. EPHE Banque de Monographies SVT 20 20

21 LA TOMOGRAPHIE PAR ÉMISSION DE POSITONS III. CONCLUSION La découverte du fluor par Moissan date de 1886 mais ce n'est que récemment que les chercheurs ont exploité le potentiel de cet élément et notamment dans le domaine de l'imagerie moléculaire grâce à son radioisotope 18. En effet, la TEP est une technique d'imagerie médicale récente, en forte croissance grâce au développement de nouveaux radiotraceurs marqués avec le fluor 18. Même si certaines molécules d'intérêt biologique comportent un élément fluor, il est parfois nécessaire d'en introduire un. Ainsi l'introduction d un atome de fluor 18 dans les biomolécules ([ 18 F]FDG, [ 18 F]FCH, [ 18 F]FDOPA) peut modifier leurs métabolismes in vivo, c est pourquoi il est nécessaire de comparer la biomolécule fluorée à celle non fluorée afin de vérifier si les deux molécules se comportent de la même façon par rapport à leur cible. Malgré une possibilité de modification du métabolisme in vivo des biomolécules fluorées, les radiopharmaceutiques marqués au fluor 18 sont très intéressants grâce à une demi-vie plus longue (109 min) que celle du carbone 11 (20 min). En effet, cette demi-vie de 109 minutes limite les contraintes de la synthèse rapide et rend possible un acheminement de ces molécules sur des sites d'injection éloignés de 200 à 300 km du site de production. C'est ce qui explique l application plus courante en routine clinique des radiopharmaceutiques fluorés. EPHE Banque de Monographies SVT 21 21

22 LA MÉTHIONINE, UN MARQUEUR DES TUMEURS CÉRÉBRALES EPHE Banque de Monographies SVT 22

23 LA MÉTHIONINE, UN MARQUEUR DES TUMEURS CÉRÉBRALES I. GÉNÉRALITÉS I.1 Acides aminés et protéines Un acide aminé est une molécule organique possédant un squelette carboné avec deux groupements fonctionnels : une amine (-NH 2 ) et un acide carboxylique (-COOH). Ils mesurent environ 100 picomètres (pm). Les acides aminés sont les "maillons" structuraux de base des protéines. Ceux-ci sont comparables à des "colliers" constitués de cent à plusieurs milliers de ces "perles", reliées de manière covalente au moyen de fonctions amide (liaison peptidique). L'enchaînement des acides aminés constitue la structure primaire des protéines. Toutefois, leurs propriétés biologiques résultent de leur structure tertiaire, c'est-à-dire de l'organisation tridimensionnelle par repliement. Si la séquence comporte moins de 20 acides aminées, on parle de peptide, et au delà on parle de polypeptide. Les acides aminés naturels sont essentiellement des acides α -aminés. Il en existe plus de 100 présents dans la nature, certains ont été découverts sur des météorites. Le code génétique animal comporte le codage pour 22 acides aminés. Les acides aminés naturels sont des molécules chirales mais un seul de leur énantiomère est "naturel". En effet, les acides aminés naturels qui constituent les êtres vivants sont tous L. Dans la cellule, les acides aminés peuvent exister à l'état de monomère ou sous la forme de leurs biopolymères correspondants (peptides ou protéines). Parmi les acides aminés naturels, 22 sont les constituants des protéines. Ils sont soit synthétisés par les cellules et apportés par l'alimentation, soit exclusivement apportés par l'alimentation, ils sont alors dit essentiels. Dans tous les cas ils pénètrent dans la cellule grâce à un système de transport spécifique. Lorsque la synthèse protéique augmente, le besoin de la cellule en acides aminés augmente et le transport transmembranaire s'accélère. La détection de cette incorporation d'acides aminés constitue donc un indice de la synthèse protéique. I.2 La méthionine La méthionine est un acide-α-aminé soufré non polaire, présentant une fonction thioéther (-S-CH 3 ). C'est l'un des huit acides aminés essentiels. Dans le code génétique, la méthionine est spécifiée par le codon AUG. Elle joue un rôle critique dans la reproduction, la survie cellulaire, la méthylation des protéines et de l'adn. La méthionine joue un rôle particulier dans la biosynthèse des protéines, puisque toutes les chaînes protéiques démarrent par l'incorporation d'une méthionine en position N-terminale. La première méthionine des protéines n'est pas toujours retrouvée dans les protéines finales. Elle est en effet fréquemment clivée par une enzyme spécifique appelée méthionine aminopeptidase. Même si elle ne représente qu'environ 2% des acides aminés des protéines de l'organisme humain, elle est essentielle pour les réactions de méthylation des protéines. La méthionine est le précurseur de la S-adénosyl méthionine (ou SAM), un co-enzyme essentiel des réactions de transfert de méthyle dans la cellule. La SAM est une forme activée de la méthionine où le méthyle du thioéther devient un groupement partant utilisé pour méthyler l'adn, l'arn ou les EPHE Banque de Monographies SVT 23 23

24 LA MÉTHIONINE, UN MARQUEUR DES TUMEURS CÉRÉBRALES protéines. D'autres résidus méthionine peuvent ensuite être incorporés de manière interne à la chaîne polypeptidique. Les cellules cancéreuses induisent une augmentation de la synthèse protéique et donc une augmentation de l incorporation intracellulaire de la méthionine. Si celle-ci est radiomarquée, alors elle produira un hyper signal visible en imagerie TEP. II. LA MÉTHIONINE AU CARBONE 11 II.1 Généralités sur le carbone 11 Actuellement, compte tenu des problèmes techniques et économiques liés à la courte demi-vie du 11 C, aucun radiopharmaceutique marqué au 11 C n a reçu d'amm. Néanmoins, la richesse de la chimie du 12 C a permis le développement de nombreuses conditions de marquage au 11 C utilisées en recherche. Le carbone est un élément constitutif des molécules organiques. L échange d un carbone 12 par un carbone 11 ne modifiera pas les propriétés biologiques de la molécule concernée, ce qui constitue l'intérêt majeur de l'utilisation de ce radioélément. Par contre sa courte demi-vie (20 minutes) est un frein à son utilisation "en routine clinique". La chimie du carbone 11 repose sur la variété de réactions permettant de former des liaisons carbone-carbone ou carbone-hétéroatome. Le 11 C est produit par irradiation d une cible gazeuse d azote enrichie d oxygène ou d hydrogène 55,56 selon la réaction nucléaire 14 N(p,α) 11 C sous forme de 11 CO, de 11 CO 2 et de 11 CH 4. Ces 3 précurseurs primaires peuvent ensuite être convertis chimiquement en un panel important de précurseurs marqués secondaires, multipliant les possibilités d introduction du 11 C sur les molécules à marquer. Malgré le nombre important de précurseurs secondaires disponibles, peu sont effectivement utilisés pour la synthèse de radiopharmaceutique. Depuis l an 2000, l iodure de [ 11 C]-méthyle ( 11 CH 3 I) ainsi que son homologue le triflate de [ 11 C]méthyle ( 11 CH 3 OTf) sont les deux sources de 11 C électrophiles les plus décrites dans les publications. On peut également ajouter le monoxyde de [ 11 C]carbone ( 11 CO) à propos duquel le nombre de publications est en constante augmentation ainsi que l ion [ 11 C]-cyanure, sous ses diverses formes, qui est une des rares sources de carbone nucléophile. II.2 Synthèse de la méthionine marquée au 11 C Une grande variété d acides aminés marqués au 11 C et au 18 F a été étudiée pour une utilisation potentielle en TEP pour l oncologie. 57,58 Comme nous l'avons déjà signalé, le FDG n'est pas un traceur efficace pour la détection des tumeurs cérébrales. Au contraire la [ 11 C]méthionine (ou [ 11 C]met), a été largement utilisée EPHE Banque de Monographies SVT 24 24

25 LA MÉTHIONINE, UN MARQUEUR DES TUMEURS CÉRÉBRALES dans la détection des tumeurs du cerveau, de la tête et du cou avec un rapport signal sur bruit important. Dans les cellules cancéreuses, une augmentation de la synthèse protéique induit un hyper signal en imagerie TEP [ 11 C]met. Dans le cerveau humain, celui-ci est très différent entre les cellules cancéreuses et le tissu sain, ouvrant la voie à une imagerie des tumeurs cérébrales. En effet la plupart des tumeurs cérébrales montrent une plus forte incorporation d'acides aminés par rapport au tissu nerveux normal. 59 A l origine la [ 11 C]méhionine a été synthétisée par l équipe de Langström, 60 en 1976, à partir de la S-benzylhomocystéine en présence de 11 CH 3 I par réaction radicalaire. La [ 11 C]méthionine est actuellement produite pas S-[ 11 C]méthylation de la L- homocystéine en présence de 11 CH 3 I avec un RRC de 38% en utilisant la technique de la synthèse "in-loop" 61. Cette technique "in-loop" consiste à effectuer le radiomarquage d une molécule dans une boucle CLHP. Pour cette synthèse, le 11 CH 3 I est piégé directement dans une boucle CLHP qui contient la solution de précurseur. Après la réaction dans la boucle, le produit est purifié sur une cartouche SPE C En 1976, Comar et al. ont aussi développé une méthode de marquage de la [ 11 C]méthionine. Ils ont utilisé la L-homocystéine thiolactone en présence de 11 CH 3 I. II.3 Intérêt de l utilisation de la méthionine fluorée La méthionine marquée au carbone 11 est actuellement le traceur de référence en neurooncologie, en particulier pour les tumeurs de bas grade. Malgré le nombre d études démontrant l apport de la TEP [ 11 C]met dans la prise en charge des patients, son utilisation en pratique est quasi nulle, du fait de son accès extrêmement limité. L utilisation du carbone 11 (isotope de demi-vie courte de 20 min) nécessite en effet, un cyclotron sur le site de l hôpital susceptible de produire ce radioisotope, élément dont très peu de centres TEP disposent (moins de 10 centres en France). De plus, le délai entre la production du carbone 11 et la fin de l imagerie (synthèse du radiopharmaceutique, purification et validation pour injection chez l homme, transport sur le site d imagerie, injection au patient et imagerie) doit être inférieur à 2-3 heures. Ainsi, les données de la littérature, aussi intéressantes soient-elles, ne peuvent s'accompagner d'une application pratique pour les patients, et cette technique reste réservée aux centres de recherche. A ce jour, dans la littérature, seulement deux équipes ont décrit une synthèse de fluoration de méthionine. L'équipe de Tang 63 a développé une méthode de fluoration de la méthionine à partir de la L-homocystéine thiolactone. Ils ont effectué une fluoroalkylation sur la L- homocystéine thiolactone à partir du 2-[ 18 F]1-(4-methylphenyl sulfonyloxy)éthane. La synthèse est effectuée en 2 étapes. Il y a tout d'abord la fluoration du 1,2-ditosyloxyéthane puis la fluoroalkylation. Ils obtiennent un rendement global de 10%. Puis en 2008, l équipe de Katsifis 64 a également modifié la méthionine au niveau du substituant porté par le soufre. Leur synthèse s'effectue aussi en deux étapes. D'abord une EPHE Banque de Monographies SVT 25 25

26 LA MÉTHIONINE, UN MARQUEUR DES TUMEURS CÉRÉBRALES substitution nucléophile d un brome ou d un chlore par le [ 18 F - ] puis une hydrolyse acide pour éliminer les groupes protecteurs. Dans ces conditions de synthèse, le rendement est de 40 %. Malgré ce bon rendement, cette méthode ne peut être utilisée pour l administration chez l'homme car la molécule est instable en solution aqueuse. vitro. Ainsi à ce jour aucune modification de la méthionine n a permis des études in vivo et in L objectif de notre travail a donc été, de développer une méthionine fluorée en introduisant, cette fois-ci, un groupement fluoré sur l amine primaire, permettant, de plus, la fluoration en une seule étape. Cette stratégie de modification a été inspirée des travaux de Mishra et al. 65 qui ont développé une méthionine marquée au Technétium pour l imagerie SPECT. Cette équipe démontre ainsi que la présence de l amine primaire n était pas indispensable à l activité biologique de la méthionine. EPHE Banque de Monographies SVT 26 26

27 B : MISE AU POINT D'UN NOUVEAU TRACEUR FLUORÉE : LA FLUOROMÉTHIONINE EPHE Banque de Monographies SVT 27

28 FLUORATION DE LA MÉTHIONINE EPHE Banque de Monographies SVT 28

29 FLUORATION DE LA MÉTHIONINE Etant donné les différentes étapes dans la mise au point d'une réaction de radiochimie, nous avons choisi de présenter les matériels et méthodes et les résultats pour chaque étape, afin de souligner la progression de notre démarche. I. STRATÉGIE ENVISAGÉE Pour notre molécule, nous envisageons d appliquer une stratégie d introduction du fluor 18 à la dernière étape afin d optimiser la partie radiochimique et de ne pas perdre en radioactivité spécifique. De plus, compte tenu des contraintes de radioprotection imposées par l emploi du fluor 18, la réduction du nombre d étapes radioactives simplifie, d un point de vue technique, la mise en œuvre de la radiosynthèse. Pour cela, deux méthodes de fluoration ont été envisagées pour introduire le fluor 18 sur la méthionine. I.1 Substitution nucléophile d'un groupement -NO 2 La première possibilité pour fluorer la méthionine est d appliquer la technique de Le Bars et al. 66 utilisée pour la fluoration du MPPF. Le [ 18 F]MPPF est un radioligand développé pour l imagerie des récepteurs 5-HT 1A du système nerveux central. La fluoration consiste à substituer le groupe nitro, porté par un aromatique appauvri en électron, par le fluor 18. Cette réaction a tout d abord été effectuée à haute température (140 C) durant 20 minutes dans le DMSO par Shiue et al. 67 avec un rendement radiochimique de 10%, en 90 minutes de synthèse. Plus récemment l'équipe de Le Bars 66 a utilisé le chauffage à 150 C pendant 20 min, mais surtout le chauffage par micro-ondes en 3 minutes à 500 W. Ils ont aussi développé une meilleure séparation entre le composé fluoré et le précurseur nitro avec l'utilisation d'un mélange ternaire de solvants (tétrahydrofurane, méthanol et acétate de sodium aqueux) pour la CLHP. Ainsi le temps de synthèse a été raccourci à 70 min, avec un rendement radiochimique de 25 % à EOS. N ayant pas la possibilité d'utiliser le chauffage par micro-ondes nous avons choisi d utiliser la technique de Shiue et al. 67 pour fluorer la méthionine par substitution nucléophile. I.2 Substitution nucléophile avec le groupement silylé La deuxième possibilité est l utilisation du silicium. Dans la littérature, les premiers travaux décrivant l utilisation du silicium pour le radiomarquage date des années 80. Mais ce n est que très récemment que les radiochimistes ont décrit la chimie du silicium comme outil pour l'introduction du fluor 18 nucléophile sur les biomolécules. L'énergie de liaison entre le silicium et le fluor est élevée (135 kcal/mol) d'où la très grande affinité entre ces deux atomes. Grâce à cette propriété, il est possible d'introduire sur les biomolécules contenant un silicium, le fluor 18 dans des conditions de substitution nucléophile plus douces. 68,69,70,71 En effet EPHE Banque de Monographies SVT 29 29

30 FLUORATION DE LA MÉTHIONINE les températures de réactions sont plus faibles que lors d'une fluoration par substitution nucléophile classique et permettent donc d'éviter la dégradation des biomolécules. Elle a été développée par l'équipe d'ametamey afin de limiter le nombre d'étapes après la fluoration de peptides, qui se fait en général en plusieurs étapes à l'aide de groupements prosthétiques. Nous allons donc évaluer les 2 méthodes de fluoration et déterminer laquelle est la plus adaptée à la fluoration de la méthionine. I.3 Les essais biologiques Les essais biologiques reposent sur des expériences in vitro, ainsi que sur des expositions aux "principes actifs" in vivo chez des animaux ou sur des expositions contrôlées aux "principes actifs" chez l'homme. D'une manière générale les essais biologiques de nouvelles molécules permettent de montrer à la fois l'efficacité de ces nouveaux "principes actifs" et l'absence d'effets indésirables sur les cellules. Dans notre cas, une fois la [ 18 F]méthionine synthétisée, celle-ci a fait l'objet de différents essais biologiques in vitro sur des cellules cancéreuses de manière à vérifier si les caractéristiques biologiques de la [ 18 F]méthionine sont comparables à celles de la [ 11 C]méthionine, malgré les modifications introduites pour rendre la fluoration possible. Les essais in vivo chez la souris sont en cours. II. MODULE DE SYNTHÈSE : LE Fx F-N L ensemble des manipulations de radiomarquage a été réalisé sur l automate : TRACERLab Fx F-N (Ge Healthcare). Le module Fx F-N est un automate pour les synthèses avec le fluor 18 nucléophile, il est essentiellement utilisé pour les molécules en Recherche & Développement. Il est muni de plusieurs flacons dans lesquels les réactifs sont introduits avant leur ajout successif dans le réacteur pour effectuer la fluoration. Il comporte une partie formulation et trois emplacements pour ajouter différentes cartouches (QMA, C 18, Alumine, ). L automate TRACERLab Fx F-N intègre également une Chromatographie Liquide Haute Pression (CLHP) de type préparative. Elle comporte une boucle d injection (par exemple : 5 ml), un détecteur UV (à 5 longueurs d onde fixe) ainsi qu un détecteur de radioactivité (cristal NaI). Nous utilisons une colonne phase inverse (C 18 ). Les contraintes de radioprotection liées à la manipulation de hautes activités de 18 F - (plusieurs milliers de MégaBecquerel-MBq-) sont importantes et requièrent l utilisation d un système qui doit être commandé à distance. C est pourquoi l automate est confiné dans une enceinte blindée. Cette enceinte est fermée, sous dépression grâce à un système de ventilation contrôlée. Le module de synthèse est entièrement commandé à distance par un ordinateur réalisant l interface entre l automate et le manipulateur. La succession des différentes étapes du procédé de radiosynthèse est réalisée de façon programmée et donc automatique, cependant un contrôle manuel des différents composants (température du réacteur, électrovannes, débit de la pompe CLHP ) reste possible, via EPHE Banque de Monographies SVT 30 30

31 FLUORATION DE LA MÉTHIONINE l interface informatique, durant toute la synthèse. La séquence de synthèse est écrite via le programme "synthetiser Fx F-N TracerLab". Cette séquence est constituée d une succession d événements programmés dans le temps (ouverture et fermeture des vannes, chauffage ou refroidissement du réacteur ). Durant la synthèse sept paramètres différents sont enregistrés continuellement, ils sont ensuite archivés pour chaque synthèse. Ces paramètres comprennent l enregistrement de l activité par quatre détecteurs de radioactivité (Récupération cible, Réacteur, produit final, CLHP), l enregistrement de la pression et de la température dans le réacteur, et l enregistrement du spectre UV de la CLHP. III. LES DIFFÉRENTES ÉTAPES DE LA RADIOSYNTHÈSE La radiosynthèse requière plusieurs étapes, en partant de la production du radioélément jusqu'au contrôle qualité, voici le détail de ces étapes : a) Irradiation de la cible : La cible d'h 18 2 O enrichie est bombardée avec un faisceau de protons (17 MeV, 40 µa) pendant le temps nécessaire en fonction de l'activité souhaitée pour la synthèse (2 h en général). Après irradiation, la solution d eau irradiée est transférée de manière automatisée, via un capillaire à l'intérieur d'une gaine plombée. Cette solution arrive dans un flacon intermédiaire situé sur l automate de synthèse dans l'enceinte blindée. b) Séparation des [ 18 F]-fluorures : La synthèse de la molécule est réalisée sur l'automate Tracerlab Fx F-N. Sous la pression d'un flux d'azote, l'eau irradiée contenant les fluorures 18 passe sur une résine échangeuse d'anions de type Sep-Pak Accell Plus QMA (résine CO-NH(CH 2 ) 3 N + (CH 3 ) 3 Cl - ). Les anions fluorures 18 sont captés par la résine et l'eau enrichie résiduelle est collectée dans un flacon. Les ions fluorures sont ensuite élués de la résine échangeuse d ions par un mélange de Kryptofix [2.2.2] (22 mg)/ carbonate de potassium (7 mg) dilué dans un mélange acétonitrile/eau (50/50, 600 µl), et sont recueillis au niveau du réacteur de l automate. La solution est évaporée sous vide pendant 8 min à 100 C afin d'éliminer les traces d'eau. Pour cela, de l'acétonitrile est rajouté en petite quantité afin de former un azéotrope avec l eau. L'opération est répétée 3 fois. c) Substitution nucléophile : Une fois les fluorures "secs", le précurseur, préalablement dissout dans son solvant de réaction, est additionné dans le réacteur. Auparavant celui-ci est refroidi par un flux d Hélium jusqu à atteindre 70 C. Puis la solution est chauffée à la température souhaitée afin d'effectuer la fluoration par substitution nucléophile. La solution est alors refroidie avant l'ajout de 5 ml d'éluant pour effectuer l injection sur la CLHP préparative. d) Purification de la molécule: La purification par CLHP permet d éliminer les impuretés engendrées lors de la synthèse. Afin de purifier la méthionine du mélange réactionnel, celui-ci est passé sur une CLHP. Cette CLHP est équipée d'une colonne C 18 (par exemple : colonne Luna 10 µm, 250x10 mm), d'un détecteur UV (pour notre synthèse réglé à 254 nm) et d'un détecteur de radioactivité de type NaI. A l'aide d'une vanne pilotée par le module, le produit d'intérêt est collecté dans un ballon EPHE Banque de Monographies SVT 31 31

32 FLUORATION DE LA MÉTHIONINE pour formulation. Ce ballon contient 20 ml d'eau ppi afin de diluer la fraction collectée de la CLHP. Ensuite la formulation est effectuée sur une cartouche Sep-Pak C 18 afin d'éliminer les solvants issus de la CLHP qui ne sont pas injectables à l homme. Après passage de cette solution sur la cartouche, elle est rincée avec 10 ml d'eau ppi. La méthionine est éluée de la cartouche avec 2 ml d'éthanol qui sont récupérés dans le dernier flacon de collecte. La cartouche est à nouveau rincée avec 2 ml de NaCl 0,9 %. Cette solution est transférée dans l enceinte de répartition poussée par un flux d'hélium, via une tubulure. Cette solution est récupérée dans un flacon pour dilution, distribution et contrôle qualité. e) Dilution et fractionnement : Après récupération de la solution en enceinte de répartition, la masse et l activité de la solution mère sont mesurées afin de permettre de calculer l activité volumique. Cette solution mère est diluée avec du chlorure de sodium 0,9 % afin d'ajuster l'osmolarité de la solution. L'activité qui est mesurée à l'aide d'un activimétre, permet aussi de connaître le rendement radiochimique de la synthèse. Ensuite, un aliquote de la solution est prélevé pour le contrôle qualité. f) Contrôle qualité : Le contrôle qualité permet d'analyser le produit final afin de valider si celui-ci est conforme ou non aux spécifications demandées. Les tests effectués sont : Apparence de la solution : L'apparence de la solution permet de savoir si la solution est limpide, incolore et exempte de particules. ph : Le ph est mesuré à l aide de bandelette de sensibilité 0,3 unité ph. 10 µl de solution finale sont déposés sur la bandelette, elle prend instantanément la couleur correspondant au ph du milieu. La couleur obtenue est alors comparée à l échelle de couleur indiquée sur la boîte. Pureté chimique : La pureté chimique permet de déterminer les impuretés présentes dans la solution finale. Pour cela une CLHP équipée d'un détecteur UV ainsi que d'un détecteur de radioactivité est utilisée pour détecter les éventuels produits secondaires. Pour la détection des produits secondaires nous injectons 20 µl de solution finale sur une colonne Luna C x4.6 mm conditionnée à 1 ml/min avec un éluant CLHP (éthanol/solution aqueuse d acide trifluoracétique 0.1 % (60/40)). La longueur d onde est réglée à 238 nm. Les solvants résiduels de la synthèse sont analysés, par une société extérieure, par chromatographie en phase gazeuse (CPG). Pureté radiochimique : La pureté radiochimique permet de confirmer l'absence d'un produit radioactif parasite, notamment du fluor libre, qui peut fausser la qualité de l'imagerie. Elle est effectuée sur chromatographie sur couche mince (CCM) et analysée à l aide d un analyseur linéaire de radioactivité. Il détecte la présence d activité sur la plaque en fonction de la migration du produit. Nous utilisons des plaques de silice modifié (RP-18F) sur aluminium sur lequel nous déposons 2 µl de solution finale dilués au 20 ème (dilution effectuée afin de ne pas saturer le EPHE Banque de Monographies SVT 32 32

33 FLUORATION DE LA MÉTHIONINE radiodétecteur). Nous faisons ensuite migrer cette plaque dans un éluant éthanol/solution aqueuse d acide ascorbique 0.1 % (60/40). Puis nous analysons la plaque à l aide de l'analyseur linéaire de radioactivité. Pureté radionucléidique : L identification radionucléidique est réalisée par spectrométrie gamma. Elle permet de vérifier qu'il n'y a que le radioélément fluor 18 dans la solution finale. Pour cela quelques microlitres de solution finale sont placés devant un spectrophotomètre gamma calibré (NaI (Tl) ou germanium). Un pic unique doit être observé à 511 kev (éventuellement un pic somme à 1022 kev peut être visualisé). Période : La période est réalisée sur un activimètre afin de confirmer que le radioélément utilisé est bien le fluor 18. Nous vérifions donc que la demi-vie du produit finale soit bien de 109,77min. III.1 Stratégies envisagées Comme indiqué précédemment, la stratégie envisagée est d'effectuer la fluoration en dernière étape afin d'optimiser le rendement radiochimique. Nous avons donc testé deux méthodes d'introduction du fluor sur la méthionine. La première est la méthode de substitution nucléophile aromatique dérivée des travaux de Le Bars 66 utilisée pour le MPPF et nous essaierons dans un deuxième temps la technique de fluoration d'ametamey et al qui permet de fluorer les biomolécules dans des conditions plus douces. IV. RADIOMARQUAGE AVEC DIVERS PRÉCURSEURS La partie fabrication des précurseurs a été effectuée par nos collègues chimistes de Bordeaux I. Tous les précurseurs ont une pureté chimique supérieure à 95 % (RMN, CLHP). Les radiomarquages ainsi que les contrôles qualité ont été effectués au laboratoire du cyclotron. Tous nos rendements radiochimiques donnés dans ce mémoire sont des rendements non corrigés de la décroissance. IV.1 Méthionine para-nitro : 4-nitrobenzamido-méthionine Afin de tester la méthode de fluoration développée pour le MPPF (la substitution nucléophile d'un groupement nitro par un [ 18 F - ] sur la méthionine) celle-ci a été modifiée pour introduire un groupement nitro-aromatique. Pour cela, un nitro-phényl a été ajouté par l intermédiaire d une liaison amide. Pour introduire un fluor 18, une substitution nucléophile aromatique est effectuée sur le groupe nitro. EPHE Banque de Monographies SVT 33 33

34 FLUORATION DE LA MÉTHIONINE IV.1.1 Synthèse du précurseur 51 : 4-nitrobenzamido-méthionine Pour obtenir le précurseur de la méthionine, l ester méthylique de la méthionine est engagé dans une réaction de couplage peptidique avec l acide 4-nitrobenzoique. Cette réaction de condensation est réalisée en utilisant comme agent de couplage la 6-chloro-2,4-diméthoxy-1,3,5- triazine (CDMT) associée à la N-méthylmorpholine (NMM). L ester intermédiaire obtenu est ensuite hydrolysé par traitement avec de la lithine pour obtenir le précurseur avec un rendement global de 80 %. IV.1.2 Radiomarquage de la 4-[ 18 F]fluorobenzamido-méthionine Lors du développement du MPPF dans notre laboratoire nous avons modifié les conditions de fluoration de l'équipe de Le Bars. 66 La réaction de fluoration de la méthionine a donc été effectuée dans le DMSO à 165 C durant 9 minutes, en présence de 6 mg de précurseur. Le brut réactionnel a été directement récupéré en enceinte de répartition sans CLHP, pour dilution, fractionnement et contrôle qualité. L'analyse du produit final par CLHP analytique montre une très grosse quantité de fluorure ainsi que beaucoup de produit de départ. La conversion en produit fluoré est très faible et ceci malgré la modification des conditions. Une synthèse en conditions plus concentrée suivie d'une CLHP préparative (ACN/TFA 0,1 % 25/75) a permis d observer de meilleurs taux de conversion (7 %) Cependant, le produit final présente beaucoup d'impuretés chimiques ainsi que quelques impuretés radiochimiques dont notamment des fluorures. Les rendements obtenus sur les synthèses effectuées avec la méthionine sont faibles. Mais ils peuvent certainement être améliorés en modifiant quelques paramètres. En effet, en modifiant le temps de fluoration ou encore la température de réaction, il se peut que les rendements s améliorent. Néanmoins, au cours de nos essais sur la méthionine para-nitro, sont apparues, dans la littérature, les premières publications d Ametamey. Ces premières publications donnaient de très bons résultats sur la fluoration de biomolécules par l intermédiaire de la liaison SiF. Nous avons donc décidé de suspendre nos travaux sur la méthionine para-nitro pour développer une molécule possédant un atome de silicium susceptible d être fluoré. IV.2 Méthionine SiH : 4-(di-tert-butylsilanyl)benzamido-méthionine Après avoir testé la technique de fluoration de Le Bars et al., 66 nous avons envisagé de modifier la molécule afin d'utiliser la méthode développée par Ametamey et al pour fluorer les biomolécules. Cette méthode est une méthode de fluoration plus douce, adaptée à la fluoration des biomolécules qui sont des molécules fragiles. EPHE Banque de Monographies SVT 34 34

35 FLUORATION DE LA MÉTHIONINE IV.2.1 Synthèse du précurseur : 4-(di-tert-butylsilanyl)benzamidométhionine Le précurseur portant le groupement di-tert-butylsilane est synthétisé en 4 étapes. Dans un premier temps le 4-bromobenzyl-alcool est protégé sous sa forme alcoolate par réaction avec le NaH. Le produit de la réaction est ensuite silylé en "un pot" par réaction d échange halogène/métal avec le tert-butyllithium puis par substitution électrophile du lithien formé par le di-tert-butylchlorosilane avec un rendement de 80 %. L alcool benzylique silylé obtenu est ensuite oxydé en acide carboxylique au moyen du réactif de Jones (CrO 3 /H 2 SO 4 ) avec un rendement de 98 %. L acide 4-di-tert-butylsilyl-benzoique est ensuite couplé à l ester méthylique de la méthionine selon la même procédure que celle utilisée précedement pour réaliser la 4-nitrobenzamido-méthionine, suivit de l'ester. Permettant, dans ce cas d'accéder à l'acide carboxylique avec un rendement de 70 %. IV.2.2 Radiomarquage de la 4-(di-tert-butyl([ 18 F]fluoro)silyl)benzamidométhionine La fluoration s'effectue en une seule étape, après le "séchage" des fluorures. Les 6 mg de précurseur sont ajoutés avec le DMSO et l'acide acétique puis chauffés à 110 C durant 15 minutes. Cela permet d'effectuer la substitution nucléophile de l hydrogène du silicium par le fluor 18. Le produit est ensuite purifié par CLHP préparative. Le chromatogramme de la CLHP permet un suivi réactionnel et l'évaluation de la conversion du précurseur en produit fluoré. Les rendements obtenus dans ces conditions sont en moyenne de 5 %. Sur les essais effectués dans les conditions décrites par Ametamey, 69 les rendements restent assez faibles, dû probablement à la différence de structure du bras silylé utilisé par Ametamey et celui utilisé pour la méthionine. Nous avons donc testé un autre précurseur, similaire au précurseur, afin de comparer les rendements. IV.3 Méthionine SiOH : 4-(di-tert-butyl(hydroxy)silyl)benzamidométhionine IV.3.1 Synthèse du précurseur : 4-(di-tert-butyl(hydroxy)silyl) benzamidométhionine La voie de synthèse utilisée pour préparer le précurseur portant un groupement silanol est globalement la même que celle utilisée pour préparer le précurseur portant un groupement silane. La seule étape qui diffère est celle d oxydation qui permet dans ce cas, à partir de l alcool 4-ditert-butylsilanyl-benzylique, d obtenir les fonctions acide et silanol en une seule et même étape. Cette étape d oxydation est effectuée au moyen d eau de javel (NaOCl) en utilisant le 2,2,6,6- tétraméthylpipéridine-1-oxyl (TEMPO) comme catalyseur suivi par un traitement par le chlorite de sodium (NaOCl 2 ) pour oxyder l aldéhyde intermédiaire en acide. Cette étape d oxydation est EPHE Banque de Monographies SVT 35 35

36 FLUORATION DE LA MÉTHIONINE réalisée avec un rendement de 95 % et le rendement global de la synthèse, permettant d'accéder à, est de 57 % sur 4 étapes. IV.3.2 Radiomarquage de la 4-(di-tert-butyl([ 18 F]fluoro)silyl)benzamidométhionine Les conditions de fluoration de la méthionine SiOH utilisées, sont identiques à celles décrites pour la fluoration de la méthionine SiH à savoir : 6 mg de précurseur dans 300 µl de DMSO et 3 µl d acide acétique, fluoration à 110 C pendant 15 minutes pour permettre la substitution nucléophile. Les essais effectués sur ce précurseur montrent un taux de conversion un peu plus important que pour la méthionine SiH (6 % de rendement moyen). IV.3.3 Conclusion Les rendements de fluoration restent assez faibles dans ces conditions mais légèrement supérieurs à ceux de la méthionine SiH. Nous avons alors décidé de nous concentrer sur cette molécule en priorité. Il était donc nécessaire de tester d'autres conditions de fluoration afin de voir si les rendements étaient optimisables. Plusieurs pistes ont été envisagées : La modification du temps de fluoration La modification de la température de fluoration La nature du solvant de fluoration L'effet de la quantité d'acide acétique sur la fluoration. L effet de la quantité de précurseur V. OPTIMISATION DES CONDITONS DE FLUORATION SUR LA MÉTHIONINE SiOH V.1 Choix du solvant de réaction Ametamey et al utilisent le DMSO pour la fluoration des peptides, nous avons donc utilisé le DMSO pour nos premiers essais. En revanche, le solvant de réaction peut avoir un impact sur le rendement de la synthèse. Afin de confirmer cette hypothèse, nous avons testé d'autres solvants de réaction pour vérifier si l'un d'eux favorisait la fluoration. Les solvants qui permettent d effectuer des fluorations de molécules sont peu nombreux. En effet ces solvants doivent avoir des propriétés bien particulières, ils doivent être aprotiques polaires pour favoriser la substitution nucléophile. Nous avons sélectionné trois solvants ayant ces propriétés : l acétonitrile (ACN), le diméthylformamide (DMF) et le diméthylsulfoxide (DMSO). Néanmoins il n était pas possible d effectuer des essais de fluoration avec l acétonitrile à 110 C, puisque ce solvant a une température d ébullition inférieure. Donc pour évaluer l impact de l ACN sur cette synthèse nous avons décidé de modifier la température de fluoration pour effectuer les essais. EPHE Banque de Monographies SVT 36 36

37 FLUORATION DE LA MÉTHIONINE Les rendements obtenus varies peut en fonction des solvants. Même si les résultats obtenus avec le DMSO ne sont pas satisfaisants, nous avons conservé ce solvant afin de pouvoir effectuer des essais de fluoration à haute température, ce que ne permettent pas l ACN ou le DMF, puisqu'ils ont une température d'ébullition plus faible. V.2 Influence de la température et du temps de fluoration Pour déterminer la température optimale de réaction, la fluoration a été effectuée à 110 C, 140 C et 165 C pendant 15 et 30 minutes. Nous avons utilisé 6 mg de précurseur dans 300 µl de DMSO et 3 µl d'acide acétique. Les meilleurs résultats sont obtenus à 165 C (40 % de rendement), contrairement aux températures inférieures où le rendement de fluoration est faible. Nous pouvons observer que pour cette molécule la méthode d Ametamey ne permet pas une fluoration à basse température (110 C). L'explication peut venir du fait que sur les molécules utilisées par l'équipe d'ametamey il y a un carbone supplémentaire au niveau du groupement silylé. En effet, grâce à l'ajout de ce carbone la liaison amide n'apporte plus sont effet électroattracteur sur le cycle aromatique. Ceci peux induire une différence de réactivité au niveau du silane. Nous avons également observé que le rendement de fluoration à 165 C pendant 30 minutes est plus faible qu'à 165 C pendant 15 minutes. Cette chute de rendement peut être expliquée par la dégradation du produit pendant la fluoration. Donc le temps de fluoration sera de 15 minutes pour la suite des manipulations, ce qui permet de ne pas allonger le temps de synthèse. Malgré la haute température de fluoration, l analyse par CLHP analytique, ne montre aucune dégradation de notre produit. V.3 Influence de l acide acétique L'acide acétique permet la protonation du groupement hydroxyle qui sera alors un meilleur groupe partant. 68 Il était intéressant de connaître l impact de l acide acétique sur la réaction. Puis de connaître la quantité qui favorise le plus la conversion. Pour cela des essais ont été effectués sans acide acétique, puis avec des volumes croissants (3, 6 ou 30 µl d acide acétique). L'ajout d'acide acétique dans le milieu réactionnel est nécessaire à la fluoration de la méthionine puisque sans, le rendement de fluoration est nul. En revanche quelles que soient les quantités ajoutées les rendements sont identiques. Au-dessus de 3 µl d acide acétique additionnés dans le milieu réactionnel, le rendement ne varie pas significativement. Afin de ne pas acidifier de manière excessive le milieu pour la suite des étapes, il a été décidé de fixer le volume d'acide acétique, pour le reste des synthèses, à 3 µl. EPHE Banque de Monographies SVT 37 37

38 FLUORATION DE LA MÉTHIONINE V.4 Influence de la quantité de précurseur Le précurseur est introduit en excès par rapport au [ 18 F - ] lors de la fluoration. En effet, la quantité de fluor est faible puisque sa radioactivité spécifique (1,71 x Ci/µmol) est très importante. C'est pourquoi le précurseur est à chaque fois en large excès par rapport au fluor. Cet excès de précurseur permet de favoriser la conversion en méthionine fluorée. Les synthèses ont été effectuées avec 3, 6 ou 10 mg pour évaluer la quantité de précurseur donnant le meilleur rendement. Les essais effectués sur l impact de la quantité de précurseur montrent que celle-ci joue fortement sur le rendement. En effet, avec 3 mg de précurseur le rendement est faible. Par contre au dessus de 6 mg le rendement ne varie pas significativement. Donc il n'est pas nécessaire d'ajouter plus de précurseur. Nous avons conservé 6 mg de précurseur pour la suite des étapes de développement. V.5 Radioactivité spécifique La radioactivité spécifique des radiopharmaceutiques fluorés est en général très élevée (>2 Ci/µmol). En effet, la quantité de fluor 19 présent lors du déroulement des différentes étapes est faibles. En revanche les molécules marquées au carbone 11 ont une radioactivité spécifique moins importante puisque la quantité de carbone présente lors de la synthèse est plus grande. Pour connaître la radioactivité spécifique de la méthionine SiOH nous avons effectué une courbe d'étalonnage avec des concentrations de standards croissantes en CLHP analytique pour en déduire l'activité spécifique. L'activité spécifique de la méthionine SiOH a été calculée sur les différentes synthèses effectuées et le résultat moyen obtenu est de 5Ci/µmol. V.6 Conclusion La modification de certains paramètres de synthèse a permis d'augmenter les rendements radiochimiques en méthionine. Les variations de ces facteurs ont permis de trouver les conditions qui nous semblent être adéquates pour la synthèse. Les essais de solvants de réaction ont montré que le plus approprié était le DMSO comme le décrit Ametamey L importance du milieu acide lors de la fluoration a été démontrée. En revanche quelle que soit la quantité d'acide acétique introduite lors de la réaction, le rendement ne varie pas significativement. Donc la quantité la plus faible utilisée est la plus appropriée pour la synthèse. L'équipe d'ametamey fluore leurs biomolécules à faible température (110 C). Lors de nos travaux de recherche, nous avons observé qu'avec la méthionine, les faibles températures ne donnaient pas des rendements satisfaisants. Donc nous avons effectué nos fluorations à une température plus élevée (165 C) durant 15 minutes qui est le meilleur compromis entre rendement de fluoration et durée de synthèse. La quantité de précurseur fait varier le rendement radiochimique, en effet plus la quantité de précurseur est importante et plus le taux de conversion augmente, jusqu'à un certain point. Au EPHE Banque de Monographies SVT 38 38

39 FLUORATION DE LA MÉTHIONINE vu des différences de rendements entre l'ajout de 6 mg et 10 mg de précurseur, il n'est pas nécessaire d'utiliser 10 mg de précurseur. Donc les conditions de synthèse, qui semblent optimales, pour la suite du développement seront de 6 mg de précurseur dans 300 µl de DMSO avec 3 µl d'acide acétique, à 165 C durant 15 minutes. Suite au développement de conditions de fluoration donnant des rendements convenables sur la méthionine SiOH, nous avons testé ces conditions sur la méthionine SiH. Les rendements obtenus pour le précurseur SiH sont légèrement inférieur à la méthionine SiOH (33 %), c'est pourquoi nous avons continué le développement sur la méthionine SiOH. Nous avons également effectué une synthèse avec la méthionine SiH sans acide acétique afin d'observer si celle-ci ce comportait de la même manière que la méthionine SiOH. Or sans acide acétique il n'y a pas de fluoration de la méthionine SiH comme pour la méthionine SiOH. VI. PURIFICATION DU PRODUIT VI.1 Étapes de purification VI.1.1 CLHP préparative Pour purifier le produit après fluoration une CLHP préparative est nécessaire, afin de récupérer uniquement notre produit d'intérêt. Pour optimiser les conditions de CLHP, il est nécessaire de développer une méthode sur les solutions témoins des produits. Et ainsi obtenir les meilleures conditions de séparation. Nous avons développé les conditions CLHP en fonction des conditions décrites par Ametamey 71 avec des peptides qui utilisent un mélange acétonitrile et une solution aqueuse d acide trifluoroacétique 0,1 %. Ainsi les conditions optimales de séparation obtenues lors du développement de la méthode sont : 60/40 (ACN/solution aqueuse TFA 0,1 %) VI.1.2 Cartouche Sep-pak C 18 Afin d éliminer les solvants toxiques provenant de la CLHP, il est nécessaire après collecte du produit d intérêt de le passer à travers une cartouche C 18. Ce sont des cartouches de silice sur lesquelles sont greffées des chaînes carbonées de 18 carbones. Ces cartouches retiennent essentiellement les produits apolaires. Après récupération du produit lors de la collecte CLHP celui-ci est dilué dans 20 ml d eau ppi. Cette quantité d eau rajoutée permet de diluer les solvants afin qu ils n entrainent pas avec eux la méthionine. La méthionine va être retenue sur la cartouche C 18 grâce à ses propriétés apolaires et les solvants seront éliminés. Ensuite la cartouche est rincée avec 10 ml d eau ppi, qui permet d éliminer les éventuels traces de solvants. La méthionine est ensuite éluée à son tour avec 2 ml d éthanol. EPHE Banque de Monographies SVT 39 39

40 FLUORATION DE LA MÉTHIONINE VI.1.3 Analyse du produit final Le contrôle qualité du produit obtenu permet de vérifier s'il reste des impuretés dans la solution finale. Sur la CLHP analytique, nous avons observé une impureté radiomarquée non identifiée. Afin d identifier cette impureté nous avions quelques hypothèses. En effet, le soufre de la méthionine est sensible à l oxydation qui donne lieu à deux dérivés possibles : la méthionine sulfoxyde ou la méthionine sulfone. Pour explorer cette piste nous avons étudié l oxydation de la méthionine au cours du temps, afin de voir si le produit radiomarqué visible était une des impuretés connues. Pour cela, nous avons analysé au cours du temps la [ 18 F]-méthionine en CLHP analytique. L analyse par CLHP a permis de montrer que la concentration de l impureté présente dans la méthionine augmentait au cours du temps. Ceci nous a confirmé l oxydation de celle-ci en l un de ces deux dérivés. Après avoir confirmé l oxydation de la méthionine, nous devions savoir lequel des deux dérivés se formait. Nous avons donc synthétisé les deux dérivés afin de les comparer à l impureté. VI.2 Identification de l impureté VI.2.1 Synthèse du sulfoxyde "froid" [ 19 F] : 4-(di-tertbutyl(fluoro)silyl)benzamido-méthionine sulfoxyde Afin d obtenir le dérivé sulfoxyde de la méthionine fluorée nous avons décidé dans un premier temps d oxyder directement le précurseur de type silanol puis de réaliser sa fluoration suivant la méthode classique. Ainsi l oxydation de la 4-(di-tert-butyl(hydroxy)silyl)benzamidométhionine a été effectuée selon la méthode décrite par Arterburn et al. 72 Cette oxydation fait intervenir le diphénylsulfoxyde comme oxydant et un complexe du rhénium(v) (ReOCl 3 (PPh 3 ) 2 ) comme catalyseur. Nous avons ainsi pu obtenir un précurseur de type sulfoxyde avec un rendement de 67 %. Ce précurseur a pu ensuite être fluoré en présence de KF, de kryptofix et d acide acétique dans le THF avec un rendement de 80 %. Une fois le sulfoxyde synthétisé, nous avons comparé les temps de rétention en CLHP analytique de et de l'impureté présente dans le produit final. Les conditions de CLHP utilisées pour effectuer ce test sont les suivantes : colonne Luna C x 4.6 mm avec un éluant de CLHP contenant de l'éthanol et une solution aqueuse de TFA 0.1 % (60/40) à un débit de 1 ml/min. Le détecteur UV est réglé à 238 nm. Dans ces conditions l'impureté a un temps de rétention de 11 min alors que sort à 14 min. Ainsi, nous pouvons en conclure que l'impureté n'est pas le sulfoxyde. La deuxième hypothèse, est que la méthionine ne reste pas à l'état d'oxydation du sulfoxyde mais passe directement sous forme de sulfone. Pour vérifier cette hypothèse nous avons alors envisagée la synthèse de cette molécule, afin de comparer les temps de rétention du standard et de l'impureté. EPHE Banque de Monographies SVT 40 40

41 FLUORATION DE LA MÉTHIONINE VI.2.2 Synthèse de la sulfone : 4-(di-tert-butyl(fluoro)silyl)benzamidométhionine sulfone Afin d obtenir le dérivé de type sulfone nous avons décidé de modifier les conditions d oxydation. Pour cela nous avons réalisé cette oxydation selon une méthode décrite par Trost et al. 73 L ester méthylique de la 4-(di-tert-butyl(hydroxy)silyl)benzamido-méthionine est mis en réaction en présence d oxone de tetrabutylammonium dans le dichlorométhane. La sulfone ainsi obtenue est ensuite hydrolysée en présence de lithine pour obtenir la 4-(di-tertbutyl(hydroxy)silyl)benzamido-méthionine sulfone avec un rendement sur les deux étapes de 90 %. Cette sulfone est ensuite fluorée de manière classique pour donner la référence froide fluorée avec un rendement de 95 %. Puis, l'analyse CLHP de, réalisée dans les mêmes conditions que précédemment, permet cette fois-ci, de constater que la sulfone présente bien le même temps de rétention que l'impureté. On peut conclure que le produit présent dans la méthionine est effectivement la sulfone (produit d'oxydation de celle-ci). Afin de confirmer cette hypothèse nous avons fluorer au [ 18 F - ]. Grâce a ce radiomarquage nous avons pu ainsi confirmer que le pic radioactif que nous obtenons en impureté correspond à la [ 18 F]-sulfone. VI.2.3 Conclusion Après avoir identifié l impureté radiomarquée de notre produit, il est nécessaire de l éliminer en évitant l oxydation de la méthionine. En effet une impureté radiomarquée dans un produit destiné à l injection in vivo peut fausser l imagerie si elle se fixe à un endroit différent du produit d intérêt. En plus de son impact sur la mauvaise quantification de l imagerie, cette impureté peut être toxique. Pour cela des essais de stabilité ont été effectués avec deux stabilisants connus, comme l'acide ascorbique et l'éthanol. VII. ESSAIS DE STABILITÉ VII.1 Acide ascorbique L'acide ascorbique est connu pour ses propriétés antioxydantes, en effet il permet de diminuer ou d'empêcher les réactions d'oxydation d autres substances chimiques. De manière théorique, l oxydation est une réaction qui transfère des électrons d'une substance vers un agent oxydant. Cette réaction peut produire des radicaux libres qui entraînent des réactions en chaîne destructrices. Les antioxydants sont capables de stopper ces réactions en chaîne en s'oxydant avec les radicaux libres, annihilant ainsi leur action. En pratique, on peut associer cela à une augmentation du degré d oxydation de l élément. Pour vérifier si l'acide ascorbique empêche l'oxydation de la méthionine SiOH, nous avons effectué des essais de stabilité de notre molécule en présence d'acide ascorbique à EPHE Banque de Monographies SVT 41 41

42 FLUORATION DE LA MÉTHIONINE différents moments de la synthèse. Nous en avons ainsi introduit pendant la fluoration, puis pendant la purification ainsi que dans le produit final. Cependant lors de l analyse CLHP du contrôle qualité de notre produit, on constate toujours la présence de la sulfone, mais en faible proportion. Même si l acide ascorbique n a pas permis l élimination totale de la sulfone il a permis de stabiliser la méthionine dans le temps. En effet, la concentration en sulfone n augmente pas au cours du temps. Nous avons donc émis l hypothèse que la sulfone se formait lors de la CLHP du contrôle qualité. Pour confirmer cette éventualité, nous avons décidé de modifier les conditions de CLHP de l analyse en rajoutant de l acide ascorbique dans l éluant (5 mg/ml). Or, à la longueur d onde de notre analyse (238 nm), l acide ascorbique ne permettait pas de faire le contrôle, car il absorbe énormément à cette longueur d onde et donc il y a un phénomène de saturation du détecteur UV qui ne permet pas l analyse. Nous avons donc envisagé d utiliser un deuxième produit qui est connu pour ses propriétés antiradiolyses : l éthanol. VII.2 Éthanol L'utilisation de l'éthanol dans les éluants de CLHP permet à la méthionine d'être toujours en contact avec un produit qui diminue le phénomène de radiolyse. En effet, l éthanol est un bon piégeur de radicaux oxydants ( OH). Nous avons donc modifié nos éluants, en remplaçant l'acétonitrile par l'éthanol. Les essais ont été effectués avec un éluant contenant 60 % d éthanol et 40 % de solution aqueuse d acide trifluoroacétique 0,1 % en CLHP préparative. Le contrôle qualité effectué sur le produit final montre toujours une faible quantité de sulfone inférieure à celle observée avec un éluant contenant de l acétonitrile. L'inconvénient d'utiliser l'éthanol, en CLHP préparative, est qu'il est impossible de faire une formulation sur une sep-pak C 18 après la CLHP. En effet, l'éthanol est un solvant polaire qui empêche le greffage sur cartouche du produit récupéré. Mais la quantité d'acide trifluoracétique provenant de l éluant doit être éliminée avant d'envisager d'utiliser le produit final. De plus, la grande quantité d'éthanol contenu dans le produit final ne permet pas d'envisager une injection in vivo. Les cartouches C 18 n'étant pas appropriées à un éluant CLHP contenant une grande quantité d éthanol, il faut donc trouver d'autres moyens pour éliminer l'éthanol et l acide trifluoroacétique du produit final (cartouche anionique, évaporation, ). A ce jour, ces essais n ont pas encore débuté. VII.3 Analyse de la pureté du produit par Chromatographie sur Couche Mince (CCM) Nous pensons que la sulfone se forme pendant l'analyse CLHP. En effet, le produit n'est plus en contact avec l'acide ascorbique durant l'analyse car celui-ci n'est pas retenu sur la colonne. Pour confirmer cette hypothèse, nous avons décidé d'analyser le produit à l'aide de plaque CCM. Nous avons fait migrer le produit sur des plaques CCM, avec un éluant contenant EPHE Banque de Monographies SVT 42 42

43 FLUORATION DE LA MÉTHIONINE de l'acide ascorbique. Ainsi nous pourrons savoir si le produit, même stabilisé lors de son analyse, contient de la sulfone. Pour cela, nous avons développé des conditions de migration du produit avec un éluant contenant 40 % de solution aqueuse d'acide ascorbique 0,1 % ainsi que 60 % d'éthanol. Les rapports frontaux entre la sulfone et la méthionine doivent être suffisamment différents pour observer deux pics lors de l'analyse. Après de multiples essais, il s'avère que le produit contient de la sulfone en faible quantité (< 5 %), malgré la stabilisation dans l'acide ascorbique et l'éthanol. Il semble donc que la sulfone ne se forme pas lors du contrôle qualité, elle est donc déjà présente en fin de synthèse. VII.4 Conclusion Les essais de stabilité effectués sur la méthionine à l'aide de l'acide ascorbique et de l'éthanol n'ont pas permis d'éliminer totalement la sulfone du produit final. Cette sulfone se forme pendant les étapes de synthèse. La sulfone étant un produit d oxydation de la méthionine, nous pouvons envisager que cette impureté ne soit pas toxique pour l organisme. De plus, la quantité de produit injectée étant très faible, la quantité de sulfone présente dans le produit final est donc négligeable. En revanche, la sulfone étant un produit radiomarqué, il est utile de savoir si la sulfone se fixe ou si elle est éliminée immédiatement. En effet, si elle se fixe in vivo alors cela pourrait perturber le résultat de l imagerie, même si sa faible quantité peut laisser envisager que cela ne sera pas le cas. Pour s'en assurer des tests biologiques in vitro ont été effectués. EPHE Banque de Monographies SVT 43 43

44 LES PREMIERS ESSAIS BIOLOGIQUES EPHE Banque de Monographies SVT 44

45 LES PREMIERS ESSAIS BIOLOGIQUES Les essais biologiques in vitro ont été effectués en collaboration avec l équipe d Anil Mishra à New Delhi. Les essais ont été réalisés sur trois types de lignées cellulaires différents. Les cellules U-87 MG qui sont des cellules de glioblastomes humains, les cellules BMG de gliome malin du cerveau et les cellules C6 de glioblastomes du rat. I. LA MÉTHIONINE SiOH I.1 La cytotoxicité de la L-Si-[ 19 F]méthionine Les études de cytotoxicité permettent d'évaluer, in vitro, la capacité d'une substance a détruire les cellules. Plusieurs méthodes sont utilisées pour mesurer la cytoxicité du produit, notamment l'analyse au MTT et le test de macrocolonie. I.1.1 Essais au MTT sur les cellules BMG, U-87 MG et C6 L essai au MTT est une méthode rapide de comptage des cellules vivantes après une exposition à une substance. Le réactif utilisé est le sel de tétrazolium MTT (bromure de 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium). Le cycle de tétrazolium qu il contient est réduit, par la succinate déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes, actives métaboliquement, en formazan, formant un précipité, dans la mitochondrie, de couleur violette. La quantité de précipité formée est proportionnelle à la quantité de cellules vivantes (mais également à l'activité métabolique de chaque cellule). Il s'agit donc, après l'incubation des cellules avec du MTT, pendant un temps déterminé à 37 C, de lyser les cellules et de dissoudre les précipités de formazan violets dans du DMSO 100 %. Un simple dosage de la densité optique par spectroscopie permet de connaître la quantité relative de cellules vivantes et actives métaboliquement. Pour effectuer ce test sur nos lignées, des cellules en phase de croissance exponentielle ont été ensemencées sur une plaque de microtitration 96 puits avec une densité cellulaire uniforme de 4000 cellules/puit, ceci 24 heures avant le traitement. Les cellules ont été traitées durant 2 heures avec des concentrations croissantes de L-Si-[ 19 F]méthionine (µm-mm), puis incubées en présence de MTT à une concentration finale de 0,05 mg/ml durant 2 h à 37 C avant de prélever le milieu de culture. Les cellules ont été lysées, des cristaux de formazan ont été dissous dans 150 µl de DMSO, et la densité optique a été mesurée sur des extraits de 150 µl à 570 nm (filtre de référence : 630 nm). L activité mitochondriale est exprimée en pourcentage de viabilité du contrôle. I.1.2 Essai de macrocolonie Des cultures monocouches des trois lignées cellulaires (BMG, U-87 MG et C6) ont été exposées à la trypsine. Entre 100 et 1000 cellules (suivant la concentration de la molécule testée) ont été ensemencées dans des boites de pétri de 60 mm et incubées à 37 C en atmosphère humide (5 % CO 2 ) durant 8 jours. Les colonies ont été fixées dans le méthanol et colorées avec 1 % de cristal violet. Les colonies contenant plus de 50 cellules ont été comptées et la fraction survivante de chaque colonie a été calculée par rapport au contrôle. EPHE Banque de Monographies SVT 45 45

46 LES PREMIERS ESSAIS BIOLOGIQUES I.1.3 Résultats Quelque soit la lignée cellulaire (U-87 MG, C6 et BMG) la cytotoxicité de la L-[Si- 19 F]méthionine est concentration-dépendante. En effet, l'analyse des essais au MTT, à différentes concentrations en L-Si-[ 19 F]méthionine, montre qu une exposition de 2 h des cellules, à une concentration de 100 µg/ml, s accompagne d une inhibition de 40,2 % des cellules U-87 MG. Alors que, 400 µg/ml de L-Si-[ 19 F]méthionine sont nécessaires pour inhiber 49,1 % des cellules de glioblastome C6. Ce qui signifie que pour la lignée cellulaire U-87 MG, la survie est de 0,53 ± 0,028 pour 1 mm de L-Si-[ 19 F]méthionine, alors que la survie cellulaire de la lignée BMG est de 0,43 ± 0,015 pour 1 mm de L-Si-[ 19 F]méthionine. Les valeurs de DL 50 sont de 0,4 mg/ml pour les lignées cellulaires de glioblastomes U-87 MG et C6 et de 0,6 mg/ml pour les cellules BMG. La DL 50 est la concentration de la substance pour laquelle elle cause 50 % de létalité. La L-Si-[ 19 F]méthionine a été testée afin d'évaluer sa capacité a induire une cytotoxicité dans les lignées de cellules cancéreuses. Pour cela nous avons utilisé à la fois un dosage de l'activité mitochondriale (test MTT) et un test clonogénique. Les résultats de ces essais ont montré une cytotoxicité dépendante de la concentration. Une corrélation directe a été observée entre le dosage au MTT et le dosage clonogénique. I.2 Incorporation cellulaire de la L-Si-[ 19 F]méthionine dans les cellules U-87 MG et C6 I.2.1 Trans-stimulation de l efflux de [ 35 S]L-méthionine Les cellules U-87 MG et C6 ont été incubées en présence de 10 µm (10 µci) de [ 35 S]-Lméthionine durant 2 heures à 37 C pour mesurer le déplacement de la [ 35 S]L-méthionine. La [ 35 S]L-méthionine fixée est ensuite déplacée par une solution de HBSS contenant ou non 1mM de L-Si-[ 19 F]méthionine. A la fin de l expérience les cellules sont rincées avec du tampon maintenu à 4 C. La quantité de [ 35 S]L-méthionine restante a été quantifiée après digestion des cellules. La concentration intracellulaire de [ 35 S]L-méthionine, incorporée au temps T0, est la somme des quantités de [ 35 S]-L-méthionine déplacées plus celle restante dans la cellule. Les résultats sont exprimés en µg/ml et sont comparés au contrôle. I.2.2 Résultats L efflux de [ 35 S]L-méthionine a été mesuré en présence et en absence (contrôle) de 1 mm de L-Si-[ 19 F]méthionine. La quantité de [ 35 S]L-méthionine incorporée durant la mise en contact et le protocole de lavage est inférieure à 10 µm. Dans ces conditions, les résultats obtenus au cours des expériences de déplacements démontrent que l efflux de [ 35 S]L-méthionine est transstimulé par 1 mm de L-Si-[ 19 F]méthionine extracellulaire. L effet est maximal après 5 minutes. Les résultats de cette étude permettent de montrer que la L-Si-[ 19 F]méthionine se fixe de manière spécifique sur les cellules cancéreuses utilisées pour l'étude. EPHE Banque de Monographies SVT 46 46

47 LES PREMIERS ESSAIS BIOLOGIQUES II. LA SULFONE II.1 Incorporation cellulaire de la sulfone L-Si-[ 19 F]méthionine dans les cellules U-87 MG II.1.1 Trans-stimulation de l efflux de [ 35 S]L-méthionine Pour mesurer le déplacement de la [ 35 S]L-méthionine, les cellules U-87 MG ont été incubée en présence de 10 µm (10 µci) de [ 35 S]L-méthionine durant 2 h à 25 C. La [ 35 S]Lméthionine fixée est ensuite déplacée dans une solution de HBSS en présence ou en absence de 1mM de sulfone. A la fin de l expérience les cellules sont rincées avec du tampon maintenu à 4 C. La quantité de [ 35 S]L-méthionine restante a été quantifiée après digestion des cellules. La concentration intracellulaire de [ 35 S]L-méthionine incorporée au temps T0 est la somme de la quantité de [ 35 S]L-méthionine déplacée plus celle restante dans la cellule. Les résultats sont exprimés en µg/ml et sont comparés avec le contrôle. II.1.2 Résultats L efflux de [ 35 S]L-méthionine a été mesurée en présence et en absence (contrôle) de 1 mm du composé. La quantité de [ 35 S]L-méthionine incorporée durant la mise en contact et le protocole de lavage est inférieure à 10 µm. Les résultats obtenus lors des expériences de déplacement montrent que l efflux de [ 35 S]L-méthionine n'est pas trans-stimulé par la sulfone extracellulaire. En effet, l'amplitude de l'effet est identique a celui observé lors des expériences de contrôle et donc ne montre pas de différence significative avec P > 0,05. L'étude de trans-stimulation montre que l'oxydation de la méthionine en sulfone empêche de former les complexes avec l'adénosine. Ce complexe est essentiel pour permettre l'imagerie des tumeurs méthionine dépendantes ainsi que pour la quantification du rapport MET + /HCY - Ces résultats indique que la sulfone ne se fixe pas sur notre cible, ce qui valide notre hypothèse pour dire que cette impureté sera éliminée dés son injection, et donc ne perturbera pas l'imagerie utilisant la méthionine 18 F. EPHE Banque de Monographies SVT 47 47

48 C : CONCLUSION ET PERSPECTIVES EPHE Banque de Monographies SVT 48

49 CONCLUSION ET PERSPECTIVES Comme nous l avons déjà signalé, du fait de la faible demi-vie du carbone 11, la méthionine est peu utilisée comme radiopharmaceutique pour l'imagerie des tumeurs cérébrales. Cependant, cette molécule marquée a montrée tout son intérêt pour la prise en charge thérapeutique des tumeurs cérébrales de bas grade. C est pourquoi l objectif principal de ces travaux était le développement de conditions de fluoration de la méthionine pour une utilisation plus large de celle-ci, dans le domaine de la neuro-oncologie, pour l'imagerie par tomographie d émission de positons (TEP). Afin d introduire le fluor 18 sur la méthionine nous avons envisagé deux stratégies différentes. La première est une substitution nucléophile du groupement nitro par le fluor 18, décrite pour le MPPF par l équipe de Le Bars. 66 La deuxième possibilité était la fluoration mettant en jeu la chimie du silicium, en utilisant les propriétés d affinité entre le fluor et le silicium, décrite par Ametamey et al Les premiers essais de fluoration ont été effectués sur une méthionine modifiée à l'aide d'un groupement nitro-phényl. La technique de fluoration décrite pour le MPPF, ligand pour l'imagerie des récepteur 5-HT 1A du cerveau, a été utilisée. Les faibles rendements obtenus lors de ces synthèses, nous ont conduit à rechercher une seconde voie de radiosynthèse. Dans la littérature, les publications portant sur la fluoration à l'aide du silicium décrites par Ametamey, pour les peptides, présentaient de très bons résultats. Nous avons donc choisi de nous y intéresser, plutôt que de chercher à optimiser la première méthode. Nous avons donc synthétisé deux précurseurs silylés de la méthionine qui permettent d utiliser les conditions d Ametamey : le précurseur SiH et le SiOH. Les fluorations initiales à 110 C effectuées sur ces précurseurs ne nous ont pas donné les rendements escomptés, comparés à ceux décrits dans la littérature, même si ceux avec sont légèrement supérieurs, nous obligeant à adapter ces conditions à nos substrats. Ainsi l optimisation des conditions de fluorations, (165 C) effectuée sur la méthionine SiOH, accessible en plus grande quantité, nous a permis d obtenir des rendements bien plus importants (40 %). L'hypothèse principale pour justifier ces divergences est qu'ametamey intègre un carbone supplémentaire entre la partie silane et la biomolécule. Cette différence de structure peut jouer sur la réactivité du groupement silylé. Malgré de très bons rendements, favorable à la production de ce radiochimique, la présence d'une impureté radiomarquée, constitue un handicap. L'identification de cette impureté a montrée qu'il s'agissait d'un produit d'oxydation de la méthionine de type sulfone, comme il en existe lors de la synthèse de la méthionine marquée au carbone 11. Les essais effectués pour éliminer cette impureté, à l'aide de l'acide ascorbique ou de l'éthanol, n'ont pas permis de la supprimer totalement (< 5 %). A ce jour, la grande quantité d'éthanol présente dans le produit final, afin de stabiliser la méthionine, reste un problème, et il est nécessaire de la diminuer soit en utilisant des cartouches anioniques, soit en essayant de l'évaporer après CLHP préparative, avant la formulation. On peut également envisager d'utiliser de l'acétonitrile, beaucoup plus facile à éliminer, comme éluant de CLHP préparative et d'additionner de l'éthanol en faible quantité. EPHE Banque de Monographies SVT 49 49

50 CONCLUSION ET PERSPECTIVES Les résultats biologiques in vitro ont permis de montrer que la méthionine SiOH est incorporée par les cellules tumorales, d'une manière comparable à la méthionine, suggérant que la modification structurales introduite au traceur n a pas altéré ces propriétés biologiques. De plus, les essais biologiques effectués sur l'impureté résiduelle, de type sulfone ont permis de montrer que in vitro, celle-ci n'était pas incorporée dans les cellules tumorales et qu'elle n'a donc pas d affinité pour la cible. Nous pouvons donc faire l'hypothèse que, in vivo, elle se comportera de la même manière et qu'elle sera éliminée rapidement sans incorporation cellulaire et donc n'influencera pas la quantification du signal de la [ 18 F]méthionine. Afin de valider totalement l efficacité de notre molécule, il est nécessaire maintenant d effectuer des essais in vivo chez l animal pour réaliser une comparaison entre l imagerie avec la [ 11 C]méthionine et la [ 18 F]méthionine. Ces essais sont en cours et permettront ainsi de confirmer si la [ 18 F]méthionine et la [ 11 C]méthionine se comportent de la même manière. EPHE Banque de Monographies SVT 50 50

51 RÉFÉRENCES EPHE Banque de Monographies SVT 51

52 RÉFÉRENCES 1 Wang J.L., Maurer L. : Positron emission tomography: Applications in drug discovery and drug development. Curr. Top. Med. Chem. (2005), 5 (23): Guilbaud N., Duchamp O., Just N., Genne P. : Role of non invasive animal imaging in preclinical anticancer drug development. Bul. Cancer. (2005), 92 (1): Wood K.A., Hoskin P.J., Saunders M.I. : Positron emission tomography in oncology: A review. Clin. Oncol. (2007), 19: Weber W.A. : Positron emission tomography as an imaging biomarker. J. Clin. Oncol. (2006), 24: Oriuchi N., Higuchi T., Ishikita T., Miyakubo M., Hanaoka H., Iida Y. Endo K. : Present role and future prospects of positron emission tomography in clinical oncology. Cancer Sci. (2006), 97: Schwaiger M., Ziegler S., Nekolla S.G. : PET/CT: Challenge for nuclear cardiology. J. Nucl. Med. (2005), 46: Di Carli M.F., Dorbala S., Meserve J., El Fakhri G., Sitek A., Moore S.C. : Clinical myocardial perfusion PET/CT. J. Nucl. Med. (2007), 48: Dekemp R.A., Yoshinaga K., Beanlands R.S.B. : Will 3-dimensional PET-CT enable the routine quantification of myocardial blood flow? J. Nucl. Cardiol. (2007), 14: Herholz K., Heiss W.D. : Positron emission tomography in clinical neurology. Mol. Imaging Biol. (2004), 6: Cai L., Innis R.B., Pike V.W. : Radioligand development for PET imaging of β-amyloid (Aβ )- current status. Curr. Med. Chem. (2007), 14: Ido T., Wan C.N., Fowler J.S., Wolf A.P. : Fluorination with F 2. a convenient synthesis of 2- Deoxy-2-fluoro-D-glucose. J. Org. Chem. (1977), 42: Ehrenkaufer R.E., Potocki J.F., Jewett D.M. : Simple synthesis of F-18-labeled 2-fluoro-2- Deoxy-D-glucose: concise communication. J. Nucl. Med. (1984), 25: Hamacher K., Coenen H.H., Stocklin G. : Efficient stereospecific synthesis of no-carrier-added 2-[ 18 F]-fluoro-2-Deoxy D-glucose using aminopolyether supported nucleophilic EPHE Banque de Monographies SVT 52

53 RÉFÉRENCES substitution. J. Nucl. Med. (1986), 27: Firnau G., Nahmias C., Garnett S. : Preparation of [F-18]5-fluoro-Dopa with reactorproduced fluorine-18. Int. J. Radiat. Isot. (1973), 24(3): Garnett E.S., Firnau G., Nahmias C. : Dopamine vizualised in the basal ganglia of living man. Nature (1983), 305 (5930): Calne D.B., DelaFuenteFernandez R., Kishore A. : Contributions of positron emission tomography to elucidating the pathogenesis of idiopathic parkinsonism and dopa responsive dystonia. J. Neural. Transm. Suppl. (1997), 50: Dollé F., Demphel S., Hinnen F., Fournier D., Vaufrey F., Crouzel C. : 6-[ 18 F]fluoro-L-Dopa by radiofluorodestannylation: A short and simple synthesis of a new labelling precursor. J. Labelled Cpd. Radiopharm. (1998), 41: Lemaire C., Damhaut P., Plenevaux A., Comar D. : Enantioselective synthesis of 6-[Fluorine- 18]-fluoro-L-Dopa from no-carrier-added fluorine- 18-fluoride. J. Nucl. Med. (1994), 35 (12): Zhang L., Tang G., Yin D., Tang X., Wang Y. : Enantioselective synthesis of no-carrier-added (NCA) 6-[ 18 F]fluoro-L-Dopa. Appl. Radiat. Isot. (2002), 57: Lemaire C., Plenevaux A., Aerts J., Del Fiore G., Brihaye C., Le Bars D., Comar D., Luxen A.: Solid phase extraction - An alternative to the use of rotary evaporators for solvent removal in the rapid formulation of PET radiopharmaceuticals. J. Labelled Cpd. Radiopharm. (1999), 42 (suppl. 1): s Zeisel S.H., Blusztajn J.K. : Choline and human nutrition. Annu. Rev. Nutr. (1994), 14: Podo F. : Tumour phospholipid metabolism. NMR Biomed. (1999), 12 (7): Shinoura N., Nishijima M., Hara T., Haisa T., Yamamoto H., Fujii K., Mitsui I., Kosaka N., Kondo T., Hara T. : Brain tumors: Detection with C-11 choline PET. Radiology (1997), 202 (2): Ohtani T., Kurihara H., Ishiuchi S., Saito N., Oriuchi N., Inoue T., Sasaki T. : Brain tumour imaging with carbon-11 choline: comparison with FDG PET and gadoliniumenhanced MR imaging. EPHE Banque de Monographies SVT 53

54 RÉFÉRENCES Eur. J. Nucl. Med. (2001), 28(11): Sanz G., Robles J.E., Gimenez M., Arocena J., Sanchez D., Rodriguez-Rubio F., Rosell D., Richter J.A., Berian J.M. : Positron emission tomography with (18)fluorine-labelled deoxyglucose: utility in localized and advanced prostate cancer. BJU Int. (1999), 84(9): Ackerstaff E., Pflug B.R., Nelson J.B., Bhujwalla Z.M. : Detection of increased choline compounds with proton nuclear magnetic resonance spectroscopy subsequent to malignant transformation of human prostatic epithelial cells. Cancer Res. (2001), 61: Swanson M.G., Vigneron D.B., Tabatabai Z.L., Males R.G., Schmitt L., Carroll P.R., James J.K., Hurd R.E., Kurhanewicz J. : Proton HR-MAS spectroscopy and quantitative pathologic analysis of MRI/3D-MRSI-targeted postsurgical prostate tissues. Magn. Reson. Med. (2003), 50: Li C.W., Kuo Y.C., Chen C.Y., Kuo Y.T., Chiu Y.Y., She F.O., Liu G.C. : Quantification of choline compounds in human hepatic tumors by proton MR spectroscopy at 3T. Magn. Reson. Med. (2005), 53(4): DeGrado T.R., Coleman R.E., Wang S., Baldwin S.W., Orr M.D., Robertson C.N., Polascik T.J., Price D.T. : Synthesis and evaluation of 18 F-labeled choline as an oncologic tracer for positron emission tomography: initial findings in prostate cancer. Cancer Res. (2000), 61 (1): Iwata R. C. Pascali, A. Bogni, S. Furumoto, K. Terasaki, K. Yanai : [ 18 F]Fluoromethyl triflate, a novel and reactive [ 18 F]fluoromethylating agent: preparation and application to the on-column preparation of [ 18 F]fluorocholine. Appl. Radiat. Isot. (2002), 57 (3): Boothmann D.A., Davis T.W., Sahijdak W.M. : Enhanced expression of thymidine kinase in human cells following ionizing radiation. Int. J. Radit. Oncol. Biol. Phys. (1994), 30: Rasey J.S., Grierson J.R., Wiens L.W., Kolb P.D., Schwartz J.L. : Validation of FLT uptake as a measure of thymidine kinase-1 activity in A549 carcinoma cells. J. Nucl. Med. (2002), 43: Been L.B., Suurmeijer A.J.H., Cobben D.C.P., Jager P.L., Hoekstra H.J., Elsinga P.H. : [ 18 F]FLT-PET in oncology: current status and opportunities. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging (2004), 31 (12): Gati W.P., Misra H.K., Knaus E.E., Wiebe L.I. : Structural modifications at the 2'-position and 3'-position of some pyrimidine nucleosides as determinants of their interaction with the mouse erythrocyte nucleoside transporter. EPHE Banque de Monographies SVT 54

55 RÉFÉRENCES Biochem. Pharmacol. (1984), 33(21): Eriksson S., Kierdaszuk B., Munch-Petersen B., Oberg B., Johansson N.G. : Comparison of the substrate specificities of human thymidine kinase 1 et 2 et deoxycytidine kinase toward antiviral and cytostatic nucleoside analogs. Biochem. Biophys. Res. Commun. (1991), 176: Grierson J.R., Shields A.F. : Radiosynthesis of 3'-Deoxy-3'-[ 18 F]fluorothymidine: [ 18 F]FLT for imaging of cellular proliferation in vivo. Nucl. Med. Biol. (2000), 27: Martin S.J., Eisenbartha J.A., Wagner-Utermanna U., Mierb W., Henzeb M., Pritzkowc H., Haberkornb U., Eisenhuta M. : A new precursor for the radiosynthesis of [ 18 F]FLT. J. Nucl. Med. (2000), 41: Mosdzianowski C. Eisenhut M., Martin J., Eisenbarth J., Korenjak C., Nader M. : Automated FLT synthesis using 3-N-BOC-1-(5-O-(4,4-dimethoxytrityl)-3-O-nosyl-2-doexy- -Dlyxofuranosyl) thymine as precursor. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging (2001), 28: Yun M., Oh S.J., Ha H.-J., Ryu J.S., Moon D.H. : High radiochemical yield synthesis of 3'- deoxy-3'-[ 18 F]fluorothymidine using (5'-O-dimethoxytrityl-2'-deoxy-3'-O-nosyl-β-Dthreo pentofuranosyl)thymine and its 3-N-BOC-protected analogue as a labeling precursor. Nucl. Med. Biol. (2003), 30: Moon B.S., Shim A.Y., Kim D.W., Kim S.W., Yang S.D., Chi D.Y. : New synthesis method for [ 18 F]-3'-deoxy-3'-fluorothymidine using a nosylate precursor in ionic liquid ([bmim][otf]). J. Labelled Cpd. Radiopharm. (2003), 46: S Machulla H.J., Blocher A., Kuntzsch M., Piert M., Wei R., Grierson J.R. : Simplified labeling approach for synthezing 3'-deoxy-3'-fluorothymidine ([ 18 F]-FLT). J. Radioanal. Nucl. Chem. (2000), 243: Cater DB., Silver I.A. : Quantitative measurements of oxygen tension in normal tissues and in the tumours of patients before and after radiotherapy. Acta. Radiol. (1960), 53(3): Bentzen L., Keiding S., Horsman M.R., Gronroos T., Hansen S.B., Overgaard J. : Assessment of hypoxia in experimental mice tumours by [F-18]fluoromisonidazole PET and po(2) electrode measurements - Infuence of tumour volume and carbogen breathing. Acta. Oncol. (2002), 41(3): Tang G., Wang M., Tang X., Gan M., Luo L. : Fully automated one-pot synthesis of [ 18 F]fluoromisonidazole. EPHE Banque de Monographies SVT 55

56 RÉFÉRENCES Nucl. Med. Biol. (2005), 32 (5): Dubois L., Landuyt W., Haustermans K., Dupont P., Bormans G., Vermaelen P., Flamen P., Verbeken E., Mortelmans L. : Evaluation of hypoxia in an experimental rat tumour model by [F-18]Fluoromisonidazole PET and immunohistochemistry. Br. J. Cancer (2004), 91 (11): Eschmann SM., Paulsen F., Reimold M., Dittmann H., Welz S., Reischl G., Machulla H.J., Bares R. : Prognostic impact of hypoxia imaging with F-18-misonidazole PET in non-small cell lung cancer and head and neck cancer before radiotherapy. J. Nucl. Med. (2005), 46 (2): Bruehlmeier M. Roelcke U., Schubiger P.A., Ametamey S.M. : Assessment of hypoxia and perfusion in human brain tumors using PET with F-18-fluoromisonidazole and O-15- H 2 O. J. Nucl. Med. (2004), 45 (11): Markus R., Reutens D.C., Kazui S., Read S., Wright P., Pearce D.C., Tochon-Danguy H.J., Sachinidis J.I., Donnan G.A. : Hypoxic tissue in ischaemic stroke: persistence and clinical consequences of spontaneous survival. Brain. (2004), 127(Pt 6): Guadagno J.V., Donnan G.A., Markus R., Gillard J.H., Baron J.C. : Imaging the ischaemic penumbra. Curr. Opin. Neurol. (2004); 17 (1): Couturier O., Luxen A., Chatal J.F., Vuillez J.P., Rigo P., Hustinx R. : Fluorinated tracers for imaging cancer with positron emission tomography. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. (2004), 31 (8): Jerabeck P.A., Patrick T.B., Kilbourn M.R, Dischino D.D., Welch M.J. : Synthesis and biodistribution of F-18 labeled fluoronitroimidazoles potential in vivo markers of hypoxic tissue. Appl. Radiat. Isot. (1986), [A](37): Kamarainen E.L., Kyllonen T., Nihtila O., Bjork H., Solin O. : Preparation of fluorine-18- labelled fluoromisonidazole using two different synthesis methods. J. Label. Cpd. Radiopharm. (2004), 47 (1): Patt M., Kuntzsch M., Machulla H.J. : Preparation of [F-18]fluoromisonidazole by nucleophilic substitution on THP-protected precursor: Yield dependence on reaction parameters. J. Radioanal. Nucl. Chem. (1999), 240 (3): Grierson J.R., Link J.M, Mathis C.A., Rasey J.S., Krohn K.A. : A radiosynthesis of F-18 fluoromisonidazole. EPHE Banque de Monographies SVT 56

57 RÉFÉRENCES J. Nucl. Med. (1989); 30 (3): Bida G.T. Ruth T.J., Wolf A.P. : Experimentally determined thick target yields for the N-14 (P,Alpha) C-11 reaction. Radiochim. Acta. (1980), 27(8): Christman D.R., Finn R.D., Karlstrom K.I., Wolf A.P. : Production of ultra high activity C-11 labeled hydrogen-cyanide, carbon-dioxide, carbone-monoxide and methane via N- 14(Rho, Alpha) C-11 reaction. 15. Int. J. Appl. Radiat. Isot. (1975), 26: Jager P.L., Vaalburg W., Pruim J., De Vries E.G.E., Langen K.J., Piers D.A. : Radiolabeled amino acids: Basic aspects and clinical applications in oncology. J. Nucl. Med. (2001), 42 (3): Laverman P., Boerman O.C., Corstens F.H.M., Oyen W.J.G. : Fluorinated amino acids for tumour imaging with positron emission tomography. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging (2002), 29 (5): Herholz K., Heiss W.D. : Positron emission tomography in clinical neurology. Mol. Imaging Biol. (2004), 6 (4): Langström B., Lundqvist H. : Preparation of C-11 methyl iodide and its use in synthesis of C- 11 methyl-l-methionine. Int. J. Appl. Radiat. Isot. (1976), 27: Gomez V., Gispert J.D., Amador V., Llop J. : New method for routine production of L-[methyl- C-11]methionine: in loop synthesis. J. Label. Cpd. Radiopharm. (2008), 51: Comar D., Cartron J.C., Maziere M., Marazano C. : Labeling and metabolism of methioninemethyl-c-11. Eur. J. Nucl. Med. (1976), 1: Tang G., Mingfang W., Xiaolan T., Lei L., Manquan G. : Fully automated synthesis module for preparation of S-(2-[ 18 F]fluoroethyl)-L-methionine by direct nucleophilic exchange on a quaternary 4-aminopyridinium resin. Nucl. Med. Biol. (2003), 30: Bourdier T., Fookes C.J.R., Pham T.Q., Greguric I., Katsifis A. : Synthesis and stability of S- (2-[F-18]fluoroethyl)-L-homocysteine for potential tumour imaging. J. Label. Cpd. Radiopharm. (2008), 51(11-12): Hazari P.P., Shukla G., Goel V., Chuttani K., Kumar N., Sharma R., Mishra A.K. : Synthesis of Specific SPECT-Radiopharmaceutical for Tumor Imaging Based on Methionine: Tc- 99m-DTPA-bis(methionine). EPHE Banque de Monographies SVT 57

58 RÉFÉRENCES Bioconjugate Chem. (2010), 21 (2): Le Bars D., Lemaire C., Ginovart N., Plenevaux A., Aerts J., Brihaye C., Hassoun W., Leviel V., Mekhsian P., Weissmann D., Pujol J.F., Luxen A., Comar D. : High-yield radiosynthesis and preliminary in vivo evaluation of p-[f-18]mppf, a fluoro analog of WAY Nucl. Med. Biol. (1998), 25 (4): Shiue C.Y., Shiue G.G., Mozley P.D., Kung M.P., Zhuang Z.P., Kim H.J., Kung H.F. : p-[f- 18]-MPPF: A potential radioligand for PET studies of 5-HT1A receptors in humans. Synapse. (1997), 25 (2): Mu L.J., Hohne A., Schubiger R.A., Ametamey S.M., Graham K., Cyr J.E., Dinkelborg L., Stellfeld T., Srinivasan A., Voigtmann U., Klar U. : Silicon-based building blocks for one-step F-18-radiolabeling of peptides for PET imaging. Angew. Chem. Int. (2008), 47(26): Hoehne A., Mu L., Honer M., Schubiger P.A., Ametamey S.M., Graham K., Stellfeld T., Borkowski S., Berndorff D., Klar U., Voigtmann U., Cyr J.E., Friebe M., Dinkelborg L., Srinivasan A. : Synthesis, F-18-labeling, and in vitro and in vivo studies of bombesin peptides modified with silicon-based building blocks. Bioconjugate Chem. (2008), 19 (9): Hohne A., Yu L., Mu L.J., Reiher M., Voigtmann U., Klar U., Graham K., Schubiger P.A., Ametamey S.M. : Organofluorosilanes as Model Compounds for F-18-Labeled Silicon-Based PET Tracers and their Hydrolytic Stability: Experimental Data and Theoretical Calculations (PET = Positron Emission Tomography). Chem. Eur. J. (2009), 15 (15): Becaud J., Mu L.J., Karramkam M., Schubiger P.A., Ametamey S.M., Graham K., Stellfeld T., Lehmann L., Borkowski S., Berndorff D., Dinkelborg L., Srinivasan A., Smits R., Koksch B. : Direct One-Step(18)F-Labeling of Peptides via Nucleophilic Aromatic Substitution. Bioconjugate Chem. (2009), 20 (12): Arterburn J.B., Nelson S.L. : Rhenium-catalyzed oxidation of sulfides with phenyl sulfoxide. J. Org. Chem. (1996), 61(7): Trost BM, Braslau R. : Tetra-normal-butylammonium oxone - oxidations under anhydrous conditions. J. Org. Chem. (1988), 53 (3): EPHE Banque de Monographies SVT 58