SESSION CAPET externe et CAFEP TRAVAUX PRATIQUES. Première partie : Techniques de biochimie

Transcription

1 SESSION 2005 CAPET externe et CAFEP Section : Biotechnologies Option : Biochimie - génie biologique TRAVAUX PRATIQUES Première partie : Techniques de biochimie Durée totale : 4 heures SUIVI DE LA PURIFICATION DE LA b-galactosidase La b-galactosidase (E.C ) catalyse l hydrolyse du lactose en glucose et galactose. La production de cette enzyme, normalement secrétée au niveau du jejunum chez l enfant, cesse chez certains sujets à l âge adulte entraînant alors des phénomènes d intolérance au lactose. Pour pallier cette déficience, les industriels proposent aux consommateurs des laits à lactose hydrolysé par voie enzymatique. La b-galactosidase est assez peu répandue dans la nature, elle peut être produite à partir de certaines souches de levures ou de bactéries. Au cours de cette séance, les différentes fractions obtenues lors d une purification réalisée à partir d une culture d une souche d Escherichia coli seront étudiées. Les étapes du protocole de purification sont schématisées dans l annexe 1. Les résultats relatifs à l extrait brut et les fractions F1 et F2 sont présentés dans l annexe 2. Les manipulations concerneront donc uniquement F3. La b-galactosidase d Escherichia coli est constituée de quatre sous unités identiques. Elle nécessite, pour optimiser son activité catalytique, la présence d ions Mg 2+ permettant la stabilisation de sa structure quaternaire, ainsi que celle du 2-mercaptoéthanol qui maintient les groupements thiols à l état réduit. Le tampon phosphate utilisé sera donc additionné de chlorure de magnésium et de 2-mercaptoéthanol. Le deuxième temps de la manipulation consistera en un dosage des ions Mg 2+ dans la solution ayant permis la préparation du tampon. Page 1/9

2 A-Etude du protocole de purification 1- Expliquer l intérêt de chacune des étapes de la purification. 2- Proposer une méthode simple et rapide permettant de s assurer de l efficacité de l étape Expliquer le principe de la méthode employée lors de l étape Donner le principe d une méthode électrophorétique permettant de vérifier l efficacité globale de la purification. 5- Proposer des manipulations complémentaires pour améliorer la purification. Justifier. B-suivi de la purification 1- Dosage des protéines de la fraction F3 (utiliser le tube étiqueté "F3 dosage protéines") 1-1- Détermination de l ordre de grandeur de la concentration massique en protéines par spectrophotométrie UV Principe Les acides aminés aromatiques présentant un maximum d absorption à 280 nm la mesure de l absorption d une solution protéique à cette longueur d onde permet d évaluer approximativement la concentration massique en protéines Méthodologie Lire l absorbance à 280 nm de la fraction F3 contre un témoin convenablement choisi. Reporter la valeur obtenue dans le tableau correspondant de l annexe Compte-rendu Déterminer l ordre de grandeur de la concentration massique en protéines de la fraction F3. Données : - Pour la sérumalbumine bovine, la sensibilité de la méthode est voisine de 0,6 dm 3.g La sensibilité d une méthode de dosage est le rapport de l accroissement de la grandeur mesurée à l accroissement de la concentration en l élément dosé. Page 2/9

3 1-2- Dosage des protéines de la fraction F3 par la méthode de Folin-Lowry Principe Le réactif de Folin, mélange d acides phosphotungstique et phosphomolybdique, est réduit en un complexe de coloration bleue en présence de protéines. La sensibilité de la méthode est augmentée par l action préalable de sels de cuivre, en milieu basique, sur la liaison peptidique Gamme d étalonnage A partir de la solution étalon de sérumalbumine à 1 g.dm -3, préparer en tubes à hémolyse une gamme de 6 tubes de 0 à 50 µg par tube de la façon suivante : - x cm 3 de solution protéique éventuellement diluée, - (1-x) cm 3 d eau physiologique, - 5 cm 3 de solution cuproalcaline. Homogénéiser. Attendre 10 minutes puis ajouter : - 0,5 cm 3 de réactif de Folin dilué au 1/2. Homogénéiser immédiatement chaque tube puis laisser la coloration se développer 30 minutes à l obscurité. Lire l absorbance à 650 nm contre un témoin convenablement choisi. Reporter les valeurs d absorbance dans le tableau correspondant de l annexe Essais Pour doser les protéines de la fraction F3, effectuer deux dilutions de la fraction en tenant compte des résultats obtenus par méthode UV. Réaliser deux essais pour chacune des dilutions en suivant le protocole indiqué pour la gamme d étalonnage. Reporter les valeurs d absorbance dans le tableau correspondant de l annexe Compte-rendu - Présenter, en les justifiant, les dilutions effectuées. - Tracer la droite d étalonnage à l aide de l outil informatique puis calculer la concentration massique en protéines de la fraction F3. Donnée Incertitude relative : 4% Page 3/9

4 2- Détermination de la concentration d activité enzymatique de la fraction F3 à 37 C (utiliser le tube conservé dans la glace étiqueté "F3(1/100)enzymologie", il correspond à une dilution au 1/100 de la fraction F3) Le substrat utilisé est l ortho-nitrophényl-b-d-galactoside (ONPG) qui libère l orthonitrophénol (ONP) présentant un maximum d absorption à 410 nm. ONPG + H 2 O b-galactosidase ONP + Galactose Réactifs : - Tampon de réaction : - tampon phosphate de sodium 0,1 mol.dm -3, ph 7, - MgCl 2 1 mmol.dm -3, - 2-mercaptoéthanol 1 mmol.dm -3, - Solution d ONPG 4 mmol.dm -3 en tampon de réaction, - Solution d arrêt : - carbonate de sodium 1 mol.dm -3, - EDTA 4 mmol.dm -3, - ph> Protocole Introduire les réactifs dans l ordre indiqué (on réalisera la manipulation en tubes à hémolyse). Tube témoin Tubes essais Tampon de réaction Tampon de réaction 1 cm 3 1 cm 3 Solution d ONPG Solution d ONPG 2 cm 3 2 cm 3 Solution d arrêt Préincuber quelques minutes à 37 C 1 cm 3 0,1 cm 3 fraction Déclencher la réaction par ajout de 0,1 cm 3 de "F3(1/100)enzymologie" "F3(1/100)enzymologie" Arrêter la réaction après x minutes exactement par ajout de 1 cm 3 de solution d arrêt (on réalisera 5 tubes pour x = 1,2,3,4 et 5 minutes) Lire l absorbance des essais à 410 nm contre le tube témoin. Reporter les valeurs d absorbance dans le tableau correspondant de l annexe 3. Page 4/9

5 2-2- Compte-rendu - Justifier l ordre d addition des réactifs dans le témoin. - Tracer A 410nm = f (temps) sur papier millimétré. - Déterminer la variation d absorbance par minute en période de vitesse initiale. - Etablir la formule littérale de la vitesse initiale, v i, exprimée en µmol d ONP libéré par minute et par cm -3 de milieu réactionnel (U.cm -3 ). - En déduire la formule littérale de la concentration d activité catalytique de la fraction F3 puis la calculer en U. cm -3. Donnée : e ONP à ph d arrêt, à 410 nm = 430 m 2.mol -1 - Compléter le tableau de l annexe 2. - Commenter C- Dosage des ions Mg 2+ dans la solution servant à la préparation du tampon de réaction Principe Les cations divalents tels Ca 2+ et Mg 2+ sont dosés par complexométrie en milieu alcalin, par le sel disodique de l éthylène diamine tétra acétique (EDTA) selon la réaction suivante : X 2+ + [H 2 Y] 2 - Æ [XY] H + La fin de la réaction est mise en évidence, grâce à un indicateur de fin de réaction : [Ind-H 2 ] + X 2+ Æ [Ind-X] + 2 H + indicateur libre complexe indicateur-cation La couleur du complexe formé est différente de celle de la forme libre de l indicateur. Pour que le dosage soit possible, il faut que le complexe Ind-X soit moins stable que le complexe [XY] Etalonnage de la solution d EDTA environ 0,02 mol.dm -3 (2 essais) Préparer 100 cm 3 de solution étalon de calcium à environ 0,02 mol.dm -3 par pesée de CaCl 2, 2 H 2 O. Dans un erlen de 250 cm 3, introduire : - E = 10 cm 3 de solution étalon de calcium, - Environ 20 cm 3 d eau distillée, - Environ 2 cm 3 de solution de soude à 10%, - Une pointe de spatule d indicateur de Patton et Reeder, - Verser la solution d EDTA jusqu au virage au bleu franc. Reporter les volumes dans le tableau correspondant de l annexe 3. Page 5/9

6 2- Dosage de la solution de magnésium (2 essais) Dans un erlen de 250 cm 3, introduire : - E = 10 cm 3 de solution mère de Mg 2+ convenablement diluée, - 5 cm 3 de solution tampon ph 10, - une pointe de spatule d indicateur NET, - Verser la solution d EDTA précédemment étalonnée jusqu au virage au bleu franc. Reporter les volumes dans le tableau de correspondant de l annexe Compte-rendu - Etablir la formule littérale donnant la concentration de la solution d EDTA, C EDTA en fonction de m (masse de CaCl 2, 2 H 2 O pesée) et V le volume d EDTA versé pour l étalonnage. - Calculer la concentration de la solution d EDTA en mol.dm Etablir la formule littérale donnant la concentration de la solution de Mg 2+ en fonction de C EDTA et V le volume d EDTA versé pour le dosage. - Déterminer le volume de solution mère de MgCl 2 nécessaire pour préparer 1 dm 3 de solution tampon de réaction. Données : Concentration de la solution mère de MgCl 2 environ 1 mol.dm -3 M Ca = 40 g.mol -1 M Cl = 35,5 g.mol -1 Incertitude relative : Pour l étalonnage : 1% Pour le dosage : 2% Page 6/9

7 Annexe 1 : les étapes de la purification de la b-galactosidase Bouillon de culture de 48h d une souche d E.coli Etape 1 10 min à 3000g surnageant éliminé culot remis en suspension en tampon phosphate Etape 2 - Sonication - 20 min à 13000g culot éliminé surnageant = extrait brut Etape 3 - précipitation de l ADN à la spermine - 20 min à 13000g culot éliminé surnageant = F1 Etape 4 - précipitation au sulfate d ammonium à 40% - 20 min à 13000g surnageant éliminé culot remis en suspension en tampon phosphate = F2 Etape 5 chromatographie d exclusion sur colonne superose 12 ensemble des fractions d élution présentant une activité b-galactosidase = F3 Page 7/9

8 Annexe 2 : tableau récapitulatif du suivi de la purification de la b-galactosidase Etape de purification Volume (cm 3 ) Concentration en protéines (mg.cm -3 ) Masse de Protéines totale (mg) Concentration d activité (U.cm -3 ) Activité totale (U) Activité spécifique (U.mg -1 ) Rendement de purification Taux de purification Extrait brut F ,5 200 F F3 100 Page 8/9

9 Annexe 3 : feuille de relevé de résultats A- Suivi de la purification de la b-galactosidase Évaluation de la concentration massique en protéines par méthode spectrophotométrique UV. A 280 nm Dosage des protéines par la méthode de Folin-Lowry. Témoin réactifs Etalon 1 Etalon 2 Etalon 3 Etalon 4 Etalon Dilution 1 Dilution 2 5 Essai Essai Essai Essai A 650 nm Masse en µg de protéines Détermination de la concentration d activité catalytique A 410 nm Tube 1 min Tube 2 min Tube 3 min Tube 4 min Tube 5 min B- Dosage de Mg 2+ dans la solution ayant servi à la préparation du tampon de réaction. Etalonnage de la solution d EDTA disodique Essai 1 Essai 2 Masse de CaCl 2 pesée (en mg) V EDTA (en cm 3 ) Dosage de Mg 2+ dans la solution ayant servi à la préparation du tampon de réaction. Essai 1 Essai 2 V EDTA (en cm 3 ) Page 9/9