Corrélation entre l activité MPF et le taux de cycline Mesures dans l embryon de xénope après fécondation

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1 Corrélation entre l activité MPF et le taux de cycline Mesures dans l embryon de xénope après fécondation Mitose Mitose Mitose Interphase Interphase Interphase Activité MPF Quantité de cycline B

2 Corrélation entre l activité MPF et le taux de cycline Mesures dans l embryon de xénope après fécondation Activité MPF Activité histone H1 kinase Mitose Mitose Interphase Interphase Quantité de cycline B et de Cdc2 Etat du complexe actif cycline B - Cdc2: inactif inactif actif L état d activité du complexe dépend de modifications post-traductionnelles

3 Levure: Entrée en mitose: Non contrôlée par la quantité absolue des protéines constituant le MPF (Cdc2 ou Cdk1; cycline Cdc13) Contrôlée par l état d activation géré par Wee1 et Cdc25: +++ kinase phosphatase

4 Les sites régulateurs des Cdk s: Tyr 15 Mutant cdc2 de levure F15D: Mutation Y15F Wt Entrée en mitose+++ cdc2 D L effet inhibiteur de Wee1 ne s exerce plus L effet activateur de Cdc25 n est plus requis CIBLE de Wee1 et Cdc25: résidu Tyr de cdc2 Wee1 phosphoryle Tyr 15 de cdc2: phosphorylation inhibitrice Cdc25 déphosphoryle Tyr 15: activation

5 Les sites régulateurs des Cdk s: Tyr 15 Wee1 et Cdc25 ne sont pas en compétition: Activités régulées de façon complémentaire au cours du cycle Interphase Mitose Wee1 active inactive Cdc 25 inactive active MPF inactif actif P P

6 Les sites régulateurs des Cdk s: Thr14 S. Pombe Cdc2 (Cdk1) P Wee1 Tyr15 phosphorylation inhibitrice S. Cerevisiae P Swe1 Tyr15 phosphorylation inhibitrice Mik1 Tyr15, Thr14 phosphorylation inhibitrice Eucaryote sup P Wee1 Tyr15 phosphorylation inhibitrice + Myt1 Thr14 phosphorylation inhibitrice Renforcement de l inhibition Myt1: exprimée spécifiquement pendant la phase S

7 Les sites régulateurs des Cdk s: Thr161 Cdc2 (Cdk1) P CAK (Cdk-Activating Kinase) Thr161 phosphorylation activatrice Indispensable à l activité kinase

8 Les sites régulateurs des Cdk s: Tyr15, Thr14, Thr161 Phosphorylations inhibitrices > phosphorylation activatrice Phosphorylations régulatrices possibles seulement quand la Cdk est associée à sa cycline

9 Principe de régulation de l activité kinase des Cdk s INACTIVE Cycline B Wee1, Myt1 X Cycline B PROTEASOME Cdc25 P P CAK ACTIVE

10 Structure 3-D de Cdk2

11 La CAK: Cdk-activating kinase CAK: responsable de la phosphorylation activatrice de la Cdk en position Thr161 Identification de la SU catalytique: dans des extraits d œufs de Xénope: = produit du gène MO15 analyse de la séquence: Apparentée aux séquences des 6 Cdk répertoriées Appelée Cdk7 Identification de la SU régulatrice: dans des extraits d œufs de Xénope analyse de la séquence: Apparentée aux cyclines Appelée cycline H CAK= Cycline H Cdk7

12 La CAK: Cdk-activating kinase Rôle de CAK-AK (CAK-Activating Kinase) CAK phosphoryle Thr 161 de Cdk1 et les positions équivalentes des autres Cdk (2, 4, 6, ) Mais CAK est incapable de s autophosphoryler CAK a besoin d être phosphorylée sur la Thr 176 pour être active Intervention d une autre kinase: CAK-AK = CAK-Activating Kinase Positions T14 et Y15 non conservés sur Cdk7

13 La CAK: Cdk-activating kinase Rôle de KAP: déphosphorylation de Thr 161 KAP: Phosphatase duale: capable de déphosphoryler autant des sérines et thréonines que des tyrosines Déphoshorylation de Thr161, si Cdk dissociée de la SU cycline Homologue chez S. cerevisiae: Cdc14

14 Activation du MPF Pré-MPF Action des kinases sur Cdk1: Préactivation par phosphorylation de Thr161 (CAK) Etat inactif maintenu par l action des 2 phosphorylations inhibitrices (Wee1) Déphosphorylation des sites inhibiteurs Activation passagère du MPF Immédiatement contrée par l activité de Wee1 Constitution d un stock de pré-mpfdans la cellule en phase G2 fuite Pré-MPF MPF Wee1 stock de pré-mpf fuite Pré-MPF MPF Wee1 MPF MPF niveau de MPF activé > capacités de Wee1 Amorce de MPF disponible

15 Activation du MPF Auto-activation et amplification 1. MPF phosphoryle Wee1 et Cdc25 Activation de cdc25 Inactivation de Wee1 2. MPF phosphoryle et inhibe les inhibiteurs de ses activateurs Ex: Phosphatase qui désactive Cdc25 Tout le stock de pré-mpf est transformé en MPF actif Wee1 Pré-MPF inactif MPF actif Cdc25 PPase

16 Activation du MPF Auto-activation et amplification 3. Le MPF actif phosphoryle et active d autres kinases (MAPK ou kinase Polo) Activation et stabilisation de l état mitotique Wee1 CK II S6K Pré-MPF inactif MPF actif MAPK Cdc25 PPase MPM2-K

17 Inactivation du MPF En s auto-activant, le MPF induit également la pré-activation d une voie de dégradation protéolytique Inactivation du MPF en fin de mitose Mécanismes de surveillance, en phase G2 Inhibition de Cdc25 Ré-activation de Wee1

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19 Problème de l amorce pour l auto-amplification du MPF dans l oocyte d amphibien Progestérone Récepteur? Adénylate cyclase PKA camp ATP Synthèse protéique Cyc B1, B4 Ringo/Speedy Mos - XX Cdc25 P PKA Stock de Cdk1 Amorce de MPF actif Polo kinase (Plx/plk) Pré-MPF inactif Mos PP1 Cdc25 PP2A P P Cdc25 P Myt1 PP2A P Myt1 P MPF actif

20 Les niveaux de régulation des complexes cycline-cdk

21 DD-Checkpoint et réplication Checkpoint: Mise en évidence chez le Xénope Contrôle: Extrait activé d œufs de Xénope = Cyclage du MPF + Chromatine: surcharge ADN ADN à répliquer Retard d apparition du pic MPF + Chromatine + aphidicoline (inhibiteur des DNA-polymérases) impossible de répliquer l ADN pas d apparition du pic MPF

22 DD-Checkpoint et réplication Checkpoint Le niveau de réplication de l ADN est surveillé: ADN non répliqué ou ADN en cours de réplication Lésions sur l ADN Blocage de l activation du MPF Checkpoint de réplication Checkpoint de lésions de l ADN (DNA Damage Checkpoint)

23 DD-Checkpoint et réplication Checkpoint: Mise en évidence chez la levure (S. pombe) Lésion de l ADN après irradiation ou sous-réplication: Blocage automatique du cycle cellulaire La période de blocage permet à la levure de réparer ou lui donne simplement le temps de finir sa réplication Mutation Y15F dans la Cdk Cdc2: Perte de la capacité à effectuer le blocage après irradiation La phosphorylation de la Tyrosine 15 de Cdc2 est nécessaire au blocage du cycle Wee1 et Cdc25 sont impliquées

24 DD-Checkpoint et réplication Checkpoint: Mise en évidence chez la levure (S. pombe)

25 DD-Checkpoint et réplication Checkpoint chez les mammifères: ATM et ATR ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) et ATR (ATM-related): Homologues de Tell et Sp/Sc Rad3/Mec1 Recrutement de ATM ou ATR dépend de la lésion initiale de l ADN Appelées DNA-PK ATR: Intervient dans le R-Chkpt Ne s associe à la chromatine qu en phase S car la liaison est dépendante des amorces: Tant qu il y a des amorces, ATR est activée et phosphoryle Chk1 Activation du MPF bloquée Tant que la réplication est en cours, il n y a pas de possibilité d entrée intempestive en mitose

26 DD-Checkpoint et réplication Checkpoint chez les mammifères: ATM et ATR ATM: Intervient dans le DD-Chkpt Son activité est stimulée par des cassures d ADN qui génèrent des extrémités libres - Rad52 = cap des extrémités Rad 52 + ATM = RECOMBINAISON HOMOLOGUE Actif en fin de S et G2 (la concentration de Rad52 augmente) Ku70/Ku80 Actif en G1 (la concentration de Rad52 est faible) Dimérisation et recrutement de complexes protéiques - Ku70/Ku80 recrute ATM qui phosphoryle Chk2/Cds1 Blocage du cycle cellulaire, + complexes protéiques = NON-HOMOLOGOUS END JOINING