Travaux dirigés de Biologie Moléculaire L3-BH01. S. Bourgerie 1

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1 Travaux dirigés de Biologie Moléculaire L3-B01 S. Bourgerie 1

2 Bases puriques-pyrimidiques (1) Cytosine : 2-oxy-4-amino-pyrimidine Thymine : 2,4-dioxy-5-méthyl-pyrimidine ou 5-méthyluracile Uracile : 2,4-dioxy-pyrimidine 2

3 Bases puriques-pyrimidiques (2) Adénine : 6-amino-purine Guanine : 2-amino-6-oxy-purine 3

4 Équilibres tautomériques, 2 formules pour une même espèce «un proton peut occuper des positions différentes sur un squelette donné sans que les propriétés des espèces soient modifiées» => deux structures différentes sont en équilibre chimique. soit pour l'hybride Cétone/ alcool Imine/ amine Amino-cétone : Lactame Imino-alcool : Lactime 4

5 Tautomères de la thymine (et U) et de la guanine 5

6 Tautomères de la cytosine et de l adénine 6

7 Tautomères de la cytosine et de l adénine 7

8 Cas de l uracile et de la thymine Di-lactame lactame-lactime Di-lactime Les 3 formes tautomériques de l uracile (et T) à p 7,0 la forme lactame prédomine; les autres formes deviennent prééminentes lorsque le p diminue 8

9 Équilibres tautomériques : pour RESUMER R C 2 C R' 2 R C C R' R C imino R' R 2 C amino R' cytosine & adénine amino imino R C 2 R C amino-cétone (ou lactame) forme céto imino-alcool (ou lactime) forme énol thymine, uracile & guanine 9

10 Bases puriques et pyrimidiques : liaisons hydrogène 10

11 C 3 Appariement des paires de bases selon Watson et Crick T se A se se C G se 11

12 Paires de bases 12

13 Appariement : cas des formes tautomères 13

14 TAUTMERES 14

15 tautomères 2 15

16 omenclature des nucléosides et des désoxynucléosides bases nucléosides désoxynucléosides Adénine adénosine désoxyadénosine Guanine guanosine désoxyguanosine Cytosine cytidine désoxycytidine Uracile Uridine - Thymine - désoxythymidine base Base + sucre 16

17 17

18 2 ADEIE 2 base 2 ribonucléoside ADESIE - P - ADESIE-5 -MPSPATE (ou AMP) ribonucléotide ADESIE-5 -tripspate (ou ATP) ADESIE-5 -dipspate (ou ADP) P - P - - P - P - P - 18

19 ATP 19

20 Spectres Coefficient d absorption molaire des nucléotides (ε 260nm M -1.cm -1 ) -AMP GMP CMP UMP dtmp 9200 Spectres d absorption des bases puriques et pyrimidiques 20

21 Structure Structure d une unité nucléotidique de l AD et de l AR base base 2 P 3 5 P 3 5 La base purique ou pyrimidique est schématisée en bleu, le désoxyribose ou le ribose par la barre verticale verte, la liaison phospho-diester par la barre en diagonale et le groupement phosphate par la lettre P inscrite dans un cercle 21

22 Structure d une chaîne nucléotidique d AD base base base base P P P 5 P 5 P 5 P 5 22

23 dacg 23

24 3 5 C G T 3 5 P P P P P A C G P P P P P Schématisation de la disposition antiparallèle des brins de l AD 24

25 25

26 Pentoses 5' 4' 3' 2' 1' 5' 4' 3' 2' 1' β-d-ribose β-2-désoxy-d-ribose 26

27 27

28 Centrifugation en CsCl 28

29 L AR est sensible au traitement alcalin Mécanisme de l hydrolyse alcaline des AR La solution alcaline provoque la déprotonation du groupe 2 - et facilite l attaque nucléophile du noyau phosphore proche, ce qui entraîne le clivage de la chaîne de l AR. Il se forme un cycle phosphate lié aux C2 et C3 qui va être hydrolysé soit en 2 soit en 3 phosphate. 29

30 AR (d=2) plus dense que l AD (d=1,7) qui est lui-même plus dense que les protéines (d=1,4) A p 7,0 on obtient 2 bandes : la bande supérieure correspond à l AD du phage T4, l autre bande à l AR A p 12,0 on obtient 1 bande : uniquement celle correspondant à l AD : la bande d AR a disparu par suite de l hydrolyse de ce dernier en milieu alcalin. 30

31 Electrophorèse en gel d agarose Matériel nécessaire : Tampon d échantillon Cuve Support + scotch Peigne Erlen (chauffage de l agarose) Dissolution de l agarose à chaud Laisser refroidir Ajouter BET Pas de bulles! Cuve et agarose : mise en place du peigne. Prise en masse de l agarose Mise sous tension Cathode (-) et anode (+) Migration des molécules chargées positivement (cation) et négativement (anion). AD polyphosphate donc polyanion donc du au + Lecture sous UV : BET Migration Bleu clair : Xylène Cyanol, AD grande taille Bleu foncé : Bleu de Bromophénol, AD petite taille, front de migration Variable selon % agar 31

32 Effet p & action Dase sur AD double brin 32

33 Espèces moléculaires en présence 33

34 p 7,0 p 12,0 (-) (-) Continuum/ Smear (+) (+) incubation Brève Ménagée Brève Ménagée 34