Spectrométrie de Masse: introduction à l instrumentation utile en analyse protéomique
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- Louise Micheline Brousseau
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1 Spectrométrie de Masse: introduction à l instrumentation utile en analyse protéomique -Ionisation: - électronébulisation - MALDI -Analyseurs de masse: - Quadripôles et pièges à ions - Analyseurs à temps de vol -Spectrométrie de masse tandem: - Notion d énergie de collision - Analyseurs tandem à systèmes quadripolaires - Applications aux structures des biomolécules
2 Principe de la Spectrométrie de Masse Faible pression Introduction de l échantillon Source d ions M M (+/-) Analyseur M(+/-) m/z Détecteur m/z I Système de traitement des données 3 étapes essentielles: Ionisation de l échantillon Analyse des ions formés Détection du signal
3 Electronébulisation (Electrospray) John B. Fenn Prix Nobel de Chimie 2002 Premiers spectres ESI présentés par Fenn et col. en 1988 au congrès de l ASMS.
4 Electronébulisation: Principe
5 Source d ions par électronébulisation: Schéma général
6 Electronébulisation: formation du nébulisat (spray)
7 Processus Electrospray Gaz nébuliseur Lentilles de focalisation Contre électrode Cône de Taylor Capillaire porté à un haut potentiel Gaz rideau (N 2, 80 C)
8 Exemple de spectre de protéine m/z
9 Miniaturisation de la source electrospray: le nanospray
10
11 Source nanospray (Sciex)
12 Effet de collision à l interface: désolvatation et activation par collision
13 Localisation d une modification chimique sur un peptide 100 x R I I H T Y-NO 2 S m/z
14 Ionisation par désorption-désolvatation: MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation) IMSC, Bordeaux, 1988
15 MALDI: Principe
16 MALDI: cible réfrigérée (384 puits)
17 MALDI: Liste des principales Matrices Matrice Nom courant PM λ (nm) 1. Ac. 3-aminobenzoïque Ac. anthranilique 137,14 337, Ac. 5-chlorosalicylique 172,57 337, Ac. α-cyano-4 hydroxycinnamique HCCA 189,20 337, Ac. 2,5-dihydroxy-benzoïque 2,5-DHB 154,12 266, 337, Ac. 3,5-diméthoxy-4 hydroxycinnamique Ac. Sinapinique (AS) 224,21 337, Ac. 3-hydroxy picolinique 3-HPA 139,11 337, Ac. 2-(4-hydroxy-phénylazo)benzoïque HABA 242,24 266, 337, Ac. 9-nitroanthracène 9-NAC 222,23 337, Ac. 5-nitrosalicylique 183,12 337, Ac.3-pinacolique Ac. nicotinique 123, Ac.E-3-indole acrylique IAA 187,20 337, ,8-dihydroxy-9[10H]- anthracénone Dithranol (DT) 226,20 266, 337, nitrophényl octyl éther NPOE 251,33 337, 355
18 MALDI: Structures des principales Matrices CN CO 2 H Cl CO 2 H HO CH C COOH NH 2 OH HO CO 2 H CH CH CO 2 H OH OH N 4 CH 3 O OCH CO 2 H CO 2 H OH NO 2 N N OH 7 8 NO 2 CO 2 H OH N CO 2 H H C C CO 2 H H 9 10 N H 11 OH O OH O(CH 2 ) 7 CH 3 OH NO 2 12 HO COCH 3 OH
19 MALDI: Préparation de l échantillon méthode «standard» (dried droplet)
20 MALDI: Structures des principales Matrices 2,5 dihydroxy benzoïc acid (DHB) matrice adaptée pour les peptides, les sucres, les glycolipides, et les polymères synthétiques; C 7 H 6 O 4, m/z HO COOH OH α cyano-4-hydroxy cinnamic acid (HCCA) Bonne matrice pour les peptides et les protéines; C 10 H 7 NO 3, m/z CH C(CN)COOH HO
21 Analyseurs de masse Sir J. J. Thomson (Prix Nobel 1903)
22 Spectromètre de masse quadripolaire
23 Quadripôle: principe de fonctionnement Φ 0 = - U + V cosω RF t Φ 0 = U - V cosω RF t
24 Quadripôle: diagramme de stabilité
25 Quadripôle: trajectoire dans le champ quadripolaire (surface de potentiel)
26 Quadripôle tridimensionnel: le piège à ions (Ion Trap)
27 Piège ionique quadripolaire entrance endcap ring electrode electrode exit endcap electrode r z
28 Piège Ionique Quadripolaire: diagramme de Stabilité
29 Trajectoire des ions dans un piège à ions: figures de Lissajous
30 Piège Ionique Quadripolaire: diagramme de Stabilité Ions éjectés a z 8eU = 2 = 0 mr ω 2 0 a z Ions piégés q z = 4eV mr 2 0 ω Suivant ces lignes iso-beta z, les ions adoptent tous un mouvement périodique d une fréquence donnée (fréquence séculaire) q z
31 Piège Ionique Quadripolaire: diagramme de stabilité En augmentant progressivement l amplitude de la tension alternative V appliquée à l electrode annulaire, on éjecte du piège progressivement les ions suivant l ordre croissant de leur masse. Générateur RF V t
32 Piège Ionique Quadripolaire: Diagramme de Stabilité Ions éjectés q z = 4eV mr 2 0 ω 2 a z Ions piégés V= 500 volts q z
33 Piège Ionique Quadripolaire: Diagramme de Stabilité Ions éjectés q z = 4eV mr 2 0 ω 2 a z Ions piégés V= volts q z
34 Piège Ionique Quadripolaire: diagramme de Stabilité Ions éjectés q z = 4eV mr 2 0 ω 2 a z Ions piégés V= volts q z
35 Piège Ionique Quadripolaire: diagramme de Stabilité Ions éjectés q z = 4eV mr 2 0 ω 2 a z Ions piégés V= volts q z
36 Principe de l analyse MALDI-TOF A la sortie de l'espace d'accélération, l'ion acquiert un mouvement rectiligne uniforme (v = constante). Le temps t que met un ion pour parcourir toute la longueur L du tube de vol est calculé comme suit : mv 2 = zev 2 2zeV m v = t = xl m 2zeV MALDI-MS Laser UV m/z Analyseur TOF Détecteur V 0 Matrice/Échantillon
37 Principe de fonctionnement du réflectron MALDI-MS Détecteur m/z Laser UV Analyseur TOF Mirroir Electrostatique V 0 V Matrice/Échantillon 1 >V 0
38 MS/MS L art de faire fragmenter des ions stables
39 Notion de stabilité ionique L ionisation conduit à trois types principaux d ions Des ions stables: Ne se décomposent pas Constituent le pic indicatif du composé intact (molécule protonée ou cationisée) Longue durée de vie Des ions instables: Disposent d une grande quantité d énergie interne Se dissocient dans la source d ions Leurs fragments sont observés sur les spectres de masse Des ions métastables: Disposent d une énergie interne «moyenne» Disposent d une durée de vie «moyenne» Se dissocient durant le vol entre la source et le détecteur
40 Information structurale Poids Moléculaire Éléments de structure = ion précurseur stable = ion précurseur instable Qualité de L information Poids moléculaire IE IC CH 4 IC NH 3 FAB ESI MALDI Polarité des composés Information structurale
41 Information structurale L information structurale provient des ions instables ou métastables Les ions instables: Sont formés principalement par ionisation électronique ou chimique: non pertinent pour les macrobiomolécules Peuvent être formés par collision à l interface de la source electrospray Peuvent être formés dans la source MALDI (ISD) Les ions métastables: Se forment de façon «spontanée» Suivent des voies de fragmentation spécifiques qui relèvent de leur énergie interne et des conditions instrumentales Ne sont observables que par des expériences spécifiques (PSD sur spectromètres TOF) Solution: les ions stables étant formés avec un haut rendement par les méthodes dites «douces» (ESI et MALDI): il faut déstabiliser les ions stables
42 Comment dissocier des ions stables? Par dissociation induite par collision L énergie est apportée, hors de la source, à l ion incident par collision inélastique contre un gaz rare (Ar, He) + E lab collision + Ion excité Lors de la collision, une partie de l énergie cinétique de l ion précurseur est convertie en énergie vibrationnelle: E CM = E lab [M C /(M C +M i )] + Fragments (neutres et ioniques) avec: E CM (énergie au centre de masse) E lab (énergie cinétique de l ion incident) M C (masse de la cible) M i (masse de l ion)
43 Notion d énergie de collision Relation entre énergie interne et énergie au centre de masse Energie de Collision (E lab ) Energie au centre de masse (E CM ) Energie interne (E int ) E int E CM Basse énergie de collision Haute énergie de collision
44 Notion d énergie de collision Répartition des énergies internes en fonction de l énergie de collision (d après R. G. Cooks) Nombre d ions E int 3 ev 5 ev (quadripôle) 28 ev (quadripôle) kev (TOF-TOF) Énergie interne Basse énergie de collision: E lab < ev Haute énergie de collision: Elab > 1000 ev
45 Notion d énergie de collision Processus majeurs obtenus par collisions multiples de basse énergie Energie interne P + ** P + * F 1 + * F 3 + P + F 1 + F 2 + Nombre de collisions S + L accumulation d énergie interne par des collisions successives de basse énergie est caractéristique des systèmes quadripolaires
46 Notion d énergie de collision Appareils quadripolaires: Basse énergie de collision Collisions multiples Efficacité de collision élevée Bonne transmission des fragments Spectres MS/MS peu reproductibles sauf précautions Rendement et nature des fragmentations peuvent être optimisés Forte dépendance au mode de préparation des ions précurseurs Appareils TOF-TOF : Haute énergie de collision Peu de collisions (1 à 4) Faible section efficace de collision Spectres MS/MS reproductibles Peu de possibilités d amélioration du rendement de fragmentation Spectres MS/MS peu dépendants du mode d ionisation
47 Spectromètre tandem Spectromètre conventionnel Source d ions Analyseur Détecteur Spectromètre «tandem» Source d ions Analyseur 1 (MS 1) Cellule de collision Analyseur 2 (MS 2) Détecteur Espace Temps
48 Principaux modes d analyse des fragments formés sous CID Sans isolement physique de l ion précurseur: Dissociation en vol d ions métastables (Post-Source Decay, PSD) sur spectromètres à temps de vol (TOF) Isolement de l ion précurseur par MS1 puis analyse des fragments par MS 2: MS/MS dans l espace Triples quadripôles TOF-TOF Spectromètres hybrides Isolement de l ion précurseur, dissociation puis analyse des fragments dans la même enceinte: MS/MS dans le temps Pièges à ion (Ion Trap) FT-ICR
49 Principales expériences MS/MS sur un triple quadripôle [ion précurseur] +/- [ions fragments] +/- + neutres Source d ions Q1 Cellule de collision q2 Q3 Détecteur m/z fixe Spectre d ions produits (ou d ions fils) m/z fixe Spectre d ions précurseurs (ou d ions parents) Spectre de perte de neutre
50 Triples quadripôles: avantages et inconvénients Avantages: Pas de hautes tensions dans la source Haute vitesse de balayage Bonne transmission Bonne efficacité de la collision (confinement dans q2 en mode «RF-only») Inversion des modes positifs et négatifs possible sans ré-étalonnage Diverses expériences possibles simultanément (en fait en alternance rapide) L énergie de collision est modifiable sans affecter les valeurs de m/z : optimisation des ions diagnostics Inconvénients Résolution seulement unitaire Spectres peu reproductibles Basse énergie de collision
51 Pièges à ions: MS n
52 Pièges à ions: avantages et inconvénients Avantages: Appareil très sensible Résolution unitaire en sélection d ions Possibilité de MS n Possibilité de réactions induites par collision Inconvénients Seul le mode descendant est permis (spectre d ions produits) Présence fréquente de pics artéfactuels Nombre d ions limité (problème de charge d espace) Basse énergie de collision Gamme de masse limitée en MS/MS (perte de la partie inférieure du spectre)
53 Spectromètres TOF-TOF (Perseptive, M. Vestal)
54 Spectromètres hybrides: MS 1 MS2 Qualités requises pour MS 1: Couplage possible et efficace avec différentes sources d ions Résolution la meilleure possible pour la sélection de l ion précurseur Bonne transmission de l ion précurseur vers la cellule de collision Optique de l interface compatible avec celle de MS 2 Qualités requises pour MS 2: Bonne transmission Sensibilité de détection Résolution Possibilité de sélectionner un fragment (pour modes ascendants) Optique de l interface compatible avec celle de MS 1 Qualités requises pour MS 1- MS 2: Bonne efficacité de collision Différents régimes de collision Efficacité de collection des fragments avant introduction dans MS 2
55 Spectromètre tandem hybride Q-TOF Ions fragments Ion parent
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