PHARMACOGNOSIE. GUIDE DE TRAVAUX PRATIQUES 3ème ANNÉE. Enseignants 2013/2014

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1 PHARMACOGNOSIE GUIDE DE TRAVAUX PRATIQUES 3ème ANNÉE Enseignants 2013/2014 A. Blond, S. Boutefnouchet, X. Cachet, K. Cottet, G. Genta-Jouve, R. Grougnet, M. Kritsanida, F.-H. Porée

2 TABLE DES MATIERES Page Introduction 2 Examen microscopique d'une drogue végétale 2 Représentation conventionnelle des tissus 3 Réactions d'identification de métabolites secondaires 4 Contrôle d'une drogue végétale (Monographie) 6 Perte à la dessiccation et teneur en eau des drogues végétales 7 Drogues à hétérosides anthraquinoniques 8 Drogues à hétérosides flavoniques 10 Drogues à huile essentielle 12 Drogues à alcaloïdes 14 Hémisynthèse de la raubasine 17 Liste limitative des échantillons à reconnaître 19 1

3 NOTIONS ABORDÉES AU COURS DES TRAVAUX PRATIQUES DE PHARMACOGNOSIE Description d'une drogue végétale (aspects macro- et microscopiques) : quinquina, bourdaine, sophora et menthe poivrée. Screening phytochimique. Extraction sélective. Quantification de substances actives : alcaloïdes du quinquina, hétérosides de la bourdaine, flavonoïdes du sophora, terpènes de la menthe poivrée. Hémisynthèse : la raubasine. ANALYSE D'UNE DROGUE VÉGÉTALE L'analyse d'une drogue végétale débute par l'essai botanique qui consiste à décrire la drogue végétale sur le plan macroscopique (parties de plante utilisées, aspect, couleur, taille ) et sur le plan microscopique (étude de la coupe transversale, étude de la poudre avec recherche d'éléments caractéristiques). Les résultats des observations microscopiques seront retranscrits sous la forme de schémas. De plus, dans le cadre des Travaux Pratiques de Pharmacognosie, un "screening phytochimique" sera réalisé. Il repose sur la détection de certaines familles de métabolites secondaires : alcaloïdes, hétérosides anthraquinoniques et flavonoïdes. Ces tests n'ont qu'une valeur indicative et une étude physico-chimique dite de caractérisation sera ensuite mise en œuvre. Elle consiste à réaliser une chromatographie sur couche mince (CCM) en présence de témoins appropriés et permet ainsi d'identifier une ou plusieurs substance(s) active(s) (étude qualitative). entrepris. Pour certaines drogues (quinquina, bourdaine et sophora), un dosage de substances actives sera Ces différents points sont repris dans la monographie générale "Drogue végétale" de la Pharmacopée Européenne et sont appliqués dans le cadre du "contrôle d'une drogue végétale" EXAMEN MICROSCOPIQUE D'UNE POUDRE VÉGÉTALE Technique : "Montage" d'une poudre. 1) Sur une lame porte-objet déposer une goutte d'eau. Avec la pointe d'un scalpel ou d'une spatule, prélever une petite quantité de poudre et la délayer dans l'eau, sur la lame, jusqu'à ce que la poudre soit mouillée. Recouvrir d'une lamelle en appuyant légèrement avec le doigt. 2) Sur une deuxième lame faire un montage analogue en remplaçant l'eau par une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium ou de potassium à 5 p. cent m/v. Attendre quelques minutes, le milieu "éclaircit" les préparations en détruisant totalement ou partiellement certains éléments végétaux (amidon) inclus ou non dans les cellules de parenchymes. Les parois cellulaires sont plus nettes et plus faciles à observer, en particulier les éléments sclérifiés, cellules ou fibres et les cuticules. Les résultats de l'observation sont relevés sous la forme d'un dessin des éléments caractéristiques. 2

4 REPRÉSENTATION CONVENTIONNELLE DES TISSUS aluné. Les coupes transversales sont colorées par la technique de la double coloration vert d'iode carmin Principe Sur une coupe aussi fine que possible, on fait agir successivement des solutions d'hypochlorite de sodium et d'hydroxyde de sodium diluées. Les contenus cellulaires sont détruits, les parois cellulaires sont respectées. En faisant agir simultanément ou successivement vert d'iode et carmin aluné, les parois cellulosiques se colorent en rose, les parois lignifiées ou sclérifiées apparaissent en vert. Observations et dessins des coupes L'observation microscopique des coupes se fait à 2 grossissements : faible puis gros. Le faible grossissement renseigne sur la structure générale de la préparation. Le fort grossissement permet d'observer plus en détail des régions limitées de la préparation. Les résultats de l'observation sont relevés sous la forme d'un schéma d'ensemble réalisé avec les signes conventionnels donnés ci-dessous. 3

5 RÉACTIONS D'IDENTIFICATION DE MÉTABOLITES SECONDAIRES Les essais préliminaires sur une drogue végétale représentent toujours la première étape de son étude chimique et permettent d'orienter les recherches ultérieures. Les techniques de détection utilisables pour un "screening" des substances actives doivent être rapides, simples, reproductibles et sensibles afin de ne mettre en œuvre qu'une faible quantité de matière végétale. Ces méthodes sont donc limitées à la détection de quelques groupes chimiques. Elles n'ont d'ailleurs qu'une valeur indicative, et une confirmation ultérieure par des méthodes plus précises et plus sélectives est indispensable. Les différents métabolites recherchés au cours des travaux pratiques sont les flavonoïdes, les hétérosides anthraquinoniques et les alcaloïdes. Recherche des flavonoïdes Les flavonoïdes donnent une coloration rouge caractéristique en présence d'hydrogène naissant en milieu acide (réaction de la "cyanidine"). Manipulation Introduire dans un tube à essai 100 mg environ de poudre végétale. Ajouter 5 ml d'éthanol absolu. Chauffer à ébullition 2 min et filtrer dans un tube à essai. Ajouter 5 ml d'une solution d'alcool chlorhydrique et un petit fragment de tournure de magnésium. Il se développe une coloration rouge groseille. Attention : La réaction est exothermique. Ajouter très peu de magnésium. Diriger le tube à essai vers le mur. Recherche des hétérosides anthraquinoniques La réaction fondamentale de caractérisation des hétérosides anthraquinoniques est due à Bornträger. Elle est basée sur la coloration intense que fournissent les quinones lorsqu'elles sont en milieu fortement alcalin. Plus précisément, le traitement des 1,8-dihydroanthraquinones (génines libres oxydées) par une base forte (KOH, NaOH) conduit aux phénates correspondants de couleur rouge par effet bathochrome. Manipulation Introduire dans un tube à essai 200 mg environ de poudre végétale. Ajoutez 5 ml d'acide sulfurique à 10 %. Chauffez à ébullition au bain-marie pendant 2 min. Filtrez rapidement dans un tube à essai. Refroidir. Ajouter 5 ml d'acétate d'éthyle. Agitez pendant 2 min. Laisser décanter et récupérer la phase organique dans un tube à essai. Ajouter 2 ml d'une solution d'ammoniaque à 10 % ; il se développe une coloration rouge dans la phase aqueuse. Recherche des alcaloïdes Les alcaloïdes sont des bases organiques azotées, souvent hétérocycliques, principalement d'origine végétale et de distribution restreinte. Ils présentent des réactions de coloration et de précipitation communes et nombre d'entre eux possèdent, à faible dose, des propriétés pharmacodynamiques marquées. 4

6 La propriété générale des alcaloïdes la plus utilisée pour leur caractérisation est la formation de précipités colorés en milieu aqueux acide avec certains sels de métaux lourds et divers complexes iodés. En pratique, sont utilisées : - la solution neutre de mercuritétraiodure de potassium (réactif de MAYER) qui donne avec les alcaloïdes un précipité blanc, - la solution iodo-iodurée (réactif de BOUCHARDAT) qui produit un précipité brun, - la solution acide d'iodobismuthate de potassium ou de sodium (réactif de DRAGENDORFF) qui provoque l'apparition d'un précipité rouge à orangé, - la solution acide d'iodoplatinate de potassium qui provoque l'apparition d'un précipité gris ardoisé à brun rouge. Manipulation Introduire dans un tube à essai 1 g environ de poudre végétale. Ajouter 10 ml d'acide sulfurique à 10 %. Agiter énergiquement pendant 2 min et filtrer. Partager le filtrat en trois tubes.. Dans le 1 er tube, ajouter deux gouttes de réactif de MAYER, dans le 2 ème, deux gouttes de réactif de DRAGENDORFF, dans le 3 ème, deux gouttes de réactif de iodoplatinate de potassium. 5

7 CONTRÔLE D'UNE DROGUE VÉGÉTALE (d'après la monographie générale "Drogues végétales"de la Pharmacopée Européenne) IDENTIFICATION 1 ) Examen botanique Morphologie Caractères organoleptiques Examen microscopique de la coupe (si l'échantillon le permet) et de la poudre 2 ) Réactions colorées Identification par des réactions générales de groupe et par des réactions spécifiques d'un ou plusieurs principes actifs. Ces réactions sont effectuées après une extraction préalable. 3 ) Chromatographie sur couche mince Identification de l'un ou de plusieurs principes actifs (alcaloïdes, hétérosides, quinones, flavonoïdes, tanins) à partir de la solution à examiner. ESSAI Pureté de la drogue végétale (Recherche des éléments étrangers, recherche d éventuelles falsifications, de dégradations). - perte à la dessiccation et teneur en eau - teneur en cendres totales ou cendres insolubles dans HCl - essais spécifiques, essais limites - contamination microbiologique DOSAGE 1 ) extraction 2 ) purification de la liqueur extractive 3 ) dosage proprement dit, par des méthodes gravimétriques, volumétriques, spectrophotométriques (U.V. et visible), densitométriques (après chromatographie ou électrophorèse) ou encore chromatographiques (CPG- FID, CLHP-UV...). 6

8 PERTE À LA DESSICCATION ET TENEUR EN EAU DES DROGUES VÉGÉTALES (Ph. Eur.) La teneur en eau des plantes fraîches varie de 5 à 95 p. cent suivant les organes. Cette teneur est d'environ 5 à 15 p. cent pour les drogues végétales. Le dosage de l'eau dans les drogues végétales permet de vérifier leur bonne conservation. Il faut en outre tenir compte de la teneur en eau dans les dosages de principes actifs (rapportée à la matière sèche). On utilise couramment deux méthodes : - gravimétrique : perte à la dessiccation (2.2.32), limitée aux drogues ne contenant pas de principes volatils ; - volumétrique : détermination de l eau par entraînement azéotropique au toluène (2.2.13), utilisable pour les drogues à huiles essentielles. Perte a la dessiccation : Dessiccation à l étuve Chauffées pendant un temps suffisant à C, les drogues convenablement divisées subissent une perte de masse qui correspond sensiblement à la quantité d'eau qu'elles contenaient. Cette méthode n'est, bien entendu, pas applicable aux drogues renfermant des principes volatils. Technique Introduire dans un cristallisoir préalablement séché à l'étuve (voir salle des balances), refroidi dans un dessiccateur et taré, 2,000 g (ou 1,000 g suivant monographie) environ de drogue pulvérisée exactement pesée. Porter à l'étuve à C pendant une nuit. Laisser refroidir dans un dessiccateur et peser. Répéter l'opération jusqu'à l'obtention d'une masse constante. Calculer alors la teneur en eau pour 100 g de drogue. Méthode volumétrique : détermination de l eau par entraînement L'eau contenue dans une prise d'essai connue de drogue est entraînée par la vapeur d'un Eluant non miscible (toluène) avec lequel elle forme un mélange azéotropique. Après condensation, le mélange se sépare et le volume d'eau recueillie est mesuré. Le dosage se fait dans un appareil normalisé. Cette méthode est utilisée pour les drogues à huiles essentielles. 7

9 DROGUES À HÉTÉROSIDES ANTHRAQUINONIQUES Drogue étudiée : - Bourdaine (Rhamnus frangula L., Rhamnaceae), écorces de tiges Présence de dérivés anthracéniques polyhydroxylés qui sont les substances actives : anthraquinones libres (émodol, chrysophanol ), hétérosides anthraquinoniques (franguloside, glucofranguloside et bisglucofranguloside de la bourdaine), hétérosides d'anthranols et d'anthrones (frangularoside de la bourdaine, casanthranol du cascara ) hétérosides de génines dianthroniques (sennosides du séné). La génine de nature anthracénique peut exister à deux états d'oxydation différents : anthrone (forme "réduite") en équilibre tautomère avec la forme anthranol et anthraquinone (forme "oxydée"). OH OH OH OH O OH OH O OH R 2 R 1 R 2 R 1 R 2 O R 1 Anthranol Anthrone Anthraquinone R 1 : CH 3, CH 2 OH, CHO, COOH, COOCH 3 R 2 : H OH, OCH 3 Examen botanique 1 ) Caractères macroscopiques Fragments d'écorce cintrés ou plats, de faible épaisseur ; surface externe brun grisâtre portant de nombreuses lenticelles blanchâtres allongées transversalement ; surface interne rouge orangé à brun rouge ; cassure fibreuse. 2 ) Caractères microscopiques de la coupe transversale Suber épais contenant un pigment rouge brun et traversé par des lenticelles ; phelloderme collenchymateux ; liber en forme de cônes larges avec des rayons intra-libériens uni à trisériés ; présence de fibres péricycliques et libériennes sclérifiées ; mâcles et prismes d'oxalate de calcium dans les divers parenchymes. 3 ) Caractères microscopiques de la poudre Paquets de fibres très abondants accompagnés de tubes oxalifères avec prismes d'oxalate de calcium très réguliers (aspect en pavage), fragments de parenchyme cortical renfermant des mâcles d'oxalate de calcium, fragments de suber avec cellules imprégnées d'un tanoïde brun-rouge. Chromatographie sur couche mince 1 ) Solution à examiner Placer 0,5 g de poudre dans un tube à essai. Ajouter 5 ml d'alcool à 70 p. cent V/V. Chauffer jusqu'à ébullition au bain-marie. Refroidir. Filtrer sur papier. 8

10 2 ) Chromatographie - Eluant Bourdaine : acétate d'éthyle - méthanol - eau : 50-8,5-6,5 (V/V) - Dépôts : - solution extractive : 10 l - solution témoin Bourdaine : (indicateur de Rf) barbaloïne à 0,2 % dans de l'alcool à 70 p. cent V/V : dépôt : 10 l 3 ) Détection Après développement du chromatogramme, la plaque séchée sous hotte ventilée est examinée en lumière ultra-violette à 254 puis 366 nm et révélée par pulvérisation sous hotte ventilée d'une solution de potasse méthanolique à 10 % m/v. Dosage des hétérosides de la Bourdaine Principe : Dosage colorimétrique des dérivés hydroxyanthracéniques totaux 1 ) Extraction des hétérosides Introduire dans un ballon rodé de 100 ml, environ 0,250 g exactement pesés de poudre de bourdaine. Ajouter 45 ml de méthanol à 70 % (V/V). Surmonter le ballon d'un réfrigérant à reflux. Chauffer 15 minutes au bain-marie bouillant. Refroidir et filtrer sur une fiole jaugée de 50 ml. Ajuster au volume. Prélever 5,0 ml de solution méthanolique, les introduire dans un ballon à col rodé de 250 ml et ajouter 100 ml d'eau distillée. 2 ) Hydrolyse acide des hétérosides ( génines libres) A la solution préparée ci-dessus ajouter 5 ml d'acide chlorhydrique concentré. Mélanger. Placer le réfrigérant et chauffer 40 minutes à reflux. 3 ) Extraction des génines par un éluant organique Après refroidissement, transférer quantitativement dans une ampoule à décantation. Extraire par 20, puis 15, 10, 10 ml... de dichlorométhane jusqu'à extraction totale. Sécher les solutions organiques réunies sur sulfate de sodium anhydre. Filtrer sur une fiole jaugée de 100 ml (si le volume de dichlorométhane utilisé est supérieur à 100 ml, concentrer la solution à l'évaporateur rotatif). La solution organique est ajustée à 100,0 ml. 4 ) Dosage colorimétrique des hydroxy-anthraquinones Transférer 20,0 ml de solution organique dans un ballon d'évaporateur rotatif. Evaporer à sec. Dissoudre le résidu dans 10,0 ml d'une solution méthanolique d'acétate de magnésium à 0,5 % m/v. Mesurer l'absorbance à 515 nm en utilisant du méthanol comme Eluant de compensation. Calculer la teneur en dérivés hydroxy-anthracéniques totaux exprimés en glucofranguline A. L absorbance spécifique (A 1% 1cm) de la glucofranguline A à 515 nm est égale à 204. Selon la méthode de dosage utilisée aux Travaux Pratiques, les écorces de bourdaine renferment au minimum 7,0 p. cent de dérivés hydroxy-anthracéniques totaux, exprimés en glucofranguline A, calculé par rapport à la drogue desséchée. 9

11 HÉTÉROSIDES FLAVONIQUES Drogue étudiée : - Sophora (Sophora japonica L., Fabaceae), boutons floraux Le sophora constitue l'une des sources industrielles d'extraction du rutoside (3-O- -rutinose de quercétol), un hétéroside de flavonol. Les boutons floraux peuvent contenir jusqu'à 20 % de rutoside. Les hétérosides flavoniques résultent de la combinaison d'un ou plusieurs oses avec une génine polyphénolique dérivant de la 2-phényl-chromone. 2-Phénylchromone O O HO OH O O O O HO OH OH O HO OH OH O OH OH Rutoside 3-O- -rutinose de quercétol Examen botanique 1 ) Caractères macroscopiques Bouton de fleur, ovoïde à ellipsoïde ; calice présentant des stries longitudinales à la base ; pétales blanc jaunâtre non épanouies dépassant du calice ; pédicelles courts et minces. 2 ) Caractères microscopiques de la poudre poudre vert-jaunâtre ; grains de pollen arrondis ou triangulaires à trois pores ; fragments de pétales et de sépales présentant des stomates anomocytiques à 4-8 cellules annexes et portant des poils tecteurs. Chromatographie sur couche mince 1 ) Solution à examiner Placer 0,5 g de poudre dans un tube à essai. Ajouter 5 ml d'alcool à 70 p. cent V/V ou méthanol. Chauffer jusqu'à ébullition au bain-marie. Refroidir. Filtrer. 2 ) Chromatographie - Eluant Sophora : acétate d'éthyle - acide acétique - eau : (V/V) - Dépots : - solution témoin de rutoside à 0,1 % (m/v) : 15 l - solution témoin de quercétol à 0,1 % (m/v) : 15 l - Solution à examiner 3 ) Détection Après séchage de la plaque sous hotte ventilée, examiner en lumière visible, puis sous UV à 254 nm et 366 nm avant et après pulvérisation d une solution d AlCl 3 à 2 % (m/v) dans l éthanol. 10

12 Dosage des flavonoïdes du Sophora Principe : Dosage colorimétrique des flavonoïdes totaux 1 ) Préparation de la solution mère Introduire dans un ballon rodé de 250 ml environ 1,00 g exactement pesé de poudre de sophora. Verser 90 ml de méthanol, placer le réfrigérant et chauffer à reflux pendant 50 min. Laisser refroidir et filtrer la solution dans une fiole jaugée de 100 ml. Rincer le ballon d'extraction avec du méthanol et compléter à 100 ml. Prélever 10,0 ml de cette solution et compléter à 100 ml avec de l'eau. Agiter énergiquement. Cette solution constitue la solution mère. 2 ) Dosage colorimétrique des flavonoïdes totaux -Blanc (solution de compensation) : Prélever 10,0 ml de la solution mère et compléter à 20,0 ml avec du méthanol. -Solution à examiner : Prélever 10,0 ml de la solution mère et compléter à 20,0 ml avec une solution méthanolique de chlorure d'aluminium à 20 g/l. Après 15 min, mesurer l'absorbance de cette solution à 425 nm par rapport à la solution de compensation. Calculer la teneur en flavonoïdes totaux exprimés en rutoside. L absorbance spécifique (A 1% 1cm) du rutoside à 425 nm est égale à 370. Selon la méthode de dosage utilisée aux Travaux Pratiques, les boutons floraux du sophora renferment au minimum 16 p. cent de flavonoïdes totaux exprimés en rutoside, calculé par rapport à la drogue desséchée. 11

13 DROGUES A HUILE ESSENTIELLE Drogue étudiée : - Menthe poivrée (Mentha X piperita L., Lamiaceae), feuille Les huiles essentielles (HE) sont des mélanges, parfois complexes, de composés volatils et odorants (odeur aromatique). Elles sont entrainables par la vapeur d'eau, mais sont non miscibles à l'eau. Selon leur composition chimique, deux groupes sont distingués : HE à terpènes et HE à composés aromatiques. Examen botanique 1 ) Caractères macroscopiques feuille entière, brisée ou coupée, mince, cassante et fréquemment froissée ; limbe ovale ou lancéolé, acuminé au sommet, bordé de dents aiguës, de base asymétrique ; nervation pennée, proéminente sur la face inférieure, face inférieure légèrement pubescente ; poils sécréteurs visibles à la loupe ( 6) en points jaunâtres et brillants. 2 ) Caractères microscopiques de la coupe transversale Feuille banale ; nervure saillante sur la face inférieure ; arc libéro-ligneux. 3 ) Caractères microscopiques de la poudre fragments d épidermes portant des poils tecteurs et sécréteurs ; poils sécréteurs sont de 2 sortes : a) à pied unicellulaire et petite tête unicellulaire et b) à pied unicellulaire et tête renflée, ovale composée de 8 cellules rayonnantes ; poils tecteurs généralement sectionnés, effilés, unisériés, de 3-8 cellules, à cuticule striée ; poils tecteurs coniques, courts, unicellulaires ou bicellulaires ; présence de stomates diacytiques ; possibilité de cristaux jaunâtres de menthol sous la cuticule des cellules sécrétrices. Chromatographie sur couche mince 1 ) Solution à examiner Voir Partie Dosage pour l'obtention de la solution à examiner. 2 ) Chromatographie - Support : gel de silice F254 - Eluant : toluène - acétate d'éthyle : 47,5- -2,5 (v/v) - Dépots : - solution témoin menthol : 5 l - solution témoin menthone : 5 l - solution témoin acétate de menthyle : 5 l - solution témoin cinéole : 5 l - solution témoin HE de menthe poivrée : 5 l - solution à examiner 3 ) Détection Après séchage de la plaque sous hotte ventilée, examiner en lumière visible, puis sous UV à 254 nm et 366 nm et la plaque CCM est révélée par pulvérisation d une solution de vanilline sulfurique puis chauffée à 150 C. 12

14 Dosage Principe : Hydrodistillation ou entrainement à la vapeur d'eau (Ph. Eur.) Mode opératoire Introduire (avec l'aide d'un entonnoir à poudre) dans un ballon rodé de 1 L environ 20,0 g exactement pesés de feuilles séchées de menthe poivrée, préalablement contusées. Verser 300 ml d'eau et adapter l'appareil normalisé sur le col du ballon. Par la tubulure latérale, introduire la quantité d'eau nécessaire pour remplir le tube gradué et la tubulure intermédiaire. Chauffer modérément et maintenir la distillation pendant 2 h. Lire le volume d'huile essentielle recueille dans la tubulure graduée. Récupérer l'échantillon après dilution dans l'acétate d'éthyle (voir avec l'enseignant). Appareil normalisé (Ph. Eur.) Selon la méthode de dosage utilisée aux Travaux Pratiques, la feuille de menthe poivrée contient au minimum 12 ml/kg d huile essentielle dans la drogue entière et au minimum 9 ml/kg d huile essentielle dans la drogue coupée. L'étude qualitative par chromatographie sur couche mince (CCM) est complétée par une analyse par chromatographie en phase gazeuse (CPG) (renvoi aux Travaux Pratiques de Chimie Analytique). O OH OCOCH 3 O O O (-) menthol (-) acétate de menthyle (-) menthone (+) isomenthone 1,8-cinéole (+) pulégone 13

15 DROGUES À ALCALOIDES Drogue étudiée Quinquina (Cinchona pubescens Vahl., Rubiaceae), écorce Les alcaloïdes sont des bases organiques azotées, souvent hétérocycliques, principalement d'origine végétale et de distribution restreinte. Ils présentent des réactions de coloration et de précipitation communes et nombre d'entre eux possèdent, à faible dose, des propriétés pharmacologiques marquées. HX H R 3 R N 1 R 3 R N 1 R 2 OH R 2 Examen botanique 1 ) Caractères macroscopiques Ecorces de tiges ou de racines épaisses de 2 à 6 mm, plates ou roulées ; surface externe, grisbrunâtre, terne, rugueuse et fissurée ; surface interne brun-rougeâtre, cassure courte dans les couches extérieures et fibreuse dans les couches inférieures. 2 ) Caractères microscopiques de la coupe transversale Important suber brun ; phelloderme réduit ; parenchyme cortical comprenant des cellules sécrétrices (à gommes-résines et à tanins) ; cônes libériens étroits, comprenant des fibres isolées ou très rarement groupées, à lumen étroit et à section polygonale ; rayons libériens étroits. 3 ) Caractères microscopiques de la poudre Fibres libériennes longues et épaisses, jaunâtres, fusiformes, à lumen présentant des canalicules très apparents, élargis à la base (aspect en "aiguillon de rosier") ; débris de parenchyme contenant des cellules à sable. Chromatographie sur couche mince 1 ) Solution à examiner Dans un tube à essai contenant 0,10 g (quinquina) ou 0,25 g (ipéca) de drogue pulvérisée, ajouter sous hotte 0,1 ml d'ammoniaque concentrée et 5 ml de CH 2 Cl 2. Agitez énergiquement à plusieurs reprises pendant 30 min et filtrez. Evaporez le filtrat au bain-marie à sec et reprenez le résidu dans 1 ml d éthanol R. Effectuez un essai à la touche sur 5 ou 10 l. 2 ) Chromatographie - Support : gel de silice F Eluant : diéthylamine - acétate d'éthyle - toluène : (V/V) - Dépôts : solution témoin Quinquina : solution de quinine / quinidine / cinchonine / cinchonidine aux concentrations respectives de 0,35 / 0,05 / 0,2 et 0,2% (m/v) dans l'éthanol : 10 l, en bande 14

16 méthanol. touche". solution témoin Ipéca : solution de chlorhydrate d'émétine et de céphéline dans du solution extractive : volume à déposer en fonction de l'intensité de "l'essai à la 3 ) Détection Après développement du chromatogramme, sécher la plaque sous hotte ventilée, pulvériser de l'acide formique anhydre et laisser sécher à l'air, puis l'examiner en lumière ultraviolette à 365 nm. Dans un deuxième temps, révéler la plaque par le réactif à l'iodoplatinate. Dosage des alcaloïdes du Quinquina Les principes actifs du quinquina sont des alcaloïdes à noyau quinoléique relié par un groupement carbinol à un système quinuclidique porteur d'une chaîne vinyle: quinine et quinidine, cinchonine et cinchonidine ; deux à deux diastéréoisomères. R HO H N R : OCH 3, Quinine R : H, Cinchonidine R HO H N R : OCH 3, Quinidine R : H, Cinchonine N N Principe : Dosage des alcaloïdes type quinine et type cinchonine par spectrophotométrie à deux longueurs d onde (316 et 348 nm). 1 ) Extraction Peser avec précision une prise d'essai m voisine de 1,000 g d écorce de quinquina préalablement pulvérisée. Transférer quantitativement dans un ballon à col rodé de 250 ml. Humecter avec une quantité suffisante d une solution d hydroxyde de sodium à 10 % (m/v) en triturant doucement à l aide d un agitateur. Ajouter environ 70 ml de CH 2 Cl 2. Placer le réfrigérant et chauffer au bain-marie pendant 4 h. Après refroidissement, filtrer en recueillant la solution extractive dans une fiole jaugée de 100 ml. Compléter au trait de jauge avec du CH 2 Cl 2. 2 ) Purification Mesurer exactement 50,0 ml de cette solution à l aide d une fiole jaugée et les transférer de manière quantitative dans une ampoule à décanter. Extraire par au moins 5 fractions successives de 15 ml de solution d acide chlorhydrique 0,1 M. Recueillir les phases aqueuses dans une fiole jaugée de 200 ml. Vérifier, à l aide du réactif au mercuritétraiodure de potassium (réactif de Mayer), que 2 ml de la dernière solution extractive ne contiennent plus d alcaloïdes. 3 ) Dosage Compléter les solutions aqueuses acides réunies à 200,0 ml avec le même Eluant. Transférer 10,0 ml de cette solution dans une fiole jaugée et ajuster à 50,0 ml avec la solution d HCl 0,1 M. Mesurer l absorbance de cette solution à 316 nm et 348 nm (notées respectivement A 316 et A 348 ). 15

17 4 ) Calculs A une longueur d onde donnée, l absorbance d une solution de plusieurs substances est égale à la somme des absorbances partielles produites par ses différents constituants. Connaissant, à deux longueurs d onde différentes ( = 316 nm et = 348 nm), les absorbances mesurées A 316 et A 348 de la solution à doser et les coefficients d absorbance spécifique A 1% 1cm de la quinine (A 316q, A 348q ) et de la cinchonine (A 316c, A 348c ), et donc des alcaloïdes de type quinine et de type cinchonine, on déduit que : A 316 = (A 316q x Q) + (A 316c x C) et A 348 = (A 348q x Q) + (A 348c x C) où Q et C désignent les concentrations respectives d alcaloïdes du type quinine et du type cinchonine exprimées en g/100 ml dans la solution à doser avec A 316q = 99, A 316c = 148, A 348q = 124, A 348c = 14. Calculer la teneur en alcaloïdes totaux dans la drogue végétale desséchée et déduire la teneur en alcaloïdes du type quinine et du type cinchonine. Selon la méthode de dosage utilisée aux Travaux Pratiques, la drogue doit contenir au minimum 6,5 pour cent d'alcaloïdes totaux dont 30 à 60 pour cent sont constitués par des alcaloïdes du type quinine (drogue desséchée). 16

18 Extraction des alcaloides totaux de la pervenche tropicale et Hémisynthèse de la Raubasine L'extraction est ici effectuée à partir des racines de la pervenche tropicale : Catharanthus roseus (L.) G. Don - Apocynaceae. Les racines contiennent des alcaloïdes indolomonoterpéniques monomères. Les deux principaux sont la serpentine et la raubasine (= ajmalicine). Ils appartiennent au groupe de l'hétéroyohimbane. N H [H - ] N H N H H 3 CO 2 C O N H H H H 3 CO 2 C O Serpentine Raubasine 1 ) Extraction des alcaloïdes totaux Les alcaloïdes à extraire étant composés de bases tertiaires et quaternaires, l'éluant d'extraction choisi dans ce cas est un mélange à parties égales de dichlorométhane et de méthanol. Technique Dans une fiole conique de 250 ml, faire macérer 20 g de poudre de racines de Catharanthus roseus dans 100 ml d'un mélange à parties égales (v/v) de dichlorométhane-méthanol. Boucher avec un bouchon de liège, agiter et abandonner jusqu'au lendemain. - Décanter la solution extractive en la filtrant sur un filtre de papier plissé surmontant un ballon d'évaporateur rotatif de 250 ml préalablement taré. Evaporer à sec. - Extraire une seconde fois le marc par 100 ml de mélange dichlorométhane-méthanol à parties égales (v/v), pendant 1 h à température ambiante. Décanter et filtrer de nouveau sur le même ballon d'évaporateur rotatif. Conserver 1 ml du filtrat dans un tube à hémolyse étiqueté A pour effectuer ultérieurement une CCM. Evaporer à sec. Le résidu sec est pesé après refroidissement. Calculer le rendement en extrait brut. Sur le filtrat A effectuer un "essai à la touche" pour vérifier la présence d'alcaloïdes dans la solution extractive. 2 ) Hémisynthèse de la raubasine La raubasine est aisément obtenue à partir de la serpentine par réduction par le borohydrure de sodium ou de potassium dans le méthanol. Cette réaction de réduction est effectuée sur l'ensemble des alcaloïdes totaux obtenus précédemment. Technique Verser 10 ml de méthanol dans le ballon contenant le résidu sec d'alcaloïdes totaux. Fixer le ballon avec une pince en bois et placer le dans un "bain de glace" (mélange glace et chlorure de sodium) placé sous une hotte. Ajouter 500 mg de borohydrure de sodium (NaBH4) par petites fractions en agitant doucement. Observer le dégagement gazeux. Laisser la réaction jusqu'au lendemain. Diluer le milieu réactionnel à l'eau jusqu'à obtention d'un volume d'environ 80 ml. Vérifier que le ph est alcalin (bandelette papier ph). 17

19 Extraire les alcaloïdes par des fractions de 2 x 20 ml puis 6 x 10 ml de dichlorométhane (total de 100 ml). Réunir les phases organiques, les sécher sur sulfate de sodium anhydre puis les filtrer sur un ballon d'évaporateur rotatif de 250 ml préalablement taré. Conserver 1 ml de cette solution extractive dans un tube à hémolyse étiqueté B. Evaporer à sec la solution extractive, sous pression réduite. Peser après refroidissement et calculer le rendement en alcaloïdes réduits. 3 ) Isolement et purification de la raubasine Les alcaloïdes totaux réduits sont purifiés par chromatographie sur colonne de gel de silice. Il faut séparer la raubasine de la tetrahydroalstonine moins polaire. La raubasine base ainsi isolée sera ensuite cristallisée dans le méthanol. Technique : Montage de la colonne de gel de silice : Les conditions de montage de la colonne et d'élution des alcaloïdes seront précisées au cours des travaux pratiques (démonstration). - colonne de verre de diamètre 1,5 cm, - support : silice mesh (masse : 30 à 40 fois la masse d'alcaloïdes réduits obtenus (soit 8 g environ de silice), - Eluant colonne : dichlorométhane-méthanol v/v dans une fiole conique bouchée. Recueillir les fractions dans des tubes à essais selon les recommandations. Suivre l'élution de la raubasine par chromatographie couche mince en comparaison avec un témoin. Poursuivre jusqu'à élution totale de la raubasine (environ 20 tubes). CCM : support : gel de silice F 254. Eluant de migration : dichlorométhane-méthanol : 95-5 (v/v) Témoin : raubasine solution à 0,1 % dans le méthanol : 5 L. Dépôts : chaque tube : q.s. (voir sous U.V.) Révélateur : réactif de Dragendorff Réunir les tubes contenant de la raubasine pure dans un ballon d'évaporateur rotatif de 250 ml préalablement taré. Evaporer à sec. Peser après refroidissement. Calculer le rendement. 4 ) Cristallisation de la raubasine : (voir avec l'enseignant) Reprendre le résidu par le minimum de méthanol chaud et transférer quantitativement, à l'aide d'une pipette Pasteur munie d'une tétine de caoutchouc, dans un tube à cristalliser. Concentrer la solution au bainmarie en régularisant l'ébullition à l'aide d'un agitateur. Abandonner une nuit au réfrigérateur. Recueillir les cristaux obtenus sur une rondelle de papier filtre déposée sur un entonnoir de HIRSCH. Si nécessaire, rincer avec du méthanol froid. Laisser sécher les cristaux et calculer le rendement. Effectuer une CCM récapitulative (éluant de migration : dichlorométhane-méthanol : 95-5 v/v) - Dépôts : solutions extractives A, B, et C (un cristal dans 0,2 ml de méthanol), - Témoin : raubasine, solution à 0,1 % dans le méthanol : 5 l. - Révélation : examen en UV et pulvérisation du réactif de Dragendorff. 18

20 LISTE LIMITATIVE DES ECHANTILLONS A RECONNAITRE ALOES DU CAP, Aloe ferox Miller - Liliaceae. Suc concentré provenant des feuilles - Ph. Eur.- Masses brun foncé à reflets verdâtres, à cassure brillante - Odeur forte - Saveur très amère et désagréable (hétérosides anthracéniques). AUBEPINE, Crataegus laevigata. (Poiret) D.C. (C. oxyacantha L.), C. monogyna (Lindm.) Jacq. - Rosaceae. Sommités fleuries - Ph. Eur. Fleurs blanchâtres en petits corymbes accompagnées de fragments de feuilles et de tiges. BADIANE DE CHINE, Illicium verum Hook. - Magnoliaceae. (Anis étoilé). Fruits - Ph. Eur. - Fruit formé de 8 à 12 follicules insérés en étoile sur un pédoncule central, la columelle - Couleur brun-rougeâtre - Aspect dur et rugueux. Odeur agréable anisée - Saveur sucrée. (huile essentielle à anéthole). BELLADONE, Atropa belladona L. - Solanaceae Feuilles - Ph. Eur. - Feuilles accompagnées ou non des sommités florifères et fructifères (baie noire). BIGARADIER, Citrus aurantium L. ssp. amara Engl.- Rutaceae. (Oranger amer). (liste plantes méd. Ph. Fr. Xè éd). Feuilles - Feuilles assez grandes, à limbe ovale, entier, coriace, à pétiole ailé. BOLDO, Peumus boldus Molina. - Monimiaceae. Feuilles - Ph. Eur. Feuilles ovales, vert grisâtre, épaisses, rigides, cassantes Surface rugueuse - Odeur camphrée. Saveur aromatique (alcaloïdes : boldine...; huile essentielle). BOURDAINE, Rhamnus frangula L. Rhamnaceae. Ecorces - Ph. Eur. (cf p 9). CAMOMILLE ROMAINE, Chamaemelum nobile L. All.- Asteraceae. Capitules floraux - Ph. Eur. - Capitules floraux hémisphériques, formés de ligules blanc jaunâtre, ternes et lancéolées - Diamètre de 1 à 2 cm Odeur agréable - Saveur amère et aromatique. CASCARA, Rhamnus purshianus D.C. (Frangula purshiana (D.C.) A. Gray ex J.C. Cooper )- Rhamnaceae. Ecorces - Ph. Eur. (cf p 9). COLCHIQUE, Colchicum autumnale L. - Liliaceae. (liste plantes méd. Ph. Fr. Xè éd.) Graines - Petites graines brun foncé à surface ponctuée, dures et cornées. Diamètre 2 mm. (alcaloïdes : colchicine...). DATURA (STRAMOINE), Datura stramonium L. - Solanaceae. Feuilles - Ph. Eur. Feuilles et sommités florifères, parfois fruits. Feuilles entières, profondément découpées en 5 à 7 lobes, de 8 à 25 cm de long sur 7 à 15 de large. Couleur vert sombre. Odeur vireuse. Saveur amère. Sommités florifères à tiges plus ou moins ramifiées donnant à maturité une capsule épineuse. 19

21 DIGITALE POURPREE, Digitalis purpurea L. - Scrofulariaceae. Feuilles Ph. Eur. - Grandes feuilles ovales oblongues à pétiole ailé, de 10 à 30 cm de long sur 4 à 15 de large. Limbe irrégulièrement crénelé sur les bords - Face inférieure pubescente, blanchâtre, à nervures proéminentes (aspect gaufré). (hétérosides cardiotoniques). ERGOT DE SEIGLE, Claviceps purpurea (Fries) Tul. - Hypocreaceae. (liste plantes méd. Ph. Fr. Xè éd.) Sclérote - Sclérote subcylindrique arqué, obtus ouaminci à ses extrémités de 1 à 4 cm de long. Surface noir violacé. Cassure nette et blanchâtre à l'intérieur. Odeur désagréable. (alcaloïdes : ergotamine...). EUCALYPTUS, Eucalyptus globulus Labill. - Myrtaceae. Feuilles - Ph. Eur. - Longues feuilles falciformes de 25 cm de long sur 2 à 5 de large, à pétiole court, à limbe coriace et étroit. Couleur vert grisâtre sur les deux faces. Odeur forte et balsamique. (huile essentielle : eucalyptol). GINSENG, Panax ginseng C.A. Meyer - Araliaceae. Racines - Ph. Eur. - Racines pivotantes fusiformes ou cylindriques plus ou moins ramifiées, de faible densité - 10 à 25 cm de long - couleur blanc jaunâtre. Saveur âcre et amère. (saponosides : ginsénosides). GOMME ADRAGANTE, Astragalus gummifer Labill. - Fabaceae. Exsudat naturel ou provoqué par incision, du tronc ou des branches - Ph. Eur. - Rubans minces et aplatis à surface striée - Aspect translucide et corné. Couleur blanc à jaunâtre - Inodore, pratiquement insipide. GOMME ARABIQUE, Acacia senegal (L.) Willd. - Mimosaceae. Exsudat naturel ou provoqué par incision, du tronc ou des branches - Ph. Eur. - Masses arrondies, transparentes, jaune pâle à ambre. Cassure nette. Insipide, inodore. GOMME DE STERCULIA, Sterculia tomentosa Guill. et Perr., Sterculia urens Roxb. - Sterculiaceae. Exsudat naturel ou provoqué par incision, du tronc et des branches - Ph. fr. Xè éd. - Morceaux irréguliers, translucides, jaunâtre à rose. Odeur acétique, saveur lègèrement acide. HAMAMELIS, Hamamelis virginiana L. - Hamamelidaceae. Feuilles - Ph. Eur. - Grandes feuilles de 4 à 15 cm de long sur 3 à 10 de large, rougeâtres à limbe ovale, asymétriques à la base et sinuées sur les bords - Pétiole court - Saveur astringente. (tanins). IPECACUANHA, Cephaelis acuminata Karsten, Cephaelis ipecacuanha (Brot.) A. Rich.- Rubiaceae. Racines ou rhizomes et racines - Ph. Eur. (cf p 17) JABORANDI, Pilocarpus jaborandi Holmes - Rutaceae. (liste plantes méd. Ph. Fr.Xè éd.). Folioles - Folioles ovales de 2 à 5 cm de long sur 1 à 3 de large nettement échancrées au sommet - Couleur vert brunâtre. (alcaloïdes : pilocarpine...). KOLA, Cola acuminata (P. Beauv.) Schott et Endl. - Cola nitida (Vent. ) Schott et Endl. - Sterculiaceae. Graines privées de téguments - Ph. Eur. - Cotylédons tétraédriques, brun - acajou, lisses, durs - 3 à 5 cm de long sur 2 à 3 de large. (alcaloïdes : caféine). 20

22 MENTHE POIVREE, Mentha X piperita L. - Lamiaceae Feuille - Ph. Eur. - Feuilles entières ou coupée. Odeur aromatique marquée liée à la présence d'une huile essentielle. NOIX VOMIQUE, Strychnos nux vomica L. - Loganiaceae - Ph. fr. Xe éd. Graines discoïdes très dures, à bords renflés, tégument externe grisâtre et satiné - 2 cm de diamètre - Aspect dit "en bouton". Très toxique (alcaloïdes indoliques : strychnine...). PAVOT, Papaver somniferum L. - Papaveraceae. (liste plantes méd. Ph. Fr.Xè éd.) Capsules - Capsules ovoïdes ou sphériques, divisées en loges incomplètes à l'intérieur. Couleur gris jaunâtre à jaune paille. (alcaloïdes : morphine, codéine...). QUINQUINA, Cinchona ssp. - Rubiaceae Ecorce - Ph. Eur. (cf p 17) REGLISSE, Glycyrrhiza glabra L. - Fabaceae. Racines et stolons - Ph. Eur. - "Batons" de 10 à 15 cm de long sur 0,5 à 2 cm de diamètre, à écorce grisjaunâtre à brun, striés longitudinalement - Cassure jaune et fibreuse - Odeur agréable - Saveur sucrée. (saponosides : glycyrrhizine). RICIN, Ricinus communis L. - Euphorbiaceae. (liste plantes méd. Ph.Fr. Xè éd.). Graines - Graines ovoïdes à tégument marbré et brillant - couleur variable - 10 à 12 mm de long. (Huile; Tourteaux toxiques : protéines). SCILLE, Drimia maritima (L.) Stearn - Liliaceae.. (liste plantes méd. Ph. Fr. Xè éd.). Ecailles de bulbe dites squames - Squames coupées en lanières aplaties et recourbées. Aspect translucide - Couleur jaune pâle ou rosée. (hétérosides cardiotoniques). SENE, Cassia senna L. (Séné de Khartoum ou d'alexandrie) - Cassia angustifolia Vahl (Séné de l'inde ou de Tinnevelly) Fabaceae Folioles et gousses - Ph. Eur. (cf p 17) TILLEUL, Tilia cordata Miller. - Tilia platyphyllos Scop. - Tilia x vulgaris Heyne - Tiliaceae. Inflorescences munies de leurs bractées - Ph. Eur. - Aspect et odeur caractéristiques. VALERIANE, Valeriana officinalis L. - Valerianaceae. Rhizomes, racines et stolons - Ph. Eur. - Parties souterraines beige à gris-brun - Le rhizome porte de nombreuses racines plus ou moins fasciculées - Forte odeur désagréable. (iridoïdes : valépotriates...). VERVEINE ODORANTE, Aloysia triphylla (L'Hér.) Britt. (Lippia citriodora H.B.K.) - Verbenaceae. Feuilles - Ph. fr. Xè éd. - Feuilles à bord enroulé, à limbe mince, à nervure centrale saillante, à nervures secondaires parallèles - Couleur vert pâle Odeur aromatique caractéristique citronnée. (huile essentielle). 21