TECHNIQUES DE LABORATOIRE POUR LE DIAGNOSTIC DES BACTÉRIES PHYTOPATHOGÈNES

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1 TECHNIQUES DE LABORATOIRE POUR LE DIAGNOSTIC DES BACTÉRIES PHYTOPATHOGÈNES Ce document a pour objectif de présenter les diverses techniques utilisées au Laboratoire de diagnostic en phytoprotection pour la détection et l identification des bactéries phytopathogènes. L isolement des bactéries sur des milieux de culture généraux ou différentiels demeure souvent l étape de base pour le diagnostic des maladies bactériennes. À la suite de leur mise en culture, les bactéries sont identifiées par les techniques suivantes : Tests biochimiques classiques Système API 20E Système Biolog Test sérologique ELISA Test biologique Une détection des bactéries directement dans les tissus végétaux peut être réalisée par les techniques suivantes : Test sérologique ELISA Immunofluorescence (IMF) Des tests sont réalisés pour vérifier la résistance de certaines bactéries à des produits utiliser dans le cadre de la lutte antiparasitaire. Résistance du Xanthomonas campestris au cuivre Résistance de Erwinia amylovora à la streptomycine.

2 ISOLEMENT DES BACTÉRIES PHYTOPATHOGÈNES SUR DES MILIEUX DE CULTURE GÉLOSÉS L isolement des bactéries phytopathogènes, sur des milieux de culture gélosés, demeure souvent l étape de base pour le diagnostic des maladies bactériennes. Par la suite, diverses techniques peuvent être utilisées afin d identifier les bactéries isolées. Les milieux de culture utilisés au Laboratoire de diagnostic en phytoprotection sont de deux types : milieu différentiel : différents genres et espèces bactériens peuvent y croître mais ce type de milieu permet facilement de reconnaître un genre ou une espèce grâce à son apparence unique et caractéristique. milieu général : toutes les espèces bactériennes phytopathogènes peuvent y croître. Ces milieux de culture doivent contenir tous les éléments essentiels à la croissance d une bactérie soit des sources de carbone et d azote ainsi que des sels minéraux. Parmi les genres bactériens phytopathogènes les plus couramment identifiés au Laboratoire de diagnostic en phytoprotection, nous retrouvons : Agrobacterium, Clavibacter, Erwinia, Pseudomonas, Streptomyces et Xanthomonas. Cependant, d autres genres bactériens ont été également identifiés soit Acidovorax, Rhodococcus, Burkholderia et Ralstonia. Depuis la mise en place du Laboratoire de diagnostic en phytoprotection (1986), les principales espèces bactériennes identifiées sur les plantes cultivées reçues sont: Acidocorax avenae subsp. cattleyae (phalaenopsis) Agrobacterium tumefaciens (framboisier, bleuet, plantes ornementales, pommier) Burkholderia cepacia (oignon) Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (poivron, tomate) Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (pomme de terre) Erwinia amylovora (pommier, sorbier, poirier, framboisier) Erwinia carotovora subsp. atroseptica (pomme de terre) Erwinia carotovora subsp. carotovora (plusieurs espèces végétales) Erwinia tracheiphila (concombre) Pseudomonas corrugata (tomate) Pseudomonas fluorescens IVb, Pseudomonas marginalis et Pseudomonas viridiflava (plusieurs espèces végétales)

3 Pseudomonas syringae pv. apii (céleri) Pseudomonas syringae pv. lachrymans (cucurbitacées) Pseudomonas syringae pv. maculans (crucifères) Pseudomonas syringae pv. syringae (lilas, impatiens) Pseudomonas syringae pv. tomato (tomate) Ralstonia solanacearum (tomate) Rhodococcus fascians (géranium) Streptomyces spp. (pomme de terre, rutabaga, betterave, carotte) Xanthomonas campestris pv. armoraciae (crucifères) Xanthomonas campestris pv. begoniae (bégonia) Xanthomonas campestris pv. campestris (crucifères) Xanthomonas campestris pv. carotae (carotte) Xanthomonas campestris pv. cucurbitacearum (citrouille) Xanthomonas campestris pv. glycines (soya) Xanthomonas campestris pv. hederae (hedera) Xanthomonas campestris pv. pelargonii (géranium) Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (piment, tomate) Xanthomonas campestris pv. vitians (laitue) Xanthomonas fragariae (fraise)

4 PROTOCOLE POUR L ISOLEMENT DES BACTÉRIES SUR DES MILIEUX DE CULTURE GÉLOSÉS Eau physiologique stérile (NaCl 0,85%) tissu végétal symptomatique Prélever des pièces du tissu infecté et les laver à l eau du robinet. Sectionner les pièces en deux et les placer dans de l eau physiologique stérile. Laisser tremper de 20 minutes à 2 heures, selon la bactérie recherchée. 1/10 1/100 Pour les tissus présentant une pourriture molle, faire des dilutions 1/10 et 1/100. À l aide d une anse à inoculer stérile, ensemencer par épuisement des milieux de culture spécifiques à la bactérie recherchée, afin d'obtenir des colonies isolées. 1/10 1/100 À la suite d une incubation de 24 à 72 heures à 26 o C, vérifier la croissance bactérienne. Noter s il y a présence de colonies caractéristiques. À partir d une colonie isolée, inoculer un milieu de culture général afin de réaliser subséquemment des tests d identification.

5 SPÉCIFICATIONS SUR LA PRÉPARATION DES ISOLEMENTS, SUR LES MILIEUX DE CULTURE GÉLOSÉS ET LES TESTS D IDENTIFICATION SYMPTÔME PRINCIPAL BACTÉRIE PHYTOPATHOGÈNE SPÉCIFICATIONS POUR LA PRÉPARATION DES ISOLEMENTS MILIEU DE CULTURE TESTS POUR L IDENTIFICATION DES BACTÉRIES CHANCRE Erwinia amylovora Erwinia carotovora subsp. atroseptica* Erwinia carotovora subsp. carotovora* Pseudomonas corrugata Pseudomonas syringae Faire tremper dans l eau physiologique (0,85 %) de 40 à 60 minutes. Enlever l épiderme des tiges pour E. amylovora et P. syringae. CCT MS MS KB KB API 20E Tests biochimiques Tests biochimiques Biolog LOPAT *Faire des dilutions 1/10 et 1/100 FLÉTRISSEMENT/DÉPÉRISSEMENT Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis Erwinia amylovora Erwinia tracheiphila Ralstonia solanacearum Xanthomonas campestris pv. pelargonii Faire tremper dans l eau physiologique (0,85 %) 2 heures Enlever l épiderme des tiges. LPGA CCT NAP SMSA LPGA ELISA API 20E Test biologique Biolog ELISA POURRITURE MOLLE Burkholderia cepacia Erwinia pectinolytiques Erwinia amylovora Pseudomonas fluorescents et pectinolytiques Faire tremper dans l eau physiologique (0,85%) de 20 à 30 minutes. Faire des dilutions (1/10, 1/100) avant l étalement sur milieu de culture LPGA MS CCT KB Biolog Tests biochimiques API 20E LOPAT TACHE ET BRÛLURE FOLIAIRE Acidovorax avenae subsp. cattleyae Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis Pseudomonas syringae Xanthomonas campestris Xanthomonas campestris pv. campestris et Xanthomonas campestris pv. armoraciae Xanthomonas campestris pv. pelargonii Faire tremper dans l eau physiologique (0,85%) de 20 à 30 minutes KB LPGA KB LPGA LPGA LPGA Biolog ELISA LOPAT Biolog Test biologique ELISA

6 DESCRIPTIONS MORPHOLOGIQUES DES COLONIES BACTÉRIENNES SUR MILIEUX GÉLOSÉS PSEUDOMONAS FLUORESCENTS Lorsqu une bactérie du genre Pseudomonas fluorescent est soupçonnée, un milieu B de King (milieu KB) est inoculé et incubé à 26 o C pour 24 à 72 heures. Après le temps d incubation, nous recherchons sur le milieu de culture la présence de colonies bactériennes produisant des pigments fluorescents bleutés. Ces pigments sont visibles lorsque les milieux de culture sont exposés à la lumière ultra violet (UV). Dans l affirmative, des tests biochimiques connus sous le nom de LOPAT sont réalisés pour identifier l espèce bactérienne. Croissance : généralement abondante après 48 heures Colonie : blanchâtre à crème Pigment : fluorescent et diffusé dans le milieu Diamètre moyen : 1 à 3 mm (après 48 heures d incubation) ERWINIA PECTINOLYTIQUE Lorsqu une bactérie du genre Erwinia ayant une activité pectinolytique est soupçonnée, un milieu MS est inoculé et incubé à 26 o C pour 24 à 72 heures. Après le temps d incubation, nous recherchons sur le milieu de culture la présence de colonies bactériennes orangées ayant une marge nébuleuse. Dans l affirmative, des tests biochimiques classiques sont réalisés pour déterminer l espèce. Croissance : généralement abondante après 48 heures Colonie : orangée avec contour nébuleux Diamètre moyen : 2 à 8 mm (après 48 heures d incubation)

7 XANTHOMONAS Lorsqu une bactérie du genre Xanthomonas est soupçonnée, un milieu LPGA est inoculé et incubé à 26 o C pour 24 à 72 heures. Après le temps d incubation, nous recherchons sur le milieu de culture la présence de colonies bactériennes jaune pâle à jaune vif. Dans l affirmative, pour déterminer l espèce ou le pathovar, nous réalisons les tests suivants : Xanthomonas campestris test Biolog Xanthomonas campestris pv. armoraciae test biologique Xanthomonas campestris pv. campestris test biologique Xanthomonas campestris pv. pelargonii test ELISA 48 heures Croissance : généralement abondante après 48 heures Colonie : luisante, marge bien définie et ayant une couleur jaune pâle à jaune vif Diamètre moyen : moins de 1 mm (après 48 heures); il faut souvent attendre 72 heures pour obtenir des colonies de 1 à 2mm 72 heures CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SUBSP. MICHIGANENSIS Lorsque Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis est soupçonné, un milieu LPGA est inoculé à 26 o C pour 24 à 72 heures. Après le temps d incubation, nous recherchons sur le milieu de culture la présence de colonies bactériennes irrégulières, crème à jaunâtre. Dans l affirmative, pour déterminer l espèce, un test ELISA est réalisé. Croissance : généralement peu abondante après 48 heures Colonie : ronde à irrégulière ayant une couleur crème à jaune Diamètre moyen : moins de 1 mm (après 48 heures d incubation); il faut souvent attendre 72 heures d incubation pour obtenir des colonies de 1 à 2 mm.

8 ERWINIA AMYLOVORA Lorsque Erwinia amylovora est soupçonné, un milieu CCT est inoculé et incubé à 26 o C pour 24 à 72 heures. Après le temps d incubation, nous recherchons sur le milieu de culture la présence de colonies bactériennes particulièrement convexes et bleutées. Dans l affirmative, un test API 20E est réalisé pour identifier la bactérie. Croissance : généralement abondante après 48 heures Vue par du dessus du Pétri Colonie : vue du dessus, elles sont très convexes, luisantes et d une couleur grisâtre à bleutée Vue du dessous, elles présentent une marge luisante Diamètre moyen : 2 à 4 mm (après 48 heures d incubation) Vue du dessous du Pétri

9 TESTS BIOCHIMIQUES CLASSIQUES Bien que les tests biochimiques constituent une approche classique pour l identification des bactéries, il n en demeure pas moins qu ils sont particulièrement utiles pour la détermination de certaines espèces et sous-espèces de bactéries phytopathogènes. Grâce à ces tests, il est possible de connaître certaines caractéristiques du métabolisme des bactéries isolées. Les tests biochimiques permettent donc de vérifier si la bactérie a un métabolisme oxydatif ou fermentatif, s il y a formation d un acide à la suite de l utilisation d un hydrate de carbone (ex : glucose, arabinose, sorbitol...), si un composé particulier est utilisé comme seule source de carbone (ex : citrate, malonate...), si un acide aminé peut être transformé (ex : arginine, lysine, tryptophane...), si un enzyme particulier est présent (ex : oxydase, catalase, pectinase...) ou si des molécules complexes sont dégradées (ex : gélatine, amidon...). Au Laboratoire de diagnostic en phytoprotection, ces tests sont utilisés pour identifier les Erwinia pectinolytiques et les Pseudomonas fluorescents. 1. Si des colonies bactériennes, sur le milieu MS (Miller-Schroth), possèdent les caractéristiques d un Erwinia, les tests effectués pour vérifier s il s agit réellement d un Erwinia pectinolytique sont: oxydase, catalase, oxydation/fermentation, dégradation de la pectine (pectinase). Par la suite, pour différencier les espèces et les sous-espèces d Erwinia pectinolytique les tests suivants sont réalisés : transformation du sucrose en substances réductrices, utilisation du αméthyl-glucoside, production d indole et croissance à 35 o C : Tests biochimiques et culturaux pour distinguer les Erwinia pectinolytiques Tests Oxydase Catalase Oxydation/ Fermentation Pectinase α Méthylglucoside Sucrose Production d indole Croissance à 35 o C Erwinia Erwinia caratovora subsp. carovotora Erwinia carotovora subsp. atroseptica Erwinia chrysanthemi

10 Légende : Oxydase Catalase Fermentation Pectinase αméthyl-glucoside Sucrose Indole Détermination de la présence de l enzyme cytochrome C oxydase. Décomposition du peroxyde d hydrogène (H 2 O 2 ) par la catalase. Utilisation du glucose en condition anaérobie. Détermination de la présence de pectinases (substrat utilisé : l acide polygalacturonique). Utilisation du αméthyl-glucoside comme seule source de carbone. Transformation du sucrose en substances réductrices. Formation d indole à partir du tryptophane (acide aminé). 2. Si des colonies bactériennes fluorescentes, sur le milieu B de King, caractéristiques d un Pseudomonas sont présentes, les tests à réaliser (connus sous le nom de LOPAT) pour distinguer les espèces sont : production de levane, présence d oxydase, dégradation de la pectine (pectinase), présence d arginine déshydrolase et l hypersensibilité du tabac. Tests biochimiques et culturaux pour distinguer les espèces de Pseudomonas fluorescents Groupe Tests Pseudomonas Levane Oxydase Pectinase Arginine déshydrolase Hypersensibilité sur tabac Ia P. syringae Ib P. delphini II P. viridiflava III P. cichorii IV a P. marginalis IV b P. fluorescens V a P. tolaasii V b P. fluorescens

11 Légende : Levane Oxydase Pectinase Arginine déshydrolase Hypersensibilité du tabac Polymérisation du fructose en polyfructose (levane). Détermination de la présence de l enzyme cytochrome C oxydase. Détermination de la présence de pectinases (substrat utilisé : l acide polygalacturonique). Transformation de l arginine (acide aminé) par l arginine déshydrolase. Mise en évidence du pouvoir pathogène d une bactérie par le dessèchement des zones d inoculation sur les feuilles de tabac.

12 API 20E La galerie API 20E (biomérieux) est une version miniaturisée des tests biochimiques classiques destinés à l identification des Enterobacteriaceae (bactéries Gram négatif et anaérobies facultatives) dont font partie les Erwinia. Ce système regroupe 23 tests biochimiques. Des substrats déshydratés sont contenus dans des microtubes. Ces substrats sont mis en solution grâce à l addition d une suspension de la bactérie à identifier. À la suite d une période d incubation (24 heures à 30 o C), permettant à la bactérie de réagir avec les substrats, les diverses réactions sont notées afin de déterminer le code d identification composé de 7 chiffres. Au Laboratoire de diagnostic en phytoprotection, le système API 20E est utilisé pour l identification de Erwinia amylovora, agent responsable de la brûlure bactérienne chez les plantes de la famille des Rosaceae. Pour Erwinia amylovora, les principaux codes d identification obtenus avec API 20E sont et A- INOCULATION D UNE GALERIE API 20E A partir d une culture pure de 18 à 24 heures, faire une suspension bactérienne ayant une concentration de 10 8 bactéries/ml (standard McFarland No 5) dans 5 ml de saline stérile (NaCl à 0,85%) à un ph entre 5,5 et 7,0. Bien mélanger la suspension bactérienne au vortex 5-10 secondes. Contrôle de qualité : La suspension bactérienne doit être utiliser dans les 15 minutes suivant sa préparation. Déposer soigneusement 150 µl de la suspension bactérienne dans chaque cupule de la galerie en utilisant un embout stérile. Ajouter de nouveau 150 µl de la suspension bactérienne aux cupules CIT, VP et GEL (total = 300 µl) par puits. Après l inoculation, remplir les cupules ADH, LDC, ODC, H 2 S et URE d huile minérale. Ajouter de l eau dans les supports, y déposer la galerie et mettre le couvercle.

13 Placer les galeries dans une chambre humide (boîte de plastique avec couvercle contenant un papier humide) et incuber à 30 o C pendant 18 à 24 heures. B- LECTURE DES GALERIES Faire la lecture des galeries sous une hotte chimique. Consigner les réactions sur une fiche de résultats comme celle-ci : Légende : ONPG - ADH - LDC - ODC - CIT - H 2 S - URE - TDA - IND - VP - GEL - Détermination de la présence de l enzyme β-galactosidase Transformation de l arginine (acide aminé) par l arginine déshydrolase Transformation de la lysine (acide aminé) par la lysine décarboxylase Transformation de l ornithine (acide aminé) par l ornithine décarboxylase Utilisation du citrate comme seule source de carbone Production du sulfure d hydrogène (H 2 S) à partir du thiosulfate (S 2 O 3 ) Libération d ammoniac à partir de l urée grâce à l uréase Formation de l acide indolepyruvique à partir du tryptophane (acide aminé) grâce à la tryptophane désaminase Formation d indole à partir du tryptophane (acide aminé) Formation d acétoïne à partir du piruvate de sodium Liquéfaction de la gélatine (protéine) GLU (glucose), MAN (mammitol), INO (inositol), SOR (sorbitol), RHA (rhamnose), SAC (sucrose), MEL (mélobiose), AMY (amygdaline), ARA (L+arabinose) - formation d acide à la suite de l utilisation d un hydrate de carbone.

14 Contrôle de qualité : Lire et consigner toutes les réactions avant l addition des réactifs pour la réduction des nitrates et de l indole car ces réactions dégagent des produits gazeux qui peuvent interférer avec les autres épreuves de la galerie. Ne pas replacer le couvercle en plastique après l addition des réactifs. La lecture des galeries se fait généralement au bas de chaque cupule sauf CIT, IND. Lire en suivant l ordre ci-dessous (consulter le tableau des résultats annexé à cette technique) : VP - Ajouter 1 goutte d hydroxyde de potassium (40%) Ajouter 1 goutte d alpha-naphtol (6%) Attendre 10 minutes Pendant ce temps, faire la lecture des autres cupules sauf TDA et IND en inscrivant la couleur et la réaction (+ ou -) sur une fiche de résultats. Lire la réaction du VP GLU - Avant l addition des réactifs, observer s il y a présence de bulles (+ ou -) qui indiquent une réduction du nitrate à l état gazeux (N 2 ). Ajouter 2 gouttes d acide sulfanilique (0,8%) Ajouter 2 gouttes de NN-dimethyl-alpha-naphthylamine (0,05%) Attendre 2-3 minutes Pendant ce temps, faire les réactions TDA et IND. TDA - Ajouter 1 goutte de chlorure ferrique (10%), lire la réaction immédiatement. IND - Ajouter 1 goutte du réactif de Kovac, lire la réaction immédiatement. Lire la réaction GLU. Si la réaction est négative, ajouter de la poudre de zinc. Attendre 10 minutes et faire la lecture de cette dernière réaction. Exemple d une galerie du système API 20E avant l addition des réactifs

15 TABLEAU DES RÉSULTATS MÉTHODE DE 18 À 24 HEURES RÉACTIONS TUBE POSITIVE NÉGATIVE COMMENTAIRES ONPG Jaune Incolore Une teinte jaune pâle est souvent obtenue, la considérer comme une réaction négative. ADH Rouge ou orange Jaune LDC Rouge ou orange Jaune ODC Rouge ou orange Jaune CIT Turquoise ou bleu foncé Vert pâle ou jaune La lecture se fait dans la partie supérieure de la cupule (en aérobie). H 2 S Dépôt noir Aucun dépôt noir URE Rouge ou orange Jaune TDA Brun-rouge Jaune IND Anneau rouge Jaune VP Rose foncé ou rouge Incolore ou rose pâle Ajouter 1 goutte de chlorure de fer à 10%. Lire immédiatement la réaction. Ajouter 1 goutte du réactif de Kovac. Lire la réaction après 2 minutes. Ajouter 1 goutte de KOH à 40% puis 1 goutte d alphanaphthol à 6%. Lire la réaction après 10 minutes. GEL Diffusion du pigment Aucune diffusion, incolore La répartition des particules solides à travers la cupule doit être considérée comme une réaction négative.

16 RÉACTIONS TUBE POSITIVE NÉGATIVE COMMENTAIRES GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA Jaune Bleu ou bleu-vert La fermentation des sucres commence dans la partie la plus anaérobique de la cupule (partie inférieure). Il faut lire ces réactions à partir de la base de la cupule vers le haut. Une couleur jaune au fond indique une réaction positive. GLU N 2 gazeux (présence de bulles) Avant d additionner les réactifs, observer la présence de bulles dans la cupule GLU. Ceci indiquerait la réduction des nitrates en gaz (N 2 ). Réduction des nitrates Présence de NO 2 (rouge) Jaune Ajouter 2 gouttes d acide sulfanilique à 0.8% et 2 gouttes de NN-dimethylalphanaphtylamine à 0,5%. Lire la réaction après 2 ou 3 minutes. Présence de bulles et coloration jaune (après l ajout du réactif zinc Orange (après l ajout du réactif de zinc) Confirmer si la réaction est négative en ajoutant de la poudre de zinc. Lire la réaction après 3 ou 4 minutes.

17 BIOLOG Les plaques Biolog GN 2 sont utiliséés pour identifier les bactéries Gram négatif. L identification des bactéries est basée sur l utilisation de 95 sources de carbone. Une coloration pourpre est produite par la réduction de l indicateur, le tétrazolium, en un composé coloré le formazan. Représentation d une plaque GN 2 de Biolog contenant 95 sources de carbone. A- INOCULATION DES PLAQUES BIOLOG GN 2 Contrôle de qualité : Les plaques Biolog GN doivent être à température de la pièce (environ o C). La suspension bactérienne doit être utiliser dans les 15 minutes suivant sa préparation. Faire un test oxydase sur les bactéries à identifier (culture de heures). - Oxydase positive : non-entérobactérie - Oxydase négative : entérobactérie ou non-entérobactérie

18 Si le test oxydase est négatif, faire un test oxydation/fermentation à partir du glucose. Ce test nous permet de connaître si notre bactérie recherchée est une entérobactérie ou une non-entérobactérie. - Oxydation/fermentation positif : entérobactérie - Oxydation/fermentation négatif : non-entérobactérie Contrôle de qualité : Il est essentiel de bien définir si la bactérie à identifier est une entérobactérie ou une bactérie non-entérobactérie car la banque de données de Biolog est basée sur cette information. À partir d une culture pure de 18 à 24 heures, utiliser un cotton-tige stérile pour faire une suspension bactérienne dans un tube de 20 ml d eau physiologique stérile (NaCl 0,85%). La suspension bactérienne doit avoir une transmittance de : - de 52 % + ou 3 % si une non-entérobactérie - de 63 % + ou 3 % si une entérobactérie r l'électrophotomètre ou tubidimètre, lequel doit être calibrer avec les tubes standards de la compagnie Biolog Inc. Bien mélanger la suspension bactérienne à l aide du coton-tige. Si la suspension bactérienne n est pas homogène (formation d amas bactériens) ajouter 3 gouttes de sodium thioglycolate. Déposer 150 µl de la suspension bactérienne par puits.

19 Placer les plaques Biolog GN 2 dans une chambre humide et incuber 24 heures à 30 o C. B- LECTURE DES PLAQUES BIOLOG GN 2 L identification des bactéries par le système Biolog s appuie sur une base de données contenant les profils d utilisation de 95 sources de carbone par la majorité des espèces bactériennes phytopathogènes. Entrer la réaction de chaque puits dans le logiciel fourni par la compagnie Biolog Inc. Contrôle de qualité : Le puits A1 doit être incolore. S il est violet, ne pas lire la plaque. L'oxydation des substrats par la bactérie se traduit par l apparition d une couleur pourpre dans les puits. En l absence de l utilisation du substrat, le puits demeure incolore. C- INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS À la suite de la saisie des résultats, sur l utilisation des substrats par la bactérie inconnue, le système informatique Biolog compare ce profil à ceux des espèces contenues de la base de données. L identification est donc réalisée en jumelant le profil de la bactérie à identifier à celui de l espèce bactérienne phytopathogène présentant le plus de similarité. Avec le système Biolog, une identification est valable si le coefficient de similarité est supérieur à 0,50. Il est essentiel de considérer cette donnée lors de l interprétation des résultats pour le diagnostic.

20 Exemple d une identification réalisée par le système Biolog

21 TESTS SÉROLOGIQUES L utilisation d anticorps pour le diagnostic des maladies bactériennes représente une méthode spécifique et rapide. Au Laboratoire de diagnostic en phytoprotection, les tests sérologiques sont utilisés pour détecter une bactérie directement dans les tissus végétaux ou pour identifier une espèce bactérienne isolée sur milieu de culture gélosé. Les anticorps sont des protéines produites par le système immunitaire des vertébrés. Lorsqu un antigène (composante étrangère) est présent chez un vertébré, des anticorps sont élaborés contre celui-ci. Il est possible de produire commercialement des anticorps destinés au diagnostic des maladies bactériennes. En injectant, dans une souris ou un lapin, une cellule bactérienne ou une de ces composantes, des anticorps sont synthétisés contre cet antigène. À la suite du prélèvement du sang, les anticorps sont purifiés et ils peuvent être utilisés pour le diagnostic de l espèce bactérienne concernée.sur une cellule bactérienne, plusieurs sites antigéniques sont présents et chacun induit la production d anticorps. L injection d un antigène engendre donc la synthèse de plusieurs types d anticorps dont l ensemble est qualifié d anticorps polyclonaux. Il est possible d obtenir des anticorps réagissant spécifiquement avec un seul site antigénique. Ces anticorps sont dits monoclonaux. La spécificité accrue des anticorps monoclonaux permet de réaliser un diagnostic des plus fiable. TEST SÉROLOGIQUE ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) Au Laboratoire de diagnostic en phytoprotection, le test ELISA est utilisé pour identifier la bactérie responsable de la tache bactérienne chez le géranium soit Xanthomonas campestris pv. pelargonii et la bactérie responsable du chancre bactérien chez la tomate soit Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. Dans ces cas, la bactérie est isolée sur milieu de culture et le test ELISA permet d identifier le pathovar. Pour le Xanthomonas campestris pv. pelargonii et le Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, la technique employée est le «double antibody sandwich.d une façon générale, cette approche comporte quatre étapes soit le recouvrement des puits d une plaque en polystyrène par un anticorps spécifique à la bactérie recherchée, l ajout de la suspension bactérienne, l addition d un anticorps, spécifique à la bactérie recherchée, auquel un enzyme a été lié (anticorps conjugué) et finalement l ajout du substrat de l enzyme ainsi que la lecture de la plaque à une longueur d onde appropriée. Dans le présent cas, l enzyme utilisé est la phosphatase alcaline. L addition d un substrat, le p-nitrophényl phosphate, est alors transformé par la phosphatase alcaline en p-nitrophénol lequel est un composé jaune si la bactérie à identifier est du Xanthomonas campestris pv. pelargonii ou du Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis.

22 1- RECOUVREMENT DES PUITS oooooooooooooo ooooooooooooooooo oooooooooooooooooo Anticorps de recouvrement Incubation Lavages 2- ADDITION DE L ANTIGÈNE oooooooooooooo oooooooooooooooo ooooooooooooooooo Suspension bactérienne Incubation Lavages 3- ADDITION DE L ANTICORPS LIÉ À L ENZYME (phosphatase alcaline) oooooooooooooo ooooooooooooooooo ooooooooooooooooo Anticorps lié à l enzyme Incubation Lavages 4- ADDITION DU SUBSTRAT (p-nitrophényl phosphate) ET LECTURE Substrat Incubation Lecture

23 TEST BIOLOGIQUE Le test biologique utilisé pour le diagnostic des maladies bactériennes sert à différencier deux bactéries phytopathogènes affectant les crucifères soit Xanthomonas campestris pv. campestris (nervation noire) et Xanthomonas campestris pv. armoraciae (tache bactérienne). La base de ce test consiste à l inoculation de plantules de chou et à l observation de symptômes différentiels. A- INOCULATION DE PLANTULES DE CHOU La distinction entre le Xanthomonas campestris pv. campestris et le Xanthomonas campestris pv. armoraciae se fait par l inoculation de plantules de chou au stade première feuille (environ 8 à 10 jours après le semis). À l aide d un scalpel stérile, enlever un des cotylédons en ne brisant pas la tigelle. À partir d une culture pure de 24 heures, inoculer à l aide d un cure dents stérile la tige à l endroit où le cotylédon a été excisé. Inoculer 3 isolats différents pour chaque échantillon. Incuber à 24 o C dans un cabinet de croissance ayant une photopériode de 12 heures et une humidité relative de 80%. Inoculer des plantules de chou avec des témoins : Xanthomonas campestris pv. campestris et Xanthomonas campestris pv. armoraciae. B- INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS Un examen visuel se fait après 4, 7 et 14 jours suivant l inoculation des plantules de chou avec la bactérie. Réaction de Xanthomonas campestris pv. armoraciae : Après 4 à 7 jours, des lésions noires apparaissent le long de la tige au site d inoculation.

24 Réaction de Xanthomonas campestris pv. campestris : Aucun symptôme avant 10 à 14 jours. Les symptômes se caractérisent par un jaunissement débutant habituellement à la marge des feuilles, accompagné d un noircissement des nervures plus ou moins important selon la virulence de la bactérie. Absence de noircissement de la tige comme avec Xanthomonas campestris pv. armoraciae RÉFÉRENCE Alvarez, A.M., A.A. Benedict, C.Y. Mizumoto, J.E. Hunter et D.W. Gabriel Serological, pathological, and genetic diversity among strains of Xanthomonas campestris infecting crucifers. Phytopathology 84 :

25 IMMUNOFLUORESCENCE L immunofluorescence est utilisée pour la détection de Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus dans les tiges ou les tubercules de pomme de terre soupçonnés d être affectés par le flétrissement bactérien. L utilisation d un composé fluorescent (isothiocyanate de fluorescéine) conjugué à un anticorps constitue la base de cette technique. C est grâce à l observation microscopique sous une lumière ultraviolet qu il est possible de visualiser les bactéries. Dans le cas d un échantillon contenant du Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus les cellules bactériennes émettent une fluorescence vert brillant grâce à l isothiocyanate de fluorescéine. 1- RECOUVREMENT AVEC L ANTIGÈNE ou Extraction Incubation dans le tampon Dépôt sur lame IMF Sécher à 50 o C Fixer dans l acétone 2- ADDITION DE L ANTICORPS SPÉCIFIQUE À Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus Anticorps Incubation, lavages et séchage 3- ADDITION DE L ANTICORPS CONJUGUÉ À L ISOTHIOCYANATE DE FLUORESCÉINE

26 4- LECTURE AU MICROSCOPE À FLUORESCENCE Les anticorps utilisés sont des anticorps de surface. Nous pouvons voir au microscope la forme rénale de la bactérie qui nous paraît fluorescente.

27 TEST DE LA RÉSISTANCE AU CUIVRE Le test de la résistance au cuivre a pour objectif de vérifier si les bactéries du genre Xanthomonas sont sensibles ou résistantes au cuivre afin d orienter les producteurs dans leur intervention au champ pour lutter contre certaines maladies bactériennes associées au Xanthomonas.. A- PRÉPARATION DES CULTURES BACTÉRIENNES Sur milieu de culture levure peptone glucose agar (LPGA), repiquer 4 colonies bactériennes isolées afin d obtenir des cultures pures. Diviser la boîte de Pétri en 4 quadrants. Incuber à 26 o C pendant 24 à 48 heures. B- RÉALISATION DU TEST DE RÉSISTANCE AU CUIVRE. Identifier 3 quadrants sur les boîtes de Pétris du milieu levure peptone glucose agar (LPGA) et d un milieu cuivre pour les bactéries à tester. Identifier 2 quadrants pour les témoins sensible et résistant au cuivre sur les mêmes milieux. A partir d une culture pure de 18 à 24 heures, inoculer à la fois un milieu de culture levure peptone glucose agar (LPGA) qui sera notre témoin de croissance des bactéries testées et un milieu cuivre contenant 200 ppm de CuSO 4. La croissance sur ce dernier milieu révélera donc la résistance de la bactérie au cuivre. Incuber à 26 o C pour 48 heures. À la suite de l incubation, lire la réaction comme suit : Observation d une croissance sur le milieu cuivre: indique que la bactérie est résistance au cuivre Aucune croissance sur le milieu cuivre: indique que la bactérie est sensible au cuivre. Il est bien sûr toujours important de se référer au témoin positif de croissance.

28 MILIEUX POUR LA CULTURE DES BACTÉRIES ET LA RÉALISATION DES TESTS BIOCHIMIQUES 1. MILIEUX GÉLOSÉS POUR LA CULTURE DES BACTÉRIES MILIEU CCT (milieu différentiel pour Erwinia amylovora) g/l Sucre de table Sorbitol Tergitol anionic 7 (solution de 1%) Crystal violet (solution de 0.1% dans éthanol) 30.0 ml 2.0 ml Nutrient agar * Cycloheximide Préparer les diverses solutions. Dissoudre les produits un à un sauf la cycloheximide dans 800 ml H 2 O distillée. Ajouter les diverses solutions aux produits dissous. Compléter à 1 litre avec H 2 O distillée. Stériliser 15 minutes à 121 o C et à 15 psi. * Dissoudre la cycloheximide dans 10 ml H 2 O distillée stérile et l ajouter lorsque le milieu a atteint 45 o C. Laisser agiter 10 minutes et couler 18 à 20 ml de milieu par boîte de Pétri. NOTES : Stériliser au moins 25 à 30 minutes si nous préparons 3 litres de milieu.

29 Laisser 3 jours à la température de la pièce (environ o C) afin de s assurer de la stérilité du milieu. Toujours inoculer le milieu avec une bactérie de référence pour connaître la morphologie des colonies et la vitesse de croissance de la bactérie recherchée. Conserver à la noirceur à 4 o C. RÉFÉRENCE ISHIMARU, C. and E.J. KLOS, New medium for detecting Erwinia amylovora and its use in epidemiological studies. Phytopathology vol. 74: MILIEU B DE KING (King s medium B agar) (milieu différentiel pour Pseudomonas fluorescents) Protéose peptone #3 (Difco) Phosphate de K dibasique (K 2 HPO 4 ) Sulfate de Mg (MgSO 4.7H 2 O) Agar (Bacto) g/l Glycérol 15.0 ml Dissoudre les produits un à un dans 800 ml H 2 O distillée. Compléter à 1 litre avec H 2 O distillée. Stériliser 15 minutes à 121 o C et à 15 psi. Couler 18 à 20 ml de milieu par boîte de Pétri lorsqu il a atteint 50 o C. NOTES : Stériliser au moins 25 à 30 minutes si nous préparons 3 litres de milieu.

30 Laisser 3 jours à la température de la pièce (environ o C) afin de s assurer de la stérilité du milieu. Toujours inoculer le milieu avec une bactérie de référence pour connaître la morphologie des colonies et la vitesse de croissance de la bactérie recherchée. Conserver à la noirceur à 4 o C. RÉFÉRENCES KING, E.O., M.K. WARD and D.E. RANEY Two simple media for demonstration of pyocyanin and fluorescein. Journal of Laboratory and Clinical Medicine 44, SHAAD, N.W., Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. P.3. MILIEU LPGA (milieu Levure Peptone Glucose Agar) g/l Glucose Peptone (Bacto) Extrait de levure Agar (Bacto) Dissoudre les produits un à un dans 800 ml H 2 O distillée. Ajuster le ph entre 7.2 et 7.3. Compléter à 1 litre avec H 2 O distillée. Stériliser 15 minutes à C et à 15 psi. Couler 18 à 20 ml de milieu par boîte de Pétri lorsqu il a atteint 50 o C.

31 NOTES : Stériliser au moins 25 à 30 minutes si nous préparons 3 litres de milieu. Laisser 3 jours à 22 o C afin de s assurer de la stérilité du milieu. Toujours inoculer le milieu avec une bactérie de référence pour connaître la morphologie des colonies et la vitesse de croissance de la bactérie recherchée. Conserver à la noirceur à 4 o C. MILIEU MS (Miller-Schroth medium) (milieu différentiel pour Erwinia spp.) g/l Acide nicotinique L-asparagine (en poudre) Phosphate de K dibasique (K 2 HPO 4 ) Sulfate de Mg (MgSO 4.7H 2 O) Taurocholate de Na (Difco) Mannitol Agar (Bacto) Dissoudre les produits un à un dans 800 ml H 2 O distillée. Lorsque ces produits sont dissout, ajouter : ml/l Tergitol Acide nitrilotriacétique (sol n de 2%) g ac. nitriloacétique g hydroxyde de K (KOH) dissoudre dans 100 ml H 2 O distillée Bleu de bromothymol (sol n de 0.5%) 9.0

32 Rouge neutre (sol n de 0.5%) 2.5 Hydroxyde de Na (NaOH 1N) g NaOH/100 ml H 2 O *Cycloheximide (sol n 1%) 5.0 Préparer les diverses solutions sauf la cycloheximide et les ajouter aux produits dissouts. Ajuster le ph à environ 7.3. Compléter à 1 litre avec H 2 O distillée. Stériliser 15 minutes à 121 o C et à 15 psi. * Dissoudre la cycloheximide dans 10 ml H 2 O distillée stérile et l ajouter lorsque le milieu a atteint 45 o C. Laisser agiter 10 minutes et couler 18 à 20 ml de milieu par boîte de Pétri. NOTES : Stériliser au moins 25 à 30 minutes si nous préparons 3 litres de milieu. Laisser 3 jours à 22 o C afin de s assurer de la stérilité du milieu. Toujours inoculer le milieu avec une bactérie de référence pour connaître la morphologie des colonies et la vitesse de croissance de la bactérie recherchée. Conserver à la noirceur à 4 o C. RÉFÉRENCE MILLER, T.D. and M.N. SCHROTH, Monitoring the epiphytic population of Erwinia amylovora on pear with a selective medium. Phytopathology 62 :

33 2. MILIEUX POUR LA RÉALISATION DES TESTS BIOCHIMIQUES MILIEU ARGININE g/l Peptone (bacto) Chlorure de Na (NaCl) Phosphate de K dibasique (K 2 HPO 4 ) Agar (Bacto) Rouge phénol (sol n de 0.1%)* 10.0 ml Arginine HCl *Dissoudre 0.1g de rouge phénol dans 100 ml d éthanol (solution de 0.1%). Mélanger les autres produits un à un dans 800 ml H 2 O distillée ; ajouter le rouge phénol. NOTE : Ne pas chauffer le milieu, seulement l agiter à l aide d un barreau magnétique. Il est normal que l agar ne se dissolve pas complètement. Ajuster le ph à 7.1. Compléter à 1 litre avec H 2 O distillée. Distribuer 3ml de milieu par tube (16 mm) en agitant constamment afin de bien répartir l agar. Stériliser 10 minutes à 121 o C à 15 psi. NOTE : Il est important de ne pas dépasser le temps de stérilisation car l arginine est sensible à une stérilisation de plus de 10 minutes. Le milieu sera jaune à la sortie de l autoclave et deviendra rose en refroidissant.

34 Laisser 5 jours à la température de la pièce (environ o C) avant de l utiliser. Toujours inoculer un milieu avec des colonies de références pour connaître les réactions positive et négative de ce test. Pseudomonas marginalis (positif) : milieu rose Pseudomonas viridiflava (négatif) : milieu jaune orangé Conserver à la noirceur à 4 o C. RÉFÉRENCE Thornley, M.J., The differentiation of Pseudomonas from other Gramnegative bacteria on the basis of arginine metabolism. Journal of Applied Bacteriology, 23 : MILIEU LIQUIDE INDOLE (production d indole) g/l Peptone (Bacto) Chlorure de Na (NaCl) Dissoudre les produits un à un dans 800 ml H 2 O distillée. Compléter à 1 litre avec H 2 O distillée. Distribuer 3 ml de milieu par tube (16mm). Stériliser à l autoclave 15 minutes à 121 o C et à 15 psi. NOTES : Laisser 3 jours à la température de la pièce (environ o C) afin de s assurer de la stérilité du milieu. Toujours inoculer un milieu avec des colonies de références pour connaître les réactions positive et négative de ce test.

35 Escherichia coli (positif) : présence d un anneau rouge en surface après l addition du réactif de Kovac Erwinia amylovora (négatif) : présence d un anneau jaune en surface après l addition du réactif de Kovac Conserver à la noirceur à 4 o C. RÉFÉRENCE LELLIOTT, R.A., and R.S. DICKEY Genus VII. Erwinia Winslow, Broadhurst, Buchanan, Krumweide, Rogers and Smith 1920, 209. Pages In Noel R. Krieg and John G. Holt (eds.). Bergey s Manual of Systematic Bacteriology. Volume 1. Williams and Wilkins, Baltimore, Md. MILIEU LEVANE g/l Nutrient agar D - glucose Sucre de table Dissoudre les produits un à un dans 800 ml H 2 O distillée. Compléter à 1 litre avec H 2 O distillée. Stériliser 15 minutes à 121 o C et à 15 psi. Couler 18 à 20 ml de milieu par boîte de Pétri lorsqu il a atteint 50 o C. NOTES : Laisser 3 jours à la température de la pièce (environ o C) afin de s assurer de la stérilité du milieu. Toujours inoculer un milieu avec des colonies de références pour connaître les réactions positive et négative de ce test.

36 Pseudomonas marginalis (positif) : strie saillante et brillante. Présence d une zone opaque et «lumineuse» en marge de la strie (observation en dessous de la boîte de Pétri). Pseudomonas viridiflava (négatif) : strie prostrée. Conserver à la noirceur à 4 o C. MILIEU α METHYL-D-GLUCOSIDE Solution 1 g/l Phosphate de K monobasique (KH 2 PO 4 ) Phosphate de K dibasique (K 2 HPO 4 ) Chlorure d ammonium (NH 4 Cl) Solution 2 g/l Agar (Bacto) Acide casamino (Difco) Solution 3 g/100ml Sulfate de Mg (MgSO 4.7H 2 O) Solution 4 g/100ml α methyl-d-glucoside Solution 5 g/100ml Sel de tetrazolium (C 19 H 15 N 4 Cl) 1.000

37 Préparer toutes les solutions avec de H 2 O distillée ; dissoudre les produits un à un dans 800 ou 80 ml H 2 O distillée et compléter à 1 litre ou 100 ml selon la solution préparée. Mélanger 500 ml des solutions 1 et 2 (pour obtenir un volume final de 1 litre). Stériliser 20 minutes à 121 o C et à 15 psi. Pendant ce temps, stériliser à l autoclave : 1.0 ml de la solution ml de la solution ml de la solution 5 20 minutes à 121 o C et à 15 psi. Laisser refroidir les 3 solutions stériles. Ajouter ces solutions stériles aux deux premières lorsque le milieu aura atteint 45 o C. Laisser agiter 10 minutes et couler 18 à 20 ml de milieu par boîte de Pétri. NOTES : Laisser 3 jours à la température de la pièce (environ o C) afin de s assurer de la stérilité du milieu. Toujours inoculer un milieu avec des colonies de références pour connaître les réactions positive et négative de ce test. Erwinia carotovora subsp. atroseptica (positif) : gros points bourgognes Erwinia carotovora subsp. carotovora (négatif) : Petits points bourgognes avec contour blanc Conserver à la noirceur à 4 o C. RÉFÉRENCE DYE, D.W., A taxonomic study of the genus Erwinia. I. The «amylovora» group. N.Z.J. Sci. 11:

38 MILIEU PECTINASE (activité pectinolytique des Erwinia) Agar (Bacto) Extrait de levure Sulfate d ammonium ((NH 4 ) 2 SO 4 ) (sol n de 20%) Glycérol (sol n de 87%) g pour 519 ml H 2 O distillée g pour 20 ml H 2 O distillée 5.0 ml 5.0 ml * Acide polygalacturonique (sol n de 2%) ml * Tampon phosphate 0.1 M à ph ml NaH 2 PO g Na 2 HPO g dissoudre dans 1 litre H 2 O distillée ajuster le ph à 8.0 Acide Casamino (sol n de 20%) 10.0 ml H 2 O distillée Sulfate de Mg (MgSO 4.7H 2 O) 1M g / 100 ml H 2 O distillée ml 1.0 ml Préparer les diverses solutions. Dissoudre l agar et l extrait de levure dans H 2 O distillée. Ajouter les diverses solutions sauf l acide polygalacturonique (2%) et le tampon phosphate (0.1M) aux produits dissouts. NOTE : Ajouté le sulfate de Mg en dernier. Stériliser 15 minutes à 121 o C et à 15 psi. *Pendant ce temps, stériliser à l autoclave l acide polygalacturonique (2%) et le tampon phosphate (0.1M) 15 minutes à 121 o C et à 15 psi. Laisser refroidir les solutions stériles et les ajouter au milieu lorsque celui-ci aura atteint 45 o C.

39 Laisser agiter 10 minutes et couler 18 à 20 ml de milieu par boîte de Pétri. NOTES : Stériliser au moins 25 à 30 minutes si nous préparons 3 litres de milieu. Laisser 3 jours à la température de la pièce (environ o C) afin de s assurer de la stérilité du milieu. Toujours inoculer un milieu avec des colonies de références pour connaître les réactions positive et négative de ce test. Erwinia carotovora subsp. atroseptica (positif) : présence d un halo blanc (zone de précipitation) après l addition d acétate de cuivre. Erwinia amylovora (négatif) : absence d un halo après l addition d acétate de cuivre. Conserver à la noirceur à 4 o C. MILIEU PH (milieu Pectine Hildebrand) (activité pectinolytique des Pseudomonas) Bleu de bromothymol g/l Chlorure de Ca (CaCl 2.2H 2 O) (sol n de 10%) 10.0 ml Acide polygalacturonique Agar (Bacto) (sol n de 4%)* ml Dissoudre dans l ordre les 3 premiers produits un à un dans 800 ml H 2 O distillée bouillante en maintenant une agitation constante (doit bouillir très fortement pour dissoudre l acide polygalacturonique). Ajuster le ph à 8.4 avec du NaOH 1N. Compléter à 1 litre avec H 2 O distillée.

40 Stériliser à l autoclave 15 minutes à 121 o C et à 15 psi. * Dissoudre 4 g. d agar dans 100 ml H 2 O distillée ; stériliser à l autoclave 15 minutes à 121 o C et à 15 spi. Après stérilisation, ajuster de nouveau le ph à 8.4. Ajouter la solution stérile d agar 4%. Couler 18 à 20 ml de milieu par boîte de Pétri lorsque le milieu est un peu refroidi. NOTES : Laisser 5 jours à la température de la pièce (environ o C avant de l utiliser. Toujours inoculer un milieu avec des colonies de références pour connaître les réactions positive et négative de ce test. Erwinia carotovora subsp. carotovora (positif) : dépression du milieu entourant le point d inoculation Erwinia amylovora (négatif) : aucune dépression Conserver à la noirceur à 4 o C. RÉFÉRENCE HILDEBRAND, D.C., Pectate and pectin gels for differentiation of Pseudomonas sp. and other bacterial plant pathogens. Phytopathology 12 :

41 BOUILLON TRANSFORMATION DU SUCROSE EN SUBSTANCES RÉDUCTRICES (RS) g/l Sucrose Peptone (Bacto) Extrait de bœuf Dissoudre les produits un à un dans 800 ml H 2 O distillée. Ajuster le ph à 7.0. Compléter à 1 litre avec H 2 O distillée. Distribuer 3 ml de milieu par tube (16 mm). Stériliser à l autoclave 15 minutes à 121 o C et à 15 psi. NOTES : Laisser 3 jours à la température de la pièce (environ o C) afin de s assurer de la stérilité du milieu. Toujours inoculer un milieu avec des colonies de références pour connaître les réactions positive et négative de ce test. Erwinia carotovora subsp. atroseptica (positif) : milieu jaune après l addition du réactif de Bénédict et incubation dans eau chaude. Erwinia carotovora subsp. carotovora (négatif) : milieu bleu après l addition du réactif de Bénédict et incubation dans eau chaude. Conserver à la noirceur à 4 o C. RÉACTIF DE BENEDICT (réactif ajouté pour la réduction du sucrose) g/l Citrate de Na (Na 3 C 6 H 5 O 7.2H 2 O) 173.0

42 Carbonate de Na (Na 2 CO 3 ) 85.5 Sulfate de Cu (CuSO 4.5H 2 O) 17.3 Dissoudre les produits un à un dans 800 ml H 2 O distillée. Compléter à 1 litre avec H 2 O distillée. NOTES : Travailler sous la hotte car il y aura dégagement de gaz. Conserver à la noirceur (bouteille ambrée) à la température de la pièce (environ o C) RÉFÉRENCE SCHAAD, N.W., Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria, 2 nd Edition. The American Phytopathological Society.p.53.

43 3. MILIEUX GÉLOSÉS POUR LA DÉTECTION DE LA RÉSISTANCE AUX PRODUITS ANTIPARASITAIRES MILIEU CUIVRE (milieu pour la résistance des Xanthomonas au cuivre) g/l Nutrient agar Sulfate de Cu (CuSO 4 ) Dissoudre les produits un à un dans 800 ml H 2 O distillée. Compléter à 1 litre avec H 2 O distillée. Stériliser 15 minutes à 121 o C et à 15 psi. Couler 18 à 20 ml de milieu par boîte de Pétri. NOTES : Stériliser au moins 25 à 30 minutes si nous préparons 3 litres de milieu. Laisser 3 jours à la température de la pièce (environ o C) afin de s assurer de la stérilité du milieu. Toujours inoculer le milieu avec une bactérie de référence pour connaître la sensibilité de la bactérie au cuivre : Xanthomonas campestris vesicatoria (résistante). Conserver à la noirceur à 4 o C. RÉFÉRENCE STALL R.E., University of Florida, Plant pathology department, Institute of food and agricultural sciences.

44 TESTS POUR L IDENTIFICATION DES BACTÉRIES PHYTOPATHOGÈNES ARGININE DÉSHYDROLASE Le test arginine déshydrolase sert à déterminer si la bactérie transforme l arginine (acide aminé) par l enzyme arginine déshydrolase. À l aide d une anse à inoculer stérile, inoculer le milieu de culture arginine avec la bactérie à identifier (culture de heures). Ajouter environ 1 cm d huile minérale stérile. Incuber à 26 o C pour 24 à 48 heures. À la suite de l incubation, lire la réaction obtenue. Réaction positive : le milieu demeure rose Réaction négative : le milieu devient jaune orangé CATALASE Le test catalase sert à démontrer si la bactérie possède l enzyme catalase servant à décomposer le peroxyde d hydrogène (H 2 O 2 ). Dans un couvercle d une boîte de Pétri ou sur une lame, déposer une goutte de peroxyde d hydrogène 3%. À l aide d un cure-dent prendre la bactérie à identifier (culture de heures) et la déposer dans la solution de peroxyde d hydrogène. Attendre environ 2 minutes et lire la réaction obtenue : Réaction positive : présence de bulles révélant le dégagement d oxygène Réaction négative : absence de bulle

45 HYPERSENSIBILITÉ SUR LE TABAC Le test d hypersensibilité du tabac sert à mettre en évidence le pouvoir pathogène d une bactérie par le dessèchement des zones d inoculation sur les feuilles de tabac. Dans un tube contenant 2 ml d eau physiologique stérile (NaCl 0,85%), faire une suspension bactérienne ayant une concentration de 10 8 bactéries/ml (standard McFarland No 5) de la bactérie à identifier (culture de heures). Utiliser un plant de tabac White Burley ayant 5 à 6 feuilles. Inoculer une feuille par bactérie à identifier ou pour chaque témoin (bactérie non pathogène et bactérie pathogène). À l aide d une seringue tuberculine de 1 ml injecter la suspension bactérienne dans l espace intercellulaire le long de la nervure centrale ou d une nervure secondaire. L inoculation de la suspension bactérienne se fait sur la face inférieur de la feuille. Laisser le plant à la température de la pièce pour une période de 24 à 48 heures. Après 24 ou 48 heures lire la réaction obtenue. Réaction négative : aucun changement dans la couleur et l aspect du tissu Réaction positive : La zone foliaire inoculée avec la bactérie devient légèrement translucides et a un aspect humide. Par la suite, les tissus s assèchent et prennent une coloration brun clair à beige Contrôle de qualité : Un jaunissement ou un brunissement de la zone foliaire inoculée n est pas une réaction positive.

46 LEVANE Le test levane sert à déterminer si la bactérie polymérise le fructose en polyfructose. À l aide d une anse à inoculer stérile, inoculer le milieu de culture levane par stries avec la bactérie à identifier (culture de heures). Incuber à 26 o C pour 48 heures. À la suite de l incubation, lire la réaction obtenue. Réaction positive : Strie partiellement saillante et luisante (vue du dessus). Réaction négative : strie prostrée Présence d une zone opaque et luisante en marge de la strie (vue du dessous). α MÉTHYL-GLUCOSIDE Le test Méthyl-glucoside sert à déterminer si la bactérie peut croître en présence de cette seule source de carbone. À l aide d une anse à inoculer stérile, inoculer le milieu de culture α méthyl-dglucoside par points en déposant des amas de la bactérie à identifier (culture de heures). Incuber à 26 o C pour 48 heures. À la suite de l incubation, lire la réaction obtenue : Réaction positive : gros points bourgognes Réaction négative : petits points bourgognes avec un important pourtour blanc

47 OXYDASE Le test oxydase (biomérieux) permet de mettre en évidence la présence de l enzyme cytochrome C oxydase. Sur un papier filtre stérile, déposer un disque d oxydase imprégné de diméthyl-para-phénylène diamine. Humidifier le disque avec quelques gouttes d eau distillée stérile. Un excès d eau peut nuire à la lecture. À l aide d un cure-dent prendre la bactérie à identifier (culture de heures) et la déposer sur le disque. Lire la réaction dans les 30 secondes. Réaction négative : absence de coloration Réaction positive : présence d une coloration rose pâle à violet OXYDATION/FERMENTATION Le API OF Medium (biomérieux) est destiné à étudier le métabolisme oxydatif ou fermentatif des bactéries. La faible teneur en peptone et la forte concentration en glucose permettent d utiliser le API OF Medium pour vérifier si la bactérie peut utiliser le glucose en présence et en absence d oxygène À la suite de l utilisation du glucose, il y a formation d acide.. L acidification du milieu fait virer l indicatif coloré le bleu de bromothymol, lequel passe du vert au jaune. Déposer les tubes identifiés dans un bécher de 250 ml. Ajouter de l eau (environ 75 ml). Faire bouillir sur une plaque chauffante jusqu à ce que le contenu des tubes devienne liquide. Contrôle de qualité : Laisser revenir les tubes à température de la pièce avant de les inoculer. Si le liquide est trop chaud, les bactéries seront détruites.

48 Casser l extrémité du tube à l aide du capuchon de plastique. Inoculer le milieu avec la bactérie à identifier (culture de heures) en se servant d une anse à inoculer stérile. Ajouter environ 1 cm d huile minérale stérile. Replacer le capuchon de plastique sur le tube. Incuber à 26 o C pour 24 à 48 heures. À la suite de l incubation, lire la réaction obtenu : Réaction négative : (métabolisme oxydatif) le milieu reste vert Réaction positive : (métabolisme fermentatif) le milieu devient jaune PECTINASE (ERWINIA) Le test pectinase sert à déterminer l activité pectinolytique d une bactérie, c est-à-dire si elle peut dégrader la pectine contenu dans le milieu de culture. À l aide d une anse à inoculer stérile, inoculer le milieu de culture pectinase (milieu servant à mesurer l activité pectinolytique des Erwinia) par points, en déposant des amas de la bactérie à identifier (culture de heures). Incuber à 26 o C pour 24 à 48 heures. À la suite de l incubation, ajouter suffisamment d acétate de cuivre (7,5%) pour recouvrir les points d inoculation (environ 5 ml). Attendre environ 5 minutes et lire la réaction obtenue:

49 Réaction négative : absence d un halo blanc Réaction positive : présence d un halo blanc (zone de précipitation) PECTINASE (PSEUDOMONAS) Le test pectinase sert à déterminer l activité pectinolytique d une bactérie, c est-à-dire si elle peut dégrader la pectine contenu dans le milieu de culture. À l aide d une anse à inoculer stérile, inoculer le milieu de culture Pectine Hildebrand (milieu servant à mesurer l activité pectinolytique des Pseudomonas) par points en déposant des amas de la bactérie à identifier (culture de heure). Incuber à 26 o C pour 24 à 48 heures. À la suite de l incubation, lire la réaction obtenue. Réaction positive: Réaction négative : présence d une dépression du milieu entourant le point d inoculation absence d une dépression PRODUCTION D INDOLE Le test indole sert à déterminer si la bactérie produit de l indole à partir du tryptophane (acide aminé). À l aide d une anse à inoculer stérile, inoculer le milieu de culture liquide indole (production d indole) avec la bactérie à identifier (culture de heures). Incuber à 26 o C pour 48 heures. À la suite de l incubation, ajouter 3 gouttes du réactif de Kovac (biomérieux) sous la hotte chimique. Lire immédiatement la réaction obtenue:

50 Réaction positive : présence d un anneau rouge en surface Réaction négative : présence d un anneau jaune en surface TRANSFORMATION DU SUCROSE Le test sucrose sert à déterminer si la bactérie transforme le sucrose en substances réductrices. À l aide d une anse à inoculer stérile, inoculer le milieu de culture liquide RS (transformation du sucrose en substances réductrices) avec la bactérie à identifier (culture de heures). Incuber à 26 o C pour 48 heures. À la suite de l incubation, ajouter 2,5 ml du réactif de Bénédict. Déposer les tubes dans un bécher de 250 ml. Ajouter de l eau (environ 75 ml) et amener à ébullition sur une plaque chauffante. Au changement de couleur du témoin positif (couleur jaune apparaissant), lire la réaction obtenue : Réaction négative : le milieu reste bleu-vert Réaction positive : le milieu devient jaune