Des bio-puces pour la mesure des contaminations microbiennes
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- Aurélien Roberge
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1 Des bio-puces pour la mesure des contaminations microbiennes Delphine Guillebault 13 novembre 2013
2 L eau est le vecteur de nombreux microorganismes ayant un impact sociétal et économique fort Des dinoflagellés Des diatomées Des bactéries Des efflorescences d algues toxiques Des contaminations bactériennes La biologie moléculaire, des bases de données, des technologies de pointes La diversité microbienne, les empreintes génétiques et chimiques
3 ** *
4
5 Des enjeux environnementaux Révision des standards microbiologiques CE en 2015 Augmentation de la population mondiale, réchauffement climatique avec (ré-) émergence de microorganismes indésirables pour l homme Les questions: Quelle qualité des eaux de consommation, d élevage et récréatives? Les réservoirs naturels? Le recyclage de l eau? La réutilisation des eaux industrielles?
6 Le principe des bio-puces Un individu Une identité Des gènes Des séquences
7 Le principe des bio-puces ui est là et combien sont-ils? Une population = un assemblage d individus! "! "! " Un assemblage d individu = un assemblage d identité Un gène! " 304).01 ).- ', /) %)*+, $- )! "! " 2- ", )! " Une séquence Reconnaissance des séquences par une sonde spécifique Aujour hui en catalogue: Zig, Puce, Jules, Jim etc.
8 Développement et/ou adaptation de sondes ciblant des micro-organismes d intérêt Choix d un gène reconnu pour ses propriétés phylogénétiques: molécule possédant des régions très conservée entre les différentes espèces et moins conservée Ubiquiste: présent chez tous les organismes vivants Peu de transfert horizontal Très abondante Bases de données très riches et bien alimentées Sondes hiérachiques: Groupe phylum Classe Genre Espèces Contrôle interne de présence de la cible Ensemble de séquences uniques
9 En pratique. L identification d espèces à l aide de sondes Échantillon environnemental ou issu de culture Isolation des messagers RNA Indicateur d activité Marquage Fluorescent des RNA Hybridation sur la bio-puce Plus le signal fluorescent est fort plus la cible est présente en grande quantité
10 En pratique Schéma d une expérience d hybridation de bio-puce ARN marqué fluorescent Sondes immobilisées (Oligonucleotides, PCR-Fragments, cdna) Lame dotée d un revêtement spécifique
11 En pratique Les résultats obtenus
12 Objectifs: Le projet européen MicroAQUA 7th Framework Programme Theme: Innovative aquatic biosensors Designer des sondes spécifiques ciblant des cyanobactéries et des diatomées toxiques, des bactéries, virus et protozoaires pathogènes => participer aux efforts européens de surveillance des eaux côtières en matière de pathogènes véhiculés par l eau douce à travers l évaluation de la qualité microbiologiques de l eau
13 Les micro-organismes ciblés dans ce projet: Group Pathogen 2 step detection rrna and toxin gene on micro-array glass clide Standard probe on microtiter plate assay Standard probe on microarray glass slide Standard probe to designed and validated Bacteria Campylobacter E. coli O157:H7 Legionella Mycobacterium Salmonella Shigella Aereomonas spp. Bacillus cereus 1 Clostridium botulinum Clostridium perfringens Listeria monocytogenes Pseudomonas pp. Staphylococcus aureus Vibrio spp. Yersinia enterocolitica Cyanobacteria Microcystis aeruginosa x Planktonthrix x Nodularia spumigena x Anabaena spp. x Aphanizomenon flos-aquae x Cylindrospermopsis x
14 La finalité du projet Set de sondes spécifiques de chaque cibles Sondes hiérarchiques: Groupe phylum Classe Genre Espèces Impression des sondes sur un support Une bio-puce dédiée à la détection et la quantification de nombreuses cibles microbiennes Commercialisation de la bio-puce AQUA prévue
15 L organisation d une bio-puce Impression des sondes sur un support Grille Super-grille Cluster de Super-grille Plusieurs millions de spots (NimbleGen Systems, Affymetrix, Agilent Technologie) Dupliqua Du cluster de Super-grille
16 Un autre type de puce: les puces ciblant les toxines Toxine Anticorps + = SPR CHIP SURFACE Plus le signal est faible, plus il y a de toxines dans l échantillon
17 Les toxines détectées à l aide de puces Acide okadaïque Acide domoique Neosaxitoxine Saxitoxine Microcystine Anatoxines Cylindrospermopsines Nodularines
18 Les avantages des bio-puces sur les autres méthodes Pyroséquençage 454: délai de plusieurs semaines Spectrométrie de masse: réponse en plusieurs jours et coût élevé Microscopie (LM & SEM): temps et expertise taxonomique, faible nombre d échantillons Hybridation FISH: une espèce à la fois parfois deux qpcr limitée à 8 espèces maximum (multiplexe), inhibitions fréquentes des réactions d amplification Bio-puces Nombre illimité d espèces déposées sur la bio-puce avec possibilité d étudier facilement les nouvelles espèces Coût raisonnable 40 par échantillon avec 2 réplicas et un nombre d espèces très important
19 L accès à ces technologies? Une jeune société créée en Avril 2013 co-fondée par les Drs Carmem-Lara Manes et Delphine Guillebault (Présidente): Microbia Environnement
20 Bio-puce diagnostic algues toxiques, microorganismes pathogènes Commercialisation produits R&D Développement de biopuce et biocapteurs diagnostic et aide au transfert de technologies similaires Prestation de services Diagnostic biologique et caractérisation phylogénétique d un environnement naturel ou industriel à façon
21 Prestations de services: diagnostic, identification, surveillance, valorisation, projets à façon Développement technologique d outils moléculaires de détection Commercialisation de bio-puces de diagnostic Vente de la bio-puce MIDTAL ou de la prestation MIDTAL pour la surveillance des algues toxiques [email protected]
22 Merci de votre attention
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