En vue de l'obtention du. Présentée et soutenue par Alice BOULANGER Le 15 mai 2009

Transcription

1 THÈSE En vue de l'obtention du DOCTORAT DE L UNIVERSITÉ DE TOULOUSE Délivré par l'université Toulouse III - Paul Sabatier Discipline ou spécialité : Microbiologie Présentée et soutenue par Alice BOULANGER Le 15 mai 2009 Titre : Analyse d'un nouveau système CUT impliqué dans l'acquisition et l'utilisation du N-acétylglucosamine par Xanthomonas campestris pathovar campestris. JURY Jackie PLUMBRIDGE, Directeur de Recherche, CNRS, Paris, Rapporteur Christelle BRETON, Professeur, CERMAV, Grenoble, Rapporteur Charles MANCEAU, Ingénieur de Recherche, INRA, Angers, Rapporteur Valérie VERDIER, Directeur de Recherche, IRD, Montpellier, Examinateur Bernard MARTIN, Professeur de l Université Paul Sabatier, Toulouse, Examinateur Emmanuelle LAUBER? Charg2e de Recherche, CNRS, Toulouse, Co-Directeur de thèse Ecole doctorale : Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries Unité de recherche : Laboratoire des Interactions Plantes-Microorganismes Directeur de Thèse : Matthieu ARLAT

2 Doctorat de l Université de Toulouse délivré par l Université Toulouse III - Paul Sabatier U.F.R. Sciences de la Vie et de la Terre THÈSE Pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L UNIVERSITÉ TOULOUSE III Discipline : Microbiologie «Microorganismes, du génome aux interactions avec l hôte» Présentée et soutenue par Alice BOULANGER Le 15 MAI 2009 à 14h00 Analyse d un nouveau système CUT impliqué dans l acquisition et l utilisation du N-acétylglucosamine par Xanthomonas campestris pathovar campestris. JURY Jackie PLUMBRIDGE, Directeur de Recherche, CNRS, Paris, Rapporteur Christelle BRETON, Professeur, CERMAV, Grenoble, Rapporteur Charles MANCEAU, Ingénieur de Recherche, INRA, Angers, Rapporteur Valérie VERDIER, Directeur de Recherche, IRD, Montpellier, Examinateur Bernard MARTIN, Professeur de l Université Paul Sabatier, Toulouse, Examinateur Emmanuelle LAUBER, Chargée de Recherche, CNRS, Toulouse, Co-Directeur de thèse Recherches effectuées au Laboratoire des Interactions Plantes-Microorganismes, UMR CNRS / INRA 2594 / , Chemin de Borde Rouge BP Castanet Tolosan cedex, France

3 REMERCIEMENTS Je souhaite remercier chacun des membres du jury d avoir accepté d examiner ce travail et d être venu assister à la soutenance de cette thèse. Merci à : Matthieu pour m avoir acceptée au sein de son équipe. Tu m as appris les bases de la phytopathologie et la patience (enfin pour la patience tu as essayé!!). Tu m as toujours laissé la possibilité de m exprimer. Merci également pour les blagues carambar et les sessions bizutages. Manue, la femme qui décroche plus vite que son ombre. Tu m as soutenue toutes ces années, merci pour toute l aide que tu m as apportée et tout ce que tu m as enseigné. J ai tenu le coup grâce à toi. Je te remercie également pour les bons moments passés ensemble, ta patience, les places de cinéma et le super fromage de chèvre. Martine et Claudine pour vous être occupées de moi comme de vraies mères. Martine, merci pour tous les coups de mains que tu n hésites pas à donner à tous moments et pour ta gentillesse. J ai beaucoup apprécié les discussions sur les péripéties du monde des microbiologistes toulousains. Claudine, merci pour tout le travail que tu effectues chaque jour et qui nous facilite grandement la vie que ce soit au sein du laboratoire ou de l équipe. Les décorations, le chocolat, le muguet et toutes les petites attentions dont tu nous gâtes tous rendent nos journées plus belles. Guitoune et Matcha avec qui j ai eu de nombreux fous rires. Vive le tableau des boulettes (bien que vous soyez des tricheurs), les batailles de glace (là aussi deux contre une c est de la triche!) et les discussions croustillantes (no comment). Guitoune, je conserve la boulette d or, et peut être qu un jour je te la remettrai. Il va falloir que tu t entraînes dur pour arriver à mon niveau et la mériter. Servane, ma morue. Nous avons passé de très bons moments en ta compagnie. Heureusement que tu étais là pour rendre les 1 er mai moins mortels. Les

4 «vendredi c est permis» m ont fait beaucoup de bien et tu m as ouvert la voie dans bien des domaines. Damien pour m avoir initié aux cultures de plantes et pour ses imitations inoubliables. Vincent avec qui je me suis beaucoup amusé pendant les manips. Laurent pour ton aide apportée lors de la préparation de ma soutenance. Pauline et Endrick qui sont la nouvelle génération de fous ayant envie de passer un doctorat. Je vous souhaite beaucoup de réussite et un avenir radieux. A tous les étudiants qui ont passé un moment avec nous et qui ont participé à la bonne humeur de l équipe. Alice, avec qui je partage de nombreux points communs. Je suis heureuse d avoir trouvé une nouvelle amie avec qui partager les joies et les difficultés de la vie. Tu m as aidé à passer les moments difficiles de fin de thèse et je t en remercie. Solène, Sandra, Lisa, Marie et Céline pour les soirées filles et votre amitié. J espère qu on aura l occasion de remettre ça rapidement. On va avoir encore pleins d heureux événements à fêter. A toutes les personnes qui animent la vie du labo, qui donnent de leur temps et de leur énergie pour faciliter le travail de chacun. Sans les amis et la famille, la vie serait trop dure. Je remercie ma maman qui me soutien et m encourage depuis toujours et à qui je dois tant. Sans toi tout ceci n aurait pas été possible. Merci à tous mes amis, à Anne, Candice, Nanou et Zarha. Vous avez toujours été là pour me soutenir et me remonter le moral et faire la fête quand j en avais besoin. Enfin, je remercie Jean-philippe qui partage ma vie. Merci pour tout le bonheur que tu m apportes chaque jour. Ce n est pas tous les jours facile de supporter les états d âme d une thèsarde en détresse mais tu as toujours su me redonner le sourire.

5 Le conte de la boulette Il était une fois, dans un laboratoire lointain, très lointain, une jolie thésarde prénommée Alice. Alice était en train de finir sa thèse, et avait donc eu beaucoup de bons résultats, seulement, on aurait dit que le destin l'avait frappé lors de sa naissance et la fit déesse de la boulette. Elle ne pouvait s'empêcher de commettre des boulettes, c'était inné, de temps à autres, ce qu'elle touchait se transformait en petites ou grosses conneries, si vous me passez l'expression mes vaillants lecteurs. Je vais donc vous conter l'histoire de la boulette du plasmide pvo. C'était un jour triste du mois de novembre de l'année 2008, et le valeureux guillaume était en train de faire des mutants pvo. Les fragments avaient déjà été amplifiés et séquencés. Il en était donc arrivé à la terrible étape de la ligation dans le plasmide pvo. Mais guillaume le bon s'était déjà affranchi de biens de ligation par le passé, et n'appréhendait aucunement cette étape. Seulement, il n'avait plus en sa possession de pvo. Il parti donc en quête de ce plasmide. Il réussi à en trouver auprès de la belle Alice, qui, remplie de générosité (j'en rajoute, c'est pour le conte), s'empressa de lui offrir un aliquot. Il lui demanda si le plasmide était vide et alice confirma avec célérité qu'il ne contenait effectivement pas de fragments en son sein. (C'est très important pour la suite de l'histoire). Guillaume le vaillant, accompagné de Martine la grande firent donc leurs ligations, sûr de ce plasmide, et passèrrent à l'étape de la digestion afin de vérifier si leurs fringants fragments étaient en place au sein de leur bien aimé plasmide (car j'avais fait une PCR de vérif avec oligos sur pvo et j'amplifiais un fragment de 300 environ donc c'était bon pour moi). Je vous laisse donc imaginer la stupeur de guillaume lorsqu'il vit que ses enzymes ne coupaient pas. Martine tenta donc de couper avec une enzyme, puis l'autre, avec une purif entre les deux,... Rien! Guillaume fît alors une PCR avec les oligos de construction, et, à sa grande surprise, ce fût du grand n'importe quoi! Il décida donc de retraverser toutes ses terribles étapes afin d'obtenir le grâle, un mutant pvo. Mais les semaines passèrent (2 quand même) et les ligations ne marchaient toujours pas. Guillaume le bienheureux ne comprenait pas jusqu'au jour où Martine, imaginant une quelconque baleine sous un gravillon, fit séquencer les pvo et vit que les séquences correspondaient au gène Guillaume le magnifique demanda alors à Alice si, par le plus grand des hasards, il y aurait pu y avoir quelque chose dans le plasmide. Et effectivement, Alice avait passé à Guillaume une miniprep de pvo avec un fragment dedans, tout en lui disant qu'il était vide. La malédiction avait encore frappée!! La déesse de la boulette avait accouchée de sa plus belle réalisation en trois ans de thèse. Guillaume digéra donc un autre pvo (sans rien dedans), fît les ligation, les transformation et eût beaucoup de bons et beaux transformants. Guy.

6 Liste des abréviations ABREVIATIONS ABC ADN ADNc AHL AMPc anhmurnac ARN Asn ATP Avr CASA CAZy CBP CC CDS CFU CHS CLP COS CRP CUT Da Dap DATDH DF DMSO dntp DO DSF DTT ECF EDTA EI EII EPS ET ETI Fru FUR GAG Gal GalNAc GlcNAc GMP GPI GRP ATP Binding Cassette Acide Deoxy-ribo-Nucléique ADN complémentaire N-acyl homoserine lactone Adénosine Monophosphate cyclique acide N-acétylmuramique anhydre Acide Ribo-Nucléique Asparagine Adenosine Triphosphate Avirulence Casamino Acid Carbohydrate Active Enzymes Chitin-Binding Protein Coiled-coil Coding DNA Sequence Colony Forming Unit Chitine Synthase camp receptor Like Protein ChitoOligoSaccharides camp Receptor Protein Carbohydrate Utilization containing TBDR Dalton acide Diaminopimélique 2,4-diacetamido-2,4,6-trideoxyhexose Diffusible Factor Diméthylsulfoxyde désoxyribonucléotides Tri-phosphate Densité Optique Diffusible Signal Factor Dithiothreitol Extracellular Cytoplasmic Function Acide éthylène-diamine-tétraacétique Enzyme I Enzyme II Exopolysaccharides Ethylène Effector-Triggered Immunity Fructose Ferric Uptake Regulator Glycosaminoglycane Galactose N-acétylgalactosamine N-acétylglucosamine Guanosine Monophosphate Glycophosphatidylinositol Glycine Rich Protein

7 Liste des abréviations HAMP Hop HPLC HPr HPRP HPt HR Hrc Hrp HSP IPTG ISR JA kb Kd kda KDG LAR Lpp LPS LRR LZ MAMP Man MIMP MCP MFS MS MurNAc NB / NBS NCBI NeuAc NLS NMR NO NRP OGT OMP ORF OTase PAGE PAMP PNPG pb PBP PCD PCR PEP PG Pgl PIP Host-Associated Molecular Pattern Hrp outer protein Chromatographie en phase liquide à haute performance Histidine containing protein HydroxyProline Rich protein Histidine Phosphotransférase Hypersensitive Response Hrp conserved Hypersensitive response and pathogenicity Heat-Shock Protein Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside Induced Systemic Resistance Jasmonic Acid kilobase Constante de dissociation Kilodalton 2-keto-3-deoxygluconate Localized Acquired Resistance Lipoprotéines Lipopolysaccharides Leucine rich repeat Leucine zipper Microbes-Associated Molecular Pattern Mannose Microbes-Induced Molecular Pattern Methyl accepting Chemotaxis Protein Major Facilitator Superfamily Mass Spectrometry acide N-acétylmuramique Nucleotide Binding Site National Center for Biotechnology Information Acide Neuraminique Nuclear Localization Signal Nuclear Magnetic Resonance Nitric Oxyde NonRibosomal Peptide O-GlcNAc Transférase Outer Membrane Protein Open Reading Frame OligosaccharylTransférase polyacrylamide Gel Electrophoresis Pathogen Associated Molecular Pattern Paranitrophényl-β-D-galactoside paires de bases Penicillin-Binding Protein Programmed Cell Death Polymerase Chain Reaction phosphoénolpyruvate Peptidoglycane Protein glycosylation Plant Inducible Promoter

8 Liste des abréviations PME Pop PR PRP PRR PTI PTS pv. QS R RE RLK RLP rpm ROK ROS Rpf RT SA SAR SDS-PAGE Ser SNP sp. TBDT TCA TCT Thr TIR Trh T3SE T3SS UDP UV Xcc Xgal Xgluc Xop Xyl Pectine Méthyl Estérase Pseudomonas outer protein Pathogenesis-Related Proline Rich Protein Pattern Recognition Receptor PAMP-triggered immunity Phosphotransferase System pathovar Quorum Sensing Résistance Réticulum Endoplasmique Receptor-Like Kinase Receptor-Like Protein rotation per minute Repressor Open reading frame Kinase Reactive Oxygen Species Regulation of pathogenicity factors Reverse Transcription Salicylic Acid Systemic Acquired Resistance SulfateDodécylique Sodium- PolyAcrylamide Gel Electrophoresis Sérine Single Nucleotide Polymorphism Species TonB-Dependent Transporter TriCarboxylic Acid Trachéal CytoToxine Thréonine Toll / Interleukine1 Receptor domain Transcriptional regulator for hrp Type Three Secretion Effector Type Three Secretion System Uridine Diphosphate Ultra Violet Xanthomonas campestris pv. campestris 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid Xanthomonas outer protein Xylose

9 Liste des figures Introduction générale Chapitre 1 LISTE DES FIGURES Figure 1 : Quelques exemples de Brassicacées cultivées et la plante modèle 8 Arabidopsis thaliana Figure 2 : Représentation schématique du cycle de vie de Xanthomonas campestris 9 pv. campestris (Xcc) lors d une interaction avec la plante hôte. Figure 3 : Symptômes de la nervure noire sur les feuilles de choux. 9 Chapitre 2 Figure 4 : Signalisation de la réponse basale et cibles de certains effecteurs de type III 11 connus Figure 5 : Représentation de la théorie Gène pour Gène de Flor (1971). 12 Figure 6 : Différentes classes de Protéines de Résistance. 13 Figure 7 : Le modèle en zig zag illustrant la production quantitative de l équipement 15 nécessaire à la défense immunitaire de la plante. Chapitre 3 Figure 8 : Représentation schématique de trois types de mobilité bactérienne. 17 Figure 9 : Modèle du système d acquisition du fer des bactéries Gram et de sa 19 régulation. Figure 10 : La paroi végétale. 20 Figure 11 : Représentation schématique de différents polymères de sucres composant 21 la paroi primaire végétale. Figure 12 : Modèle de fonctionnement d un locus CUT basé sur le locus sux de 24 Xanthomonas campestris pv. campestris. Figure 13 : La translocation de groupe par le système PTS, mode de transport actif de 24 carbohydrates à travers la membrane interne des bactéries à Gram négatif. Figure 14 : Représentation schématique du système Hrp. 25 Figure 15 : Modéles de régulation des gènes du système Hrp chez la bactérie 28 Ralstonia solanacearum et Xanthomonas. Figure 16 : Le xanthane, un exopolysaccharide produit par Xanthomonas campestris 29 pv. campestris. Figure 17 : Voie de synthèse de Xanthane chez Xanthomonas campestris pv. 29 campestris (Xcc). Figure 18 : Structures des molécules signales des deux systèmes de quorum sensing 30 de Xanthomonas campestris pv. campestris. Figure 19 : Modèle de la transduction du signal DSF chez Xanthomonas campestris 30 pv. campestris. Figure 20 : Représentation schématique du quorum sensing chez Xcc. 31 Figure 21 : Illustration des interactions entre Xanthomonas campestris pv. campestris 33 et une plante-hôte.

10 Etude de l acquisition et de l utilisation du GlcNAc Chapitre 2 Liste des figures Figure 22 : Le peptidoglycane 35 Figure 23 : Voie de biosynthèse du peptydoglycane (PG). 36 Figure 24 : Représentation schématique de l activité d enzymes clivant le 37 peptidoglycane. Figure 25 : Recyclage du peptidoglycane chez Escherichia coli. 38 Figure 26 : Représentation schématique des parois bactériennes. 39 Figure 27 : Structure du lipopolysaccharide (LPS) de E. coli O111:B4. 39 Figure 28 : Structure de la chitine. 40 Figure 29 : Structure schématique de glycosaminoglycanes (GAGs) et de 41 protéoglycanes. Figure 30 : Structure de l ancre GPI de l érythrocyte acétylcholinestérase humaine. 41 Figure 31 : Exemple d interactions impliquant des carbohydrates de surface. 42 Figure 32 : Relation dynamique entre phosphorylation et modification par le O- 44 GlcNAc d une protéine. Figure 33 : Structure du N-glycane précurseur greffé sur la protéine eucaryote en 45 cours de synthèse. Figure 34 : Représentation simplifiée des premières étapes de N-glycosylation dans le 45 réticulum endoplasmique (RE). Figure 35 : Structure des principaux N-glycanes rencontrés chez les mammifères. 45 Figure 36 : Structure des principaux N-glycanes rencontrés chez les plantes. 46 Figure 37 : Localisation majoritaire des différents types de N-glycanes dans la cellule 46 végétale. Figure 38 : Synthèse des différents types de N-glycanes dans le réticulum 46 endoplasmique (RE) et l appareil de Golgi des cellules végétales. Figure 39 : Exemples de sucres rares constituant les glycanes des glycoprotéines des 52 Archées et des bactéries. Figure 40 : Modèle de N- et O-glycosylation chez les archées et les bactéries. 53 Figure 41 : La N-glycosylation chez Campylobacter jejuni. 54 Chapitre 3 Figure 42 : Modèle de la voie de dégradation de la chitine chez Saccharophagus 56 degradans (anciennement nommé Microbulbifer degradans). Figure 43 : Représentation schématique du catabolisme du GlcNAc chez les bactéries. 59 Figure 44 : Séquences consensus reconnues par les régulateurs transcriptionnels 63 NagC, NagR et NagQ. Résultats Figure R1. Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) utilizes N- acetylglucosamine and chitobiose as a carbon source. Figure R2. The Xanthomonas campestris pv. campestris N-acetylglucosamine CUT system and proposal model for N-glycans degradation

11 Liste des figures Figure R3. Glycoside hydrolases encoded by the Xanthomonas campestris pv. campestris glycan cluster are functional and controlled by NagR. Figure R4. Xanthomonas campestris pv. campestris Nag proteins are involved in the utilization of N-acetylglucosamine. Figure R5. Xanthomonas campestris pv. campestris NagK-II enzymes are involved in the phosphorylation of N-acetylglucosamine. Figure R6. Xanthomonas campestris pv. campestris naga mutants are sensitive to N- acetylglucosamine, in vitro. Figure R7. N-acetylglucosamine and N-acetylglucosamine-6P are the signalling molecules of NagR and NagQ respectively. Figure R8. Xanthomonas campestris pv. campestris naga and nagb-ii mutants are affected in pathogenicity. Figure R9. Xanthomonas campestris pv. campestris Nix glycoside hydrolases and the TonB-dependent transporter NixD play a central role in sensitivity to N- acetylglucosamine in planta. Figure R10. Schematic representation of the N-acetylglucosamine utilization pathway in Gram negative bacteria. Figure S1. Growth of Xanthomonas campestris pv. campestris wild-type strain in the presence of various carbon sources at 10 mm. Figure S2. Conservation of genes belonging to the N-acetylglucosamine (GlcNAc) utilization pathway among completely sequenced Xanthomonadaceae. Figure S3. Conservation of genes belonging to GlcNAc and glycan clusters in Xanthomonas campestris pv. campestris ATCC33913 and Novosphingobium aromaticivorans (Saro_DSM 12444). Figure S4. Location of mutations introduced in genes belonging to the Xanthomonas campestris pv. campestris N-acetylglucosamine utilization pathway and regions cloned in expression plasmids Discussion Figure D1. Représentation schématique du réseau de régulation du système GlcNAc de Xanthomonas campestris pv. campestris. Figure D2. Utilisation du phénotype du mutant ΔnagA pour suivre l expression d un gène in planta Matériel et Méthodes Figure M1. Principe de la construction des mutants par insertion du plasmide 116 pvo155. Figure M2. Délétion d un gène par la stratégie Cre/Lox. 117 Figure M3. Délétion d un gène par la stratégie SacB. 117 Figure M4. Carte génétique du plasmide pcz Figure M5. Index de la maladie développée par Xcc, après infection par «piercing» 119 de l écotype Sf-2 d A. thaliana ou de feuilles de choux Bartolo d après Meyer et al. (2005). Figure M6. Représentation schématique de la méthode de suivi de la croissance 120 bactérienne in planta.

12 Liste des tableaux LISTE DES TABLEAUX Interactions Plantes-Microorganismes Tableau 1. Liste des bactéries phytopathogènes dont le génome est entièrement séquencé et disponible, ainsi que les maladies provoquées par ces organismes. 4 Introduction générale Chapitre 1 Tableau 2. Caractéristiques générales et comparaison des 3 génomes de Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) séquencés. 7 Chapitre 2 Tableau 3. Propriétés des différentes familles de protéines PR. 13 Chapitre 3 Tableau 4. Enzymes de dégradation de la paroi végétale de Xanthomonas campestris pv. campestris, source da Silva et al., (2002). Tableau 5. Effecteurs de type III connus chez la souche de Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria Etude de l acquisition et de l utilisation du GlcNAc chez Xcc Chapitre 2 Tableau 6. Enzymes impliquées dans le recyclage du peptidoglycane d Escherichia coli. Tableau 7. Diversité des O-glycanes de type mucine rencontrés chez l homme et leur localisation tissulaire Chapitre 3 Tableau 8. Occurrence et caractéristiques des gènes impliqués dans l utilisation de la chitine et du GlcNAc. 61 Résultats Table R1. Relative expression ratios of genes belonging to the N-acetylglucosamine utilization pathway. Table R2. [ 14 C]N-acetylglucosamine transport rates related to Xanthomonas campestris pv. campestris wild-type strain (Xcc568)

13 Liste des tableaux Table S1. Putative function of enzymes encoded by the Xanthomonas campestris pv. campestris glycan cluster. Table S2. Inhibition of [ 14 C] N-acetylglucosamine uptake by various carbohydrates in Xanthomonas campestris pv. campestris wild-type strain. Table S3. List of plasmids and Xanthomonas campestris pv. campestris strains used or generated in this study Matériel et Méthodes Tableau M1. Liste des réactifs et concentrations 115

14 Sommaire SOMMAIRE LES INTERACTIONS PLANTES-MICROORGANISMES... 4 INTRODUCTION GENERALE... 6 CHAPITRE 1. NOTRE MODÈLE D ÉTUDE, LA BACTÉRIE PHYTOPATHOGÈNE XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. CAMPESTRIS LE GENRE XANTHOMONAS LE GENOME DE XCC LES PLANTES HOTES DE XCC : LES BRASSICACEES LE CYCLE DE VIE DE XCC... 8 CHAPITRE 2. LES SYSTÈMES DE DÉFENSE DES PLANTES LA RECONNAISSANCE DU «NON SOI» ET L INDUCTION DE L IMMUNITE INNEE Les éliciteurs généraux et la réponse basale Les éliciteurs race spécifique Avr reconnus par les protéines de résistance R et la réponse hypersensible LA REPONSE SYSTEMIQUE ACQUISE LA COEVOLUTION PLANTES/PATHOGENES, UN VERITABLE PING PONG CHAPITRE 3. LES DÉTERMINANTS DU POUVOIR PATHOGÈNE BACTÉRIEN L ADHESION LA MOBILITE ET LE CHIMIOTACTISME LES SYSTEMES D ACQUISITION DU FER LA DEGRADATION DE LA PAROI VEGETALE ET L ACQUISITION DES SUCRES Composition de la paroi primaire La biodégradation de la paroi végétale par les bactéries A. Dégradation de la pectine B. Dégradation de la cellulose C. Dégradation de l hémicellulose D. Dégradation des protéines E. Le transport F. La régulation LE SYSTEME HRP ET SES EFFECTEURS La structure du T3SS Les effecteurs de type III (T3SE) Organisation et régulation des gènes du système Hrp LA PRODUCTION D EPS LE QUORUM SENSING LES PHYTOTOXINES ETUDE DE L ACQUISITION ET DE L UTILISATION DU N-ACETYLGLUCOSAMINE CHAPITRE 1. INTRODUCTION AU TRAVAIL DE THÈSE CHAPITRE 2. LE N-ACÉTYLGLUCOSAMINE DANS LE MONDE DU VIVANT

15 Sommaire 2.1 LE GlCNAC, UN ELEMENT DE STRUCTURE La paroi bactérienne A. Le peptidoglycane B. Le recyclage du peptidoglycane C. La paroi des bactéries à Gram D. La paroi des bactéries à Gram La chitine LE GlCNAC ET LES PROTEINES EUCARYOTES : LA GLYCOSYLATION Les protéines O-glycosylées A. Les O-glycanes de type mucine B. Les O-GlcNAc Les protéines N-glycosylées Rôles des O- et des N-glycanes LA GLYCOSYLATION CHEZ LES BACTERIES La O-glycosylation La N-glycosylation CHAPITRE 3. LE GlcNAc COMME SOURCE D ÉNERGIE LA DEGRADATION DE LA CHITINE LA DEGRADATION DES GLYCANES LE CATABOLISME DU GlCNAC Le transport du GlcNAc L étape de phosphorylation du GlcNAc La déacétylation du GlcNAc (par NagA) La déamination et l isomérisation La régulation CHAPITRE 4. LE GlcNAc ET LE POUVOIR PATHOGÈNE RESULTATS DISCUSSION GENERALE MATERIELS ET METHODES SOUCHES ET PLASMIDES MILIEUX ET RÉACTIFS BIOLOGIE MOLÉCULAIRE PREPARATION D ADN GENOMIQUE CONJUGAISON TRIPARENTALE CONSTRUCTION DE MUTANTS D INSERTION ET DE FUSIONS TRANSCRIPTIONNELLES CONSTRUCTION DES MUTANTS DE DELETION Par la méthode Cre/Lox Par la méthode «SacB» COMPLEMENTATION RT-PCR QUANTITATIVE (QRT-PCR) TEST DU POUVOIR PATHOGÈNE DES DIFFÉRENTS MUTANTS DE XCC INOCULATION PAR «PIERCING» SUR ARABIDOPSIS THALIANA SF2 ET CHOUX BARTOLO INOCULATION PAR INFILTRATION SUR POIVRON

16 Sommaire 4.3. CROISSANCE BACTERIENNE IN PLANTA SUR ARABIDOPSIS THALIANA SF2 (IGC ; INTERNAL GROWTH CURVE) TEST DE STABILITÉ DES INSERTIONS pvo IN PLANTA TESTS PHÉNOTYPIQUES TEST DU ROLE DU GlCNAC COMME SOURCE D AZOTE EFFET TOXIQUE DU GlCNAC ET DE LA PHASE STATIONNAIRE DE CROISSANCE SUR LA CROISSANCE DE MUTANTS DOSAGES D ACTIVITÉS ENZYMATIQUES DOSAGES DE L ACTIVITE β-glucuronidase AUTRES ACTIVITES ENZYMATIQUES TESTS DE TRANSPORT DE [ 14 C]GlcNAc TESTS DE PHOSPHORYLATION DU GlcNAc ANALYSES IN SILICO BIBLIOGRAPHIE

17 Tableau.1 Liste des bactéries phytopathogènes dont le génome est entièrement séquencé et disponible, ainsi que les maladies provoquées par ces organismes. D'après Groupe Espèce Maladie Gram - α-proteobactéries Gram - β-proteobactéries Gram - γ-proteobactéries Gram + Actinobactéries Taille du génome (MégaBases) Agrobacterium tumefaciens str. C58 galle du collet (crown gall) 5.67 Burkholderia cenocepacia AU 1054 pourriture aigre (sour skin) de l'oignon - pathogène sur patients atteints de fibrose kystique 7.25 Burkholderia cenocepacia HI2424 pourriture aigre (sour skin) de l'oignon - pathogène sur patients atteints de fibrose kystique 8.09 Burkholderia cenocepacia J2315 pourriture aigre (sour skin) de l'oignon - pathogène sur patients atteints de fibrose kystique 8.07 Burkholderia cenocepacia MC0-3 pourriture aigre (sour skin) de l'oignon - pathogène sur patients atteints de fibrose kystique 7,9 Ralstonia solanacearum GMI1000 flétrissement bactérien (bacterial wilt) 5.81 Erwinia carotovora subsp. atroseptica SCRI1043 pourriture molle (soft rot) et jambe noire (blackleg) de la pomme de terre 5.06 Pseudomonas aeruginosa PA7 pourriture molle (soft rot) 6,6 Pseudomonas aeruginosa PAO1 pourriture molle (soft rot) - pathogènes sur patients atteints de fibrose kystique 6.26 Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14 pourriture molle (soft rot) - pathogènes sur patients atteints de fibrose kystique 6.53 Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 1448A graisse à halo du haricot (halo blight of bean) 6.11 Pseudomonas syringae pv. syringae B728a graisse du haricot (brown spot) 6.09 Pseudomonas syringae pv. tomato str. DC3000 moucheture bactérienne (bacterial speck) de la tomate 6.54 Xanthomonas axonopodis pv. citri str. 306 chancre des agrumes (citrus canker) 5.27 Xanthomonas campestris pv. campestris str pourriture noire (black rot) des crucifères 5.15 Xanthomonas campestris pv. campestris str. ATCC pourriture noire (black rot) des crucifères 5.08 Xanthomonas campestris pv. campestris str. B100 pourriture noire (black rot) des crucifères 5.08 Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria str tache bactérienne (bacterial spot) de la tomate et du poivron 5.42 Xanthomonas oryzae pv. oryzae KACC10331 rouille des feuilles (bacterial blight) du riz 4.94 Xanthomonas oryzae pv. oryzae MAFF rouille des feuilles (bacterial blight) du riz 4.94 Xanthomonas oryzae pv. oryzae PXO99A rouille des feuilles (bacterial blight) du riz 5,24 Xylella fastidiosa 9a5c chlorose variégée des agrumes (citrus variegated chlorosis) 2.73 Xylella fastidiosa M12 chlorose variégée des agrumes (citrus variegated chlorosis) 2,48 Xylella fastidiosa M23 chlorose variégée des agrumes (citrus variegated chlorosis) 2,5 Xylella fastidiosa Temecula1 maladie de Pierce (Pierce's disease) du raisin 2.52 Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus pourriture annulaire (ring rot) de la pomme de terre 3.38 Leifsonia xyli subsp. xyli str. CTCB07 rabougrissement des repousses (ratoon stunting) de la canne à sucre 2.58 Streptomyces scabies gale commune (scab) de la pomme de terre 10.15

18 Les interactions plantes-micoorganismes 1 Les interactions Plantes-Microorganismes Au cours de sa vie, la plante va cohabiter et interagir avec de nombreux microorganismes tels que les virus, les mollicutes (mycoplasmes et spiroplasmes), les champignons, les bactéries et les nématodes. On peut définir trois types d interactions, les interactions de type symbiotique, de type saprophytique et les interactions de type pathogénique. Aujourd hui, le terme symbiose est souvent associé au mutualisme, défini par l association de deux organismes hétérospécifiques à bénéfice mutuel. Cependant, les interactions symbiotiques incluent le commensalisme (l association n est bénéfique que pour l un des deux partenaires, le second n est pas affectés par cette interaction), l amensalisme (un des acteurs inhibe le développement de l autre), et le parasitisme (l un des acteurs se développe au détriment de l autre). L organisme le plus grand est appelé hôte, alors que le plus petit est nommé symbiote ou symbionte. Les microorganismes saprophytes quant à eux, se nourrissent par absorption de matières organiques mortes, inertes ou en décomposition. Certaines bactéries ont développé une relation étroite avec la plante, leur permettant d échapper à la compétition avec d autres microorganismes. Ces bactéries vivent en saprophytes au niveau de la rhizosphère ou de la phyllosphère sans développer de relation mutualiste ou parasite avec la plante. Tout organisme parasite provoquant une maladie est dit pathogène. Le pouvoir pathogène d un organisme correspond à la capacité de cet organisme à développer une maladie sur son hôte, tandis que la virulence d un organisme correspond à une notion quantitative de l intensité du pouvoir pathogène. Un organisme pathogène peut avoir des souches plus ou moins virulentes. Pour induire une maladie, une bactérie pathogène doit être capable d adhérer, de coloniser et d envahir l hôte, de se multiplier et par conséquent d adapter son métabolisme à l environnement de l hôte, d échapper aux systèmes de défense de l hôte et de résister aux différents stress rencontrés et enfin de survivre entre deux cycles infectieux. Tous les éléments bactériens permettant la mise en place de ces différentes étapes sont définis comme facteurs de virulence. Il existe de nombreuses espèces de bactéries phytopathogènes (infectant les végétaux) regroupées majoritairement dans trois classes de protéobactéries, les α-, les β- et les γ-protéobactéries. Le génome de certaines de ces bactéries a été séquencé (Tableau 1). 4

19 Les interactions plantes-micoorganismes Dans certains cas, la distinction entre un organisme saprophyte, symbiotique ou pathogène n est pas toujours évidente. Certaines bactéries peuvent être saprophytes puis pathogènes au cours de différentes étapes de leur cycle de vie. La bactérie Burkholderia pseumallei, par exemple, est une bactérie saprophyte du sol également responsable de la mélioïdose, maladie humaine de l Asie du sud-est (Thaïlande, Myanmar, Singapour, Malaisie, Laos, Cambodge, Vietnam) (Kaestli et al., 2007). Dans l introduction générale, après une brève présentation de notre modèle d étude, je vous présenterai les systèmes de défenses mis en place par les plantes puis je vous parlerais des facteurs de virulence impliqués dans le développement de la maladie en prenant pour exemple notre modèle d étude. Dans une seconde partie, je développerai les différents aspects du rôle du N-acetylglucosamine (GlcNAc) dans le monde du vivant. Enfin, je discuterai les résultats obtenus au cours de ma thèse permettant la mise en évidence d un système particulier, dédié à l acquisition et à l utilisation du GlcNAc au cours de la vie in planta de Xcc. 5

20 INTRODUCTION GENERALE