Innovation dans le domaine des puces de diagnostic

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1 Cycle d information et d échanges sur la maitrise sanitaire des denrées alimentaires et des procédés Site de Maisons Alfort Innovation dans le domaine des puces de diagnostic Patrick FACH * 23, avenue du Général de Gaulle Maisons Alfort cedex Téléphone / Phone 33 (0) Télécopie / Fax 33 (0) REPUBLIQUE FRANCAISE AFSSA * Coordinateur de la plateforme biopuce à l AFSSA-LERQAP

2 Bio-Chip : Définitions CHIP ADN ARN Protéine Basé sur «technologie du silicium» utilisée dans l industrie de la «micro-électronique» Multi-détection par hybridation sur de nombreuses unités porteuse d une sonde ou d un anticorps SYNONYMES microarray, macroarray biochips (DNA-Chip, Protein-Chip)

3 Principaux types de puce à ADN «Macroarray» «Microarray spottée» «GeneChips» De Affymetrix SUPPORT Membrane de nylon TAILLE DES SPOTS : 0,5-1mm DENSITE Quelques centaines de spots/cm 2 SONDES Produits de PCR CIBLES ADNc avec marquage radioactif au 32P PRINCIPALES APPLICATIONS Analyse de l expression des gènes SUPPORT Laine de verre à revêtement chimique TAILLE DES SPOTS : 100 m DENSITE: spots/cm 2 SONDES : Produits de PCR ou oligonucléotides longs (30-70mers) CIBLES ADNc ou produits de PCR avec marquage fluorescent au Cy3 et Cy5 PRINCIPALES APPLICATIONS Analyse de l expression ChIP-on-Chip, CGH array SUPPORT Laine de verre à revêtement chimique TAILLE DES SPOTS : 20 m DENSITE Jusqu à spots/cm 2 SONDES : Oligonucléotides courts (20-25mers) synthétisés in situ CIBLES : ARNc ou produits de PCR avec marquage fluorescent à la biotine-streptavidine PRINCIPALES APPLICATIONS Analyse de l expression, détection de marqueurs moléculaires

4 Projet AFSSA / Genewave : «mini puce VTEC / EHEC»

5 sérotypage moléculaire gènes de virulence gènes de résistance

6 Collaboration AFSSA / DSM (Unité CEB : A. Brisabois) Deux types de collaborations envisagées: - Evaluation des performances de sérotypage moléculaire en comparaison avec la méthode de référence par agglutination selon K-W - Evolution du prototype vers une extension de détection d autres gènes d intérêt (gènes de résistance aux antibiotiques, facteur de virulence, marqueurs de sous-type) permettant d étudier de nombreux facteurs de virulence, leur distribution, de révéler les clones avec de nouvelles combinaisons dans les facteurs de virulence etc

7 Salmonella Oligonucleotide probe targets Projet Européen MED-VET-NET ( WP-26, virulotyping) Antibiotic resistance genes Pathogenicity genes Fimbrial genes Typing genes (Serotype, Phagetype) Others Accession Number Gene name Phenotype property AJ aada1a streptomycin/spectinomycin resistance AF aada2 streptomycin/spectinomycin resistance AF aada5 streptomycin/spectinomycin resistance AF aadb gentamicin resistance X01385 aac(3)-iv gentamicin resistance AJ aacc1 gentamicin resistance S68058 aacc2 gentamicin resistance X61367 tet(a) tetracycline resistance Accession Number Gene name Phenotype property V00611 tet(b) tetracycline resistance AE hin Regulator for flja AE J01749 flic tet(c) filament structural tetracycline protein, resistance H1-Antigen (i) AE L06798 flic; i tet(d) filament structural tetracycline protein, resistance H1-Antigen (i) X04505 L06940 flic; r tet(e) filament structural tetracycline protein, resistance H1-Antigen (r) M90846 AL inva S52437 flic; d invasion tet(g) filament proteinstructural tetracycline protein, resistance H1-Antigen (d) AE M84980 orga AY flic; g,m oxygen-regulated dfra1filament structural trimethoprim invasion protein, protein resistance H1-Antigen ORGA (g,m) U06201 flic; m,t filament structural protein, H1-Antigen (m,t) AE hila AF invasion dfra12genes transcription trimethoprim activator resistance AJ fljb; l,w-1 phase 2 flagellin; flagellar synthesis; AF avra AF secreted dfra17 via a type trimethoprim III system AJ fljb; e,n,x-1 phase 2 flagellin; flagellar resistance synthesis; AF AE ttrc AJ fljb; 1,2 tetrathionate dfra7phase 2 reductase flagellin; trimethoprim flagellar subunit resistance synthesis; C AE bcfc Fimbrial cluster bcf AE AJ ssaq AJ flic; e,h secretion dfra14 phase system 2 flagellin; trimethoprim apparatus flagellar protein resistance synthesis; SSAQ AE lpfd Fimbrial cluster lpf AE AE M wzy a(1-2) strb Serogroup streptomycin B AE ssrb safc Secretion system Fimbrial regulator: cluster transcriptonal resistance saf activator, homologous with AF AE M rfbd stra Serogroup streptomycin A,B,C2-3,D1,D2 L11008 mgtc sefa required for intramacrophage fimbrial protein survival resistance and growth in low Mg2+ AE AL M64556 rfbe cmla1 Serogroup chloramphenicol A and D AE misl stbd Pathogenicity Fimbrial island encoded cluster stb protein resistance X60665 orf 9.6 Serogroup E1 AF X82455 cat (cata1) chloramphenicol resistance X60666 AE mart orf 17.4 stcc putative transcriptional Serogroup Fimbrial E1 cluster regulator stc AF AE AE spi4d AF abe stdb (B) spi4_d, flor Serogroup predicted Fimbrial florphenicol/chloramphenicol Bcation cluster efflux std pump resistance AF X61917 AE spi4_r X12870 abe stfe (C2) member int1 Serogroup of ABC Fimbrial Integron transporter C2-C3cluster associated family; stf 5 transmembrane helices (N-termin AE AL AE pipa L10818 prt sticint2 Serogroup Fimbrial Integron A and cluster Dassociated sti AE X56793 AE sopb X12869 wbav stjb (B) invasion sul1 Serogroup gene Fimbrial D Sulfonamid protein B cluster resistance stj AE X AE sope1 M36657 wbau STM4595 (B) secreted sul2 Serogroup outer Fimbrial protein Sulfonamid B, and cluster D1 resistance sth AF M84642 sope2 wbaa Serogroup C1 AJ secreted sul3 outer protein Sulfonamid resistance M65054 wbav (D1) Serogroup D AE sopd AF secreted qacedelta1 outer protein Et-Br and quaternary ammonium resistance X wbao (E1) Serogroup E1, and D2 AE AF spvc K03089 wzy a(1-6) Salmonella mera O27O27 serovar plasmid Mercury factor virulence in resistance D3 and B also in E1 present L16014 AY hydh AJ wzx (O6,14) stimulation oxa-1o6,14 of spezifisch intestinal ampicillin water resistance and electrolyte AE AE irob AJ STM0900 putative oxa-1fels-1 glycosyl prophage ampicillin transferase protein resistance AE AE sfba AF STM2740 putative pse-1 Fels-2 periplasmic prophage ampicillin iron-binding protein resistance lipoprotein AE AE slya AF STM2701 MarR pse-1 family Fels-2 transcriptional prophage ampicillin protein resistance regulator for hemolysin AE STM2616 Gifsy-1 prophage protein AF sira AF Regulator tem-1 of invasion ampicillin proteins resistance AE glxk AE glycerate ssei kinase Gifsy-2 II prophage protein AE AF phoq AF gtga sensory tem-1gifsy-2 kinase prophage ampicillin protein protein in two-component resistance regulatory system with PhoP AE D14156 STM1896 AE wcda AY putative STM4210 involved qnr cytoplasmic Prophage in Vi polysaccharide Quinolone protein protein LT 2resistance biosynthesis AE D STM4495 AF wzf AF putative cro (DT104) involved apha1-iab type Cro II in restriction protein translocation kanamycin enzyme, of Vi resistance polysaccharide methylase subunit

8 Detection of E. coli Somatic Antigens Somatic antibody Add cultured E. Coli cells Anti core LPS IgG Anti-IgG biotinylated PolyHRP streptavidin Peroxidase Colour HRP Muna Anjum, 07/03/2005, 2nd FOOD-PCR MEETING, VLA Webridge, UK

9 Detection of E. coli Somatic Antigens Projet Européen MED-VET-NET ( WP-26, virulotyping) Multiple isolates :- O49, O145, O168, O4, O115, O26 Muna Anjum, 07/03/2005, 2nd FOOD-PCR MEETING, VLA Webridge, UK

10 GeneSystems technology

11 Temperature ( C) Réaction PCR DNA denaturation Oligos hybridization DNA elongation Thermal simulation cycle Time (sec)

12 Detection Double fluorescence detection FAM : nm ROX : nm Video : toc 3

13 VTEC/EHEC & Salmonella screening GeneDisc EHEC/VTEC screening FAM Inhibition control E. coli O157 E. colio157 Salmonella Salmonella Negative control ROX Negative control E. coli stx E. coli stx E. coli eae E. coli eae Inhibition control VTEC / EHEC Screening and presumptive detection of E. coli O157 & Salmonella

14 EHEC sero-pathotype GeneDisc EHEC sero-pathotype O26 O26 O145 O145 FlicH7 FlicH7 FAM ROX Inhibition control O111 O111 O103 O103 Negative control Identification of sero-pathotypes A & B of EHEC

15 Application of the technology Sample (25g) +225 ml enrichment broth Incubation O/N at 37 C Screening of stx & eae genes by real time PCR Negative result No risk Low risk High risk Absence of STEC E. coli O157 & STEC Screening GD Positive results for both stx & eae E. coli O157 & STEC Identification by multiplex PCR of serogroup O26, O103, O111, O145 & O157 Negative result Absence of Typical EHEC Identification GD Positive result Potential presence of Typical EHEC Screening GD Identification GD E. coli O157 & STEC E. coli O157 & STEC Strain isolation & confirmation of the presence of virulence genes in the 15 same strain

16 EHEC GeneDisc * * Thèse AFSSA de Marie Bugarel (LERQAP)

17 Perspectives Bio-défense Possibilité de couvrir plusieurs agents biologiques de la menace: Clostridium botulinum; Bacillus anthracis; Yersinia pestis; Francisella tularensis; Variole; Influenza aviaire; SARS; Etc.. Bioterrorism GeneDisc Cette technologie répond aux besoins d une détection rapide, multi-agents et dans un laboratoire mobile.

18 Flow diagram of Water analysis Test portion x ml Filtration Transfer the membrane into a lysis tube Lysis step (Sonication & Heating) DNA purification onto silica columns Design of the Biodefense GeneDisc

19 Nvelle approche TaqMan array VTEC /EHEC

20 Applications possibles des Biopuces SECURITE ALIMENTAIRE Contrôle de la qualité de l eau et des aliments / Épidémiologie moléculaire - Emergence de nouveaux pathotypes / souches à risque pathogènes. Bactéries: Salmo, VTEC, Staph, Listeria, Clostridium etc. Virus : Norovirus GI et GII, VHE etc. Protozoaires (giardia, cryptosporidium, toxoplasma ) œufs d helminthe/ eau SANTE ANIMALE Détection / Typage de pathogènes microbiens (virus, bactérie, parasites): - Virus de l hépatite E (VHE) : clones infectieux / passage porc vers Ho - Mycobactéries, brucella, chlamidiae (mutants, typage ) - Parasites : Trichinella (typage ACM), Toxoplasma ENVIRONEMENT Champignons / Identification des espèces et sous-espèces / (air, ) Marqueurs d espèces «Faune sauvage» / Probl. des tiques, identification du bactériome et protéozome (virus éventuellement).

21 Site de Maisons Alfort MERCI 23, avenue du Général de Gaulle Maisons Alfort cedex Téléphone / Phone 33 (0) Télécopie / Fax 33 (0) REPUBLIQUE FRANCAISE