Mort cellulaire Programmée (Apoptose)

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1 Mort cellulaire Programmée (Apoptose) I) Introduction-definition II) Cytologie de l apoptose III) Mécanismes moléculaires de l apoptose IV) Régulation des voies de signalisation V) Pathologies liées à une dérégulation de l apoptose

2 I) Introduction-définition XIXème siècle mort cellulaire : rôle physiologique important chez les organismes pluricellulaires (embryogenèse, métamorphose) 1964 «mort cellulaire programmée» (développement): séquences d étapes contrôlées menant à une destruction tissulaire transitoire et localisée 1972 «apoptose» (Grec: «tomber, laisser tomber») terme désignant la mort cellulaire programmée: régulation et maintenance des populations cellulaires dans des conditions physiologiques et pathologiques

3 contextes physio-pathologiques de l apoptoses: a) développement production en excès de cellules: l apoptose permet un remodelage des organes et tissus Caenorhabditis elegans (C.elegans): mort de 131/1090 cellules somatiques Formation des membres: séparation des doigts par destruction du tissu mésenchymateux interdigital ablation tissulaire - disparition de la queue au cours de la métamorphose (Anour) - différenciation des organes reproducteurs (élimination des canaux de Wolff ou Müller)

4 Système nerveux: surproduction des neurones et élimination par mort cellulaire pour aboutir à un système nerveux fonctionnel (- 50% des neurones) motifs d une surproduction cellulaire?: équilibre nbr cellules nerveuses/ cellules cibles et précision du réseau de connexions neuronal (synaptogenèse) compétition entre neurones pour les facteurs de croissance produits en petites quantités par les cellules cibles réponses sélectives de population de neurones à certains facteurs de croissance répression du suicide cellulaire par certain facteurs de croissances si réceptivité au facteur de croissance faible mort cellulaire sélectivité des connexions synaptiques

5 b) processus physiologiques chez l adulte répression de l apoptose par l érythropoïèse nombre de globule rouge homéostasie cellulaire: constance du nombre de cellule ex: cellules produites/sec par mitoses chez l homme = nbr cellules éliminées par apoptose 95% de la production journalière de lymphocytes B et T mort par apoptose (sélection des lymphocytes fonctionnels) destruction des cellules: - dommages sévères de l ADN - infectées - caractère auto-immun - signal mitogène inapproprié (apoptose/cycle cellulaire)

6 c) processus pathologiques défaut : dysfonctions du programme apoptotique pathologies diverses: cancer maladie auto-immune propagation des infections virales excès : maladies neurodégénératives SIDA ischémie

7 II) Cytologie de l apoptose Apoptose (processus actif): contraction cellulaire condensation de la chromatine fragmentation de l ADN fragmentation du noyau maintient de l intégrité des organites bourgeonnements cellulaires et formation de corps apoptotiques maintient de l intégrité mb plasmique phagocytose des corps apoptotiques pas de processus inflammatoire

8 C A mise en évidence de l apoptose: marquage au bromure d ethidium (BET) fragments internucléosomiques terminal deoxynucleotidyl transferase technique «tunnel»: contrôle apoptose

9 autre type de mort cellulaire: Nécrose (ex: trauma; processus passif) gonflement cellulaire destruction des organites rupture de la mb plasmique libération incontrôlée du contenu cytoplasmique inflammation nécrose apoptose

10 III) Mécanismes moléculaires de l apoptose une famille de protéine occupe une place centrale dans le mécanisme moléculaire de l apoptose: les caspases signal inducteur = signal apoptotique procaspases initiatrices (inactives) auto activation caspases initiatrices (actives) procaspaces effectrices (inactives) caspases effectrices (actives) Protéolyse de substrats (nucléaires, cytoplasmiques)

11 signal inducteur = signal apoptotique: déclenchement de l apoptose par différents stimuli intra- et extracellulaires: - mécanismes de réparation de l ADN défectueux - molécules cytotoxiques ou irradiation - défaut de signalisation du cycle cellulaire - signaux de mort cellulaire (TNF-α, FasL, TRAIL...)

12 phase latente (qq heures à plusieurs jours) début de phase latente: processus réversible (facteurs de survie) phase d exécution de l apoptose: changements morphologiques mort cellulaire

13 dissection génétique du mécanisme apoptotique: chez C.elegans: mort cellulaire oligomérisation ced-3+ced inducteur (C.elegans) ced-3 ced-4 inhibiteur (mammifères...) caspases Apaf-1 (Apoptotic Protease Activating Factor) = pièce principale de l apoptosome

14 - - (C.elegans) egl-1 ced-9 (mammifères...) protéines de la famille Bcl-2 (pro- et anti-apoptotiques) rôle important dans la médiation et la régulation des voies de signalisation apoptotiques

15 les caspases: pro-domaine DED DED Death Effector Domain pro-domaine CARD procaspase grande sous-unité petite sous-unité (-8, -10) caspases initiatrices (-9, -2) caspase active CAspase Recruitment Domain caspases effectrices (-3, -6, -7)

16 signal extracellulaire via récepteur de mort recrutement des caspases initiatrices via leur pro-domaine signal intracellulaire

17 voie extracellulaire recrutement de procaspase-8 via ses DEDs par DISC (Death Inducing Signaling Complex) DISC = complexe initié par fixation des ligands de la famille TNF-α trimérisation du récepteur association homophile de FADD (Fas Associated Death Domain) avec FAS-R via domaines DD association homophile de procaspase 8 et de FADD via domaines DED agrégation de procaspase-8

18 proximité de plusieurs procaspases-8 activations mutuelles par autoprotéolyse active caspase-8 clivage (activation) de caspases effectrices clivages de substrats

19 voie intracellulaire A) voie mitochondriale de l activation des caspases: Procaspases-9 activée par des signaux proapototiques mitochondriaux formation de l apoptosome = complexe protéique cytoplasmique sous l influence du cytochrome C relargué par la mitochondrie

20 voie intracellulaire B) formation de l apoptosome et activation: Cyt C + datp chgt de conformation de Apaf-1 heptamérisation de Apaf-1 association homophilique procaspase-9/ Apaf-1 via domaines CARD activation de Caspase-9 par dimérisation activation protéolytique des caspases effectrices

21 voie de signalisation de type I: - récepteur TNFR - adaptateur FADD -complexe DISC - procaspase-8 voie de signalisation de type II: voie I insuffisante pour déclencher l apoptose amplification par la voie mitochondriale nécessaire

22 Bid (famille Bcl-2) clivé par caspase-8 active le relargage de Cyt C de concert avec Bax et Bak (pro-apoptose, famille Bcl-2) activation cascade des caspases formation apoptosome

23 voie mitochondriale: - amplifie la voie des récepteurs membranaire - intègre et propage des signaux de mort cellulaire d origine intracellulaire (altération de l ADN, stress oxidatif, faibles ressources en métabolites, médicaments)

24 altérations de l ADN: activation du facteur de transcription p53 stimule la production de molécules pro-apoptotiques [BH3 (ex:bid), Bax, Bak..]

25 mitochondrie: l induction de l apoptose change la perméabilité de la mb interne (= Transition de Perméabilité) gonflement de la mitochondrie (influx H2O) rupture de la mb externe libération de facteur pro-apoptotiques arrêt de la synthèse d ATP NADH, NADPH oxidés production de ROS (Reactive Oxygène Species) stress oxidatif (oxidation de lipides, protéines, ADN)

26 Transition de Perméabilité: mécanisme? formation d un pore de transition de perméabilité (PTP): mb externe mb interne VDAC (Voltage Dependant Anion Channel) (= porine) ANT (Adenin Nucleotide Translocator) (exportation d ATP contre ADP) l association VDAC/ANT génère des sites de contact mb ext/ mb int ou canaux dans la mb externe: homodiméres Bax ou hétérodimères Bax/VDAC

27 Conséquences de l activation de caspases: (substrats des caspases) les caspases elles-mêmes (procaspases) des protéines du cytosquelette (gelsoline, lamin, fodrine, actine) des protéines de régulation de l apoptose (Bid, Bcl-2) des inhibiteurs d endonucléases (Inhiteur CAD = ICAD) libère la CAD: Caspase Activated DNAse des protéines impliquées dans la régulation du cycle cellulaire (p21, PRb) des enzymes de réparation de l ADN

28 IV) Régulation des voies de signalisation de l apoptose cellules saines fonctionnelles: mécanismes de contrôle et de blocage de l apoptose Hypothèse 1: les voies de signalisation de l apoptose sont dans un état inactif et s activent qu en cas de signal de mort mais: les composants de l apoptoses sont encodés par la plus part des cellules sous une forme «prête à l emploi» Hypothèse 2: toutes les cellules sont programmées pour l autodestruction mais survivent par répression de l apoptose sous l influence de facteurs de croissance, d hormones, de nutriments et en effet: différentes molécules anti-apoptotiques ont été caractérisées (et pro-apoptotiques également)

29 A) famille Bcl-2 Bcl-2 (oncogène): effet anti-apoptotique (autres oncogènes prolifération C aire ) (cancers: contrôle prolifération cellulaire et apotose) familles des protéines Bcl-2: domaines BH1 à BH4: 30 protéines de cette famille chez l homme avec effets pro- ou anti-apoptotique pro-survie (anti-apoptotiques): Bcl-X L, Bcl-w, A1, Mcl-1 (BH1,2,3,4) pro-apoptotiques): Bax, Bak, Bok (BH1,2,3) et Bid, Bim, Bik, Bad, Bmf, Hrk, Noxa, Puma, Blk, BNIP3, Spike (BH3 «only») domaine suffisant pour induire la mort cellulaire

30 mode d action de la famille Bcl-2: c.elegans - - interaction ced-9/caspases inhibition apoptose mammifères egl-1 déplacement de ced-9 desinhibition de l apoptose pas d interactions Bcl-2/Apaf-1

31 les Bcl-2 antiapoptotiques chez les mammifères: contrôle du relargage du cytochrome C, de l intégrité mitochondriale

32 Double knock-out Bax et Bak (pro-apoptotiques): diminution de l apoptose pdt le développement accumulation de cellules surnuméraires (cerveau et cellules immunes) celulles Bax -/- Bak -/- : insensibles aux irradiations!! Bax Bak canaux propres particicipation au PTP } perméabilité mb externe Mito

33 protéines anti-apoptotique famille Bcl-2 bloquent (Bax, Bak,...) via interaction domaine BH3 antagonise les effets de Bcl-2 oligomérisation Bax ou Bak

34 A) famille IAPs Inhibitor of Apoptosis Proteins (et aussi Bcl-2 et Bcl-X L ) + NF-κB: facteur de transcription (régulateur du système immun) protéines IAP: domaine BIR inhibition caspases 3, 7, 9 domaine RING catalysent leur propre ubiquitinisation dégradation (protéasome)

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36 V) Pathologies liées à une dérégulation de l apoptose défaut cancer: accumulation de cellules cancéreuses, résistances aux médicaments, autoimmunité: impossibilité d éliminer les lymphocytes autoréactifs excès neurodégénérescence: maladies d Alzheimer, Parkinson, Huntington

37 dysfonctions: mutation de gènes impliqués dans l initiation, la médiation ou l execution de l apoptose mutation Bax et Bak survie des cellules cancéreuses surexpression de Bcl-2 dans les processus tumoraux survie des cellules cancéreuses p53: point de contrôle important dans l apoptose: inactivé dans plus de 50% des cancers humain

38 facteur de transcription stress génotoxiques altérations ADN supresseur de tumeur kinase dommages ADN réparables: p53 bloque le cycle cellulaire avt phase S dommages irréparables: p53 induit l apotose