La détection des cellules du système immunitaire par la Cytométrie en flux

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1 La détection des cellules du système immunitaire par la Cytométrie en flux

2 Les différentes méthodes de détection des cellules du système immunitaire 1 - Etude morphologique Elle est réalisée sur 2 types de préparations : Le frottis sanguin : il permet de définir les caractéristiques des cellules immunitaires "opérationnelles" présentes dans le sang Le frottis de moelle osseuse : composé de cellules blastiques, à l'origine des différents types de cellules immunitaires. 2 - La cytométrie en flux Elle permet de réaliser une étude quantitative et dynamique des populations de cellules immunitaires immunocompétentes et notamment des populations lymphocytaires. Cette étude constitue une surveillance indispensable à la suite de greffes, d'une infection par le VIH et dans le cas de maladies autoimmunes. Le résultat est présenté sous la forme d'un cytogramme (figurant sans beaucoup d'explications, dans certains livres de Terminale S) Le principe Devant un faisceau laser on fait défiler une à une, en un flux régulier, les cellules à identifier et à comptabiliser (document 1). Chaque cellule traversant le faisceau le dévie et l'interrompt. L'interruption du faisceau permet de compter les cellules. Les angles variés de déviation du faisceau sur les différentes structures cellulaires (membrane plasmique, enveloppe nucléaire, ultrastructures cytoplasmiques, etc.) permettent de déterminer certaines caractéristiques morphologiques des cellules étudiées (document 2). - la taille cellulaire, - le rapport nucléocytoplasmique, - la granularité du cytoplasme. On obtient ainsi après traitement informatique des données obtenues, un cytogramme "général". L'identification plus précise des différentes populations de lymphocytes nécessite l'emploi d'anticorps spécifiques de certains marqueurs membranaires (marqueurs "CD") caractéristiques de ces cellules. Ces anticorps sont repérables, grâce à l'utilisation de différentes molécules fluorescentes (fluorochromes) fixées sur leurs fragments FC (document 4).

3 Document 1 L'intensité des différentes couleurs de fluorescence est évaluée par des détecteurs (photomultiplicateurs -document 3-) spécifiques de chaque longueur d'onde. On obtient alors (toujours après traitement informatique des données obtenues) un autre type de cytogramme, plus précis.

4 Document 2

5 Document 3 Document 4

6 2.2 - Interprétation des deux types de cytogrammes Exemple 1 : Il s'agit d'un cytogramme "général" de la population de leucocytes isolés à partir d'un prélèvement sanguin. Cytogramme 1 FSC = forward scatter : c'est une diffusion aux petits angles permettant d'évaluer la taille de la cellule. SSC = side scatter : c'est une diffusion aux grands angles permettant d'évaluer la "granularité" du contenu cytoplasmique de la cellule étudiée. Ainsi, plus la taille de la cellule sera élevée, plus elle sera située vers la droite ; plus son contenu sera hétérogène, plus elle se localisera vers le haut. Exercice : En faisant appel à vos connaissances sur les caractéristiques morphologiques des différents leucocytes tels que vous les avez observés sur frottis sanguin, identifiez les 3 populations leucocytaires entourées chacune par une courbe polygonale sur le cytogramme ci-dessus.

7 Exemple 2 : Il s'agit de l'étude plus détaillée de la population de lymphocytes (Cytogramme 2). Cytogramme 2 UL = haut gauche UR = haut droit LL = bas gauche LR = bas droit les quatre quadrants du cytogramme On utilise des anticorps spécifiques, l'un du marqueurs CD4, l'autre du marqueur CD3. L'anticorps anticd4 est marqué par la phycoérythrine (PE) (voir document 4), fluorochrome, émettant une fluorescence rouge-orangée en lumière ultraviolette. L'anticorps CD3 est marqué par l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), autre fluorochrome émettant une fluorescence verte dans les mêmes conditions. Voir schéma page suivante

8 Fluorochrome Marqueur CD 4 Marqueur CD 3 PE Lymphocyte FITC Lymphocyte Anticorps anti CD 4 CD 4 Anticorps CD 3 anti CD 3

9 Les lymphocytes T ont tous en commun le marqueur CD3 : ils sont tous CD3 +. Les lymphocytes T4 ont, en plus, le marqueur CD4 : ils sont CD4 +. La répartition des lymphocytes dans les 4 quadrants devient donc : UR : CD4 + / CD3 + = LT4 LR : CD4 - / CD3 + = LT8 (ont CD8, non testé ici) UL : CD4 + / CD3 - = ici CD4 + est faiblement exprimé, il s'agit de monocytes qui par ailleurs ne possèdent pas CD3 LL : CD4 - / CD3 - = il s'agit des LB, des cellules NK et de débris cellulaires qui ne possèdent ni CD4, ni CD3. Exercices d'application : Exercice 1 : Cytogramme 3 Cytogramme :Complètez le cytogramme 3 en délimitant et en identifiant logiquement les populations leucocytaires. 1.2 :Quel(s) renseignement(s) complémentaire(s) tirez-vous de l'analyse du cytogramme 4? Justifiez votre réponse.

10 Exercice 2 : 1 : Comparer les cytogrammes de Robert et de Stéphane. Quelles anomalies constatez-vous? 2 : Quelles sont les conséquences au niveau des défenses immunitaires? Cytogramme 5 Cytogramme 6