Cortisol Urine ELISA
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- Jean-Louis Leroux
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1 Fiche technique Cortisol Urine ELISA Test immuno-enzymatique pour le dosage quantitatif du cortisol dans l urine. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)
2 1 BUT DU TEST Test immuno-enzymatique pour le dosage quantitatif du cortisol libre dans l urine. 2 SIGNIFICATION CLINIQUE Le cortisol est une hormone stéroïde libérée depuis le cortex surrénalien en réponse à l hormone ACTH (produite par l hypophyse). Il est impliqué dans la réponse au stress ; il fait augmenter la tension artérielle, les concentrations de sucre dans le sang, il peut provoquer une infertilité chez les femmes et déprimer le système immunitaire. Le cortisol agit par l intermédiaire de récepteurs intracellulaires spécifiques et a des effets sur de nombreux systèmes physiologiques comme les fonctions immunitaires, la contre-régulation du glucose, le tonus vasculaire, l utilisation des substrats et le métabolisme osseux. Le cortisol est principalement excrété dans l urine sous forme libre (non liée). Dans le plasma, le cortisol se lie avec une forte affinité aux globulines de liaison des corticostéroïdes (CBG, transcotine), et à l albumine. Seul le cortisol libre et disponible pour la plupart des récepteurs. Ces fonctions endogènes normales constituent la base des conséquences physiologiques du stress chronique, une sécrétion prolongée de cortisol provoque fonte musculaire, hyperglycémie et dépression des réponses immunitaire / inflammatoire. Les mêmes conséquences apparaissent en cas d utilisation à long terme des médicaments glucocorticoïdes. La fraction libre du cortisol représente le cortisol métaboliquement actif. Dans des conditions normales, moins de 1 % sont excrétés dans les urines. Dans des conditions pathologiques (syndrome de Cushing) les concentrations urinaires de cortisol libre sont élevées parce que les CBG ne se lient pas au cortisol plasmatique en excès et qu il est éliminé par les urines. Pendant la grossesse ou un traitement œstro-progestatif une augmentation du cortisol plasmatique est provoquée par une augmentation de la production des protéines de transport, mais il s en suit des concentrations urinaires en cortisol libre normales pour indiquer un fonctionnement surrénalien correct. Ce test est très utile pour estimer la fonction surrénalienne réelle car il mesure le cortisol libre, c est-à-dire la forme métaboliquement active. De plus, la mesure du cortisol libre constitue le meilleur paramètre du diagnostic du syndrome de Cushing. 3 PRINCIPE DU TEST Le test immuno-enzymatique sur phase solide (ELISA) est basé sur le principe de compétition. La quantité inconnue d antigènes présents dans l échantillon et une quantité fixe d antigènes conjugués à une enzyme entrent en compétition pour les sites de fixation des anticorps coatés dans les puits. Après incubation, les puits sont lavés pour arrêter la réaction de compétition. L intensité de la couleur développée suivant la réaction substrat est inversement proportionnelle à la quantité d antigène présente dans l échantillon. Les résultats des échantillons peuvent être déterminés directement à partir de la courbe étalon. 4 RÉACTIFS, MATÉRIEL ET EQUIPMENT 4.1 Réactifs et matériel fournis 1. Coated Microplate MTP (1 Plaque de Microtitration à detacher) Anti-Cortisol IgG adsorbé sur la microplaque 2. Conjugate CONJ (Conjugué) 1 x 33 ml Cortisol conjugué à la HRP 3. Cortisol Standards CAL 0 (Etalons) 1 x 4.0 ml 4. Cortisol Standards CAL 1-4 (Etalons) 1 x 4 x 1.0 ml 5. Washbuffer (10x) WASHBUF CONC (Tampon de lavage) 1 x 50 ml Tampon phosphate, ProClin < % 6. TMB Substrate TMB SUBS (Solution Substrat TMB) 1 x 15 ml H 2 O 2 -TMB 0.25 gr/l (éviter le contact avec la peau) 7. Stop Solution TMB STOP (Solution d Arrêt) 1 x 15 ml Acide Sulfurique 0.15 mol/l (corrosive: éviter le contact avec la peau) 8. Control Low CONTROL LOW (Contrôle Bas) 1 x 1 ml 9. Control High CONTROL HIGH (Contrôle Elévé) 1 x 1 ml 4.2 Réactifs requis, mais non fournis Eau distillée. Version 01/ / 5
3 4.3 Matériaux auxiliaires et instrumentation Multipette. Un spectrophotomètre lecteur de micro-plaques calibré (450nm, nm) Remarques Stocker tous les réactifs à 2-8 C dans l obscurité. N'ouvrir le sachet du Microplaque enrobé (MTP) qu'après l'avoir ramené à température ambiante et refermez-le tout de suite après avoir prélevé les bandes à utiliser; une fois ouvert, il est stable jusqu'à la date d'échéance du coffret. 5 AVERTISSEMENTS Seulement prévu au diagnostic in-vitro et à l usage professionnel. Non prévu pour usage interne ou externe chez les humains ou les animaux. Porter des blouses de laboratoire, gants en latex à usage unique et lunettes de protection si nécessaire. Suivre les bonnes pratiques de laboratoire et les directives de sécurité. Comme conservateurs, certains réactifs contiennent du ProClin 300. Éviter tout contact de la peau ou des muqueuses. Le Chromogène TMB contient un irritant qui peut être nocif si inhalé, ingéré ou absorbé à travers la peau. Pour empêcher des lésions, éviter toute inhalation ou ingestion par la peau ou les yeux et tout contact cutané ou oculaire. Eviter tout contact avec la solution d arrêt. Elle peut provoquer des irritations et brûlures cutanées. Éviter d exposer le réactif TMB/H 2 O 2 à la lumière directe du soleil, aux métaux ou aux oxydants. Ne pas congeler les réactifs. Cette méthode permet la détermination de Cortisol pour une concentration comprise entre 10 ng/ml et 500 ng/ml. L importance clinique du dosage en Cortisol peut être non valide si le patient a été traité par des corticoïdes ou des stéroïdes naturels ou synthétiques. 6 PRECAUTIONS D UTILISATION Observer rigoureusement l'ordre des passages indiqué dans le présent protocole. Les résultats présentés ici ont été obtenus en utilisant les réactifs spécifiques énumérées dans ces Instructions d'utilisation. Tous les réactifs doivent être conservés à une température contrôlée de 2-8 C dans leurs conteneurs originaux. Les exceptions sont clairement marquées. Amener tous les réactifs et échantillons à température ambiante (22-28 C) et mélanger doucement en tournant chaque flacon de réactif liquide et d échantillon avant emploi. Suivez le numéro du lot et la date de péremption. Ne pas mélanger les réactifs de différents lots. Ne pas utiliser de réactifs périmés. Au cas où un automate est utilisé, il appartient à l utilisateur de s assurer que le kit a été bien validé sur ce dernier. Un lavage incomplet ou peu soigné et une aspiration insuffisante du liquide dans les puits des tests ELISA peuvent provoquer un manque de précision et/ou un arrière-plan élevé. Il est important que la durée de la réaction dans chaque puits soit maintenue constante pour obtenir des résultats reproductibles. La durée du pipetage des échantillons ne doit pas dépasser dix minutes pour éviter tout drift de dosage. Si plus d une plaque doit être utilisée, il est recommandé d effectuer une courbe étalon pour chaque plaque. L addition de la solution substrat lance une réaction cinétique à laquelle il est mis fin par l addition de la solution d arrêt. Par conséquent, l addition de la solution substrat et celle de la solution d arrêt doivent être effectuées à la même cadence afin d éliminer toute déviation due au temps différent de réaction. Observer les instructions relatives à l'exécution du contrôle de qualité dans les laboratoires cliniques en testant les contrôles. Observer la plus grande précision dans la reconstitution et la distribution des réactifs Les lecteurs de plaques procèdent aux mesures verticalement. Ne pas toucher le fond des puits. 7 RÉALISATION DU TEST 7.1 Préparation des Etalons (CAL 0 CAL 4) Avant utilisation, laisser sur l'agitateur rotatif pendant au moins 5 minutes. Les étalons ont la concentration suivante en Cortisol: CAL 0 CAL 1 CAL 2 CAL 3 CAL 4 ng/ml Une fois ouverts, ils sont stables pendant 6 mois à 2-8 C. 7.2 Préparation du Conjugué Conjugué prêt à l'emploi. Une fois ouvert, le conjugué est stable pendant 6 mois à 2-8 C. Version 01/ / 5
4 7.3 Préparation des Échantillons Le dosage du cortisol peut être effectué sur des échantillons d urine humaines. Note importante: le kit a été développé pour être utilisé sur des urines non traitées. Une acidification des urines menant à un ph inférieur à 5,0 peut interférer dans le test et engendrer des résultats aberrants. Il n'est pas nécessaire de diluer l'échantillon. Le volume total d urine excrétée durant 24 heures doit être recueilli et mélangé dans un seul conteneur. Les échantillons d urine qui ne doivent pas être analysés immédiatement doivent être conservés à 2-8 C( 48h) ou à -20 C ( 6 mois). Contrôles prêt à l'emploi. Les échantillons suspectés de contenir une concentration supérieure à celle de l étalon le plus concentre doivent être dilués avec l étalon 0. (Multiplier les résultats mesurés par le facteur de dilution pour obtenir les résultats corrects). 7.4 Préparation de la solution de lavage Diluer le contenu de chaque flacon de la solution de lavage concentrée 10x avec de l'eau distillée pour un volume final de 500 ml avant utilisation. Pour les plus petits volumes de respecter le taux de dilution 1:10. La solution de lavage diluée est stable pendant 30 jours à 2-8 C. En solution de lavage concentrée est possible d'observer la présence de cristaux, dans ce cas, il suffit de mélanger à température ambiante jusqu'à dissolution complète des cristaux. Pour plus de précision, diluer toute la bouteille de solution de lavage concentrée à 500 ml, en prenant soin de transférer complètement les cristaux, puis mélanger jusqu'à ce que les cristaux soient complètement dissous. 7.5 Procédure Avant de procéder au test, tous les réactifs, les références et les contrôles sériques doivent être amenés à température ambiante (22-28 C), au moins 30 minutes auparavant. Les puits non utilisés doivent être conservés entre 2 C et 8 C, dans des poches en aluminium hermétiquement fermées, et les puits utilisés dans les cadres fournis. Pour éviter les risques microbiens et / ou la contamination chimique, les réactifs non utilisés ne doivent pas être transférés dans des flacons originaux. Comme il est nécessaire d effectuer le dosage en double, préparer deux puits pour chacun des cinq points de la courbe étalon (CAL 0 - CAL 4), deux pour chaque Contrôle, deux pour chaque échantillon, et un pour le Blanc. Étalon / Contrôle Échantillon Blanc Étalons CAL 0 CAL 4 Contrôle 10 µl - - Échantillon - 10 µl - Conjugué 300 µl 300 µl - Bien mélanger. Incuber à 37 C pendant 1 heure. Décanter le contenu des puits et rincer les puits 3 fois avec de la Solution de Lavage diluée (350 μl par puits). Important: lors de chaque étape de lavage, agitez doucement la plaque pendant 5 secondes et videz la solution de lavage en frappant la plaque retournée sur un papier absorbant. Laveur automatique: au cas où vous utilisez un laveur automatique, il est conseillé de faire 6 étapes de lavage. Vider le contenu de chaque puits; laver les puits 2 fois avec 400 μl d eau distillée. Substrat TMB 100 µl 100 µl 100 µl Incuber à température ambiante (22 C à 28 C) pendant 15 minutes à l obscurité. Solution d Arrêt 100 µl 100 µl 100 µl Mesurer la densité optique avec un photomètre à 450 nm (longueur d onde de référence: nm en mettant à zéro avec le blanc) dans les 5 min suivant l ajout de la Solution d Arrêt. Version 01/ / 5
5 8 CONTROLE DE QUALITE Chaque laboratoire doit doser des contrôles dans des gammes de concentrations de cortisol urinaire normale, haute et basse afin de surveiller les performances du dosage. Ces contrôles doivent être traités comme des échantillons inconnus et leurs valeurs déterminées au cours de chaque procédure de test réalisée. Des cartes de contrôle qualité doivent être établies afin de suivre les performances des réactifs fournis. Des méthodes statistiques pertinentes doivent être employées pour vérifier les tendances. Chaque laboratoire doit fixer les limites acceptables des performances des dosages. Parmi les autres paramètres qui doivent faire l objet d un suivi, on trouve les points à 80, 50 et 20 % de la courbe d étalonnage pour la vérification de la reproductibilité de série à série. De plus, l absorbance maximum doit être cohérente avec celles des expériences passées. Une déviation significative par rapport aux performances établies peut indiquer une modification passée inaperçue des conditions expérimentales ou une dégradation des réactifs du kit. Des réactifs frais doivent être utilisés pour déterminer la raison de ces variations. 9 COURBE ÉTALON - CALCUL DES RESULTATS 9.1 Absorbance moyenne et pourcentage relatif Calculer l absorbance moyenne (OD m ) pour chaque point de la courbe d étalonnage et pour chaque échantillon. 9.2 Courbe étalon Tracer les valeurs de l absorbance des standards par rapport à la concentration. Tracer la courbe de meilleur ajustement passant par les points tracés (par ex.: logistique à quatre paramètres). 9.3 Calcul des résultats Interpoler les valeurs des échantillons sur la courbe d étalonnage pour obtenir les valeurs correspondantes des concentrations exprimées en ng/ml. Pour calculer la concentration du cortisol dans l urine, procéder au même calcul que ci-dessus et corriger en fonction du volume total d urine recueilli en 24 heures: ng/ml x Vol(mL) urine 24 h / = µg Cortisol/ 24 heures 10 VALEUR DE REFERENCE Les concentrations urinaires de cortisol sur 24 h sont comprises dans les intervalles suivants: µg/24 heures 11 CARACTERISTIQUES DU TEST 11.1 Précision Variation Intra-Essai Les variations à l intérieur d une série ont été déterminées par des mesures répliquées (20x) de trois sérums de contrôles différents au cours d un seul dosage. La variabilité à l intérieur du dosage est de 6.5 % Variation Inter-Essai Les variations entre les séries ont été déterminées par des mesures répliquées (10x) de trois sérums de contrôles différents provenant de différents lots du kit. La variabilité entre les dosages est 7.2 % Exactitude La récupération ng/ml de cortisol urinaire ajouté à un échantillon a donné une valeur moyenne (±SD) de % ± 8.16% par rapport aux concentrations d origine Sensibilité La plus faible concentration détectable de Cortisol Urinaire qui se distingue de l étalon zéro est 2.95 ng/ml à la limite de confidence de 95 %. Version 01/ / 5
6 11.4 Spécificité La réaction croisée de l anticorps calculé à 50% selon Abraham est indiquée dans le tableau: Cortisol 100 % Prednisolone 46.2 % 11-Deoxycortisol 4 % Cortisone 3.69 % Prednisone 3.10 % 11αOH Progesterone 1 % Progesterone < 0.1 % Aldosterone < 0.1 % Pregnenolone < 0.1 % 17b Estradiol < 0.1 % Estrone 3-solfato < 0.1 % Estriol < 0.1 % Testosterone < 0.1 % Spironolactone < 0.1 % DHEA < 0.1 % DHEA-S < 0.1 % Androstenedione < 0.1 % Androsterone < 0.1 % DHT < 0.1 % Danazol < 0.1 % Cholesterol < 0.1 % Dexamethasone < 0.1 % 11.5 Corrélation Le Cortisol (Urine) ELISA a été comparé à un autre dosage de Cortisol Urinaire commercialement disponible. La courbe de régression linéaire a été calculée y = 0.90* x r 2 = ELIMINATION DES DECHETS RELATIFS AU KIT L élimination des déchets relatifs au kit doit être réalisée selon les règles nationales en vigueur. 13 BIBLIOGRAPHIE 1. Foster, L.B. and Dunn, R.T. Clin Chem: 20/3, 365 (1974) 2. De Laceda, L., Kowarski, A., and Migeon, C.J. J. Clin Endocr. and Metab: 36:227 (1973) 3. Rolleri, E., Zannino, M., Orlandini, S., Malvano, R. Clin chim Acta (1976) 4. Kobayashi, Y., et al. Steroids, 32 no. 1 (1978) 5. Arakawa, H., Maeda, M., Tsuji, A. Anal. Biochem (1979) Version 01/ / 5
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8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθμός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons. WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Symbols Version 4.5 /
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