UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS DE TOURS

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1 UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS DE TOURS ÉCOLE DOCTORALE Santé, Sciences, Technologie INSERM U618 THÈSE présentée par : Agnès MAILLET soutenue le : 27 novembre 2008 pour obtenir le grade de : Docteur de l Université François - Rabelais Discipline/ Spécialité : Sciences de la Vie et de la Santé EFFET THÉRAPEUTIQUE DU CETUXIMAB ADMINISTRÉ PAR AÉROSOL DANS UN MODÈLE ANIMAL DE TUMEUR BRONCHO-PULMONAIRE Importance du récepteur FcRn dans la réponse anti-tumorale à cet anticorps THÈSE dirigée par : M. LEMARIÉ Etienne Professeur, Université François - Rabelais, Tours Co-encadrement par : Mme HEUZÉ-VOURC H Nathalie Chargée de Recherche 2 ème classe - INSERM, Tours RAPPORTEURS : M. CADRANEL Jacques Professeur, Université Paris VI M. BARBET Jacques Directeur de Recherche - CNRS, Université de Nantes JURY : M. BARBET Jacques Directeur de Recherche - CNRS, Université de Nantes M. BERHENS Christian Chef de projet, LFB Biotechnologies, Les Ulis M. CADRANEL Jacques Professeur, Université Paris VI M. DIOT Patrice Professeur, Université François - Rabelais, Tours M. LEMARIÉ Etienne Professeur, Université François - Rabelais, Tours M. OHRESSER Marc Ingénieur de Recherche - CNRS, Université François - Rabelais, Tours

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3 UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS DE TOURS ÉCOLE DOCTORALE Santé, Sciences, Technologie INSERM U618 THÈSE présentée par : Agnès MAILLET soutenue le : 27 novembre 2008 pour obtenir le grade de : Docteur de l Université François - Rabelais Discipline/ Spécialité : Sciences de la Vie et de la Santé EFFET THÉRAPEUTIQUE DU CETUXIMAB ADMINISTRÉ PAR AÉROSOL DANS UN MODÈLE ANIMAL DE TUMEUR BRONCHO-PULMONAIRE Importance du récepteur FcRn dans la réponse anti-tumorale à cet anticorps THÈSE dirigée par : M. LEMARIÉ Etienne Professeur, Université François - Rabelais, Tours Co-encadrement par : Mme HEUZÉ-VOURC H Nathalie RAPPORTEURS : Chargée de Recherche 2 ème classe - INSERM, Tours M. CADRANEL Jacques Professeur, Université Paris VI M. BARBET Jacques Directeur de Recherche - CNRS, Université de Nantes JURY : M. BARBET Jacques Directeur de Recherche - CNRS, Université de Nantes M. BERHENS Christian Chef de projet, LFB Biotechnologies, Les Ulis M. CADRANEL Jacques Professeur, Université Paris VI M. DIOT Patrice Professeur, Université François - Rabelais, Tours M. LEMARIÉ Etienne Professeur, Université François - Rabelais, Tours M. OHRESSER Marc Ingénieur de Recherche - CNRS, Université François - Rabelais, Tours

4 REMERCIEMENTS Cette thèse a été réalisée au sein de l unité INSERM U618, dans l équipe «Aérosols et Cancer broncho-pulmonaire», à la Faculté de Médecine de l Université François-Rabelais de Tours, sous la direction du Professeur Etienne LEMARIÉ et du Docteur Nathalie HEUZÉ- VOURC H. Je tiens particulièrement à remercier Nathalie HEUZÉ-VOURC H, ma co-encadrante de thèse, avec qui j ai beaucoup appris pendant ces trois années de thèse aussi bien sur le plan scientifique que sur le plan humain. Nathalie, merci pour ta gentillesse, ta bonne humeur, ta présence et ton soutien permanent. Je suis très heureuse d avoir été «cobaye» pour ta première thèse et espère que tu auras aimé autant que moi l équipe que nous avons formée pendant ces trois années! Je remercie également le Professeur Etienne LEMARIÉ, mon directeur de thèse, pour l approche clinique qu il a apportée à nos nombreuses réflexions et pour sa bienveillance. J adresse mes plus sincères remerciements aux membres du jury, le Docteur Jacques BARBET et le Professeur Jacques CADRANEL qui me font l honneur d être les rapporteurs de ma thèse, le Docteur Christian BEHRENS, le Professeur Patrice DIOT et le Docteur Marc OHRESSER qui ont accepté de juger cette thèse. Je remercie les différents organismes qui ont financé cette thèse et qui ont permis qu elle existe. La SPLF, Pneumologie et Développement et l ARAIR pour le soutien financier de la thèse mais également l INSERM, le Ministère de la Recherche, l IFR 135, le Cancéropôle Grand Ouest et la Ligue Contre le Cancer.

5 Je tiens également à remercier toutes les personnes avec qui nous avons collaboré pendant ces trois années. Ça a été un réel plaisir pour moi de partager leur expérience et leur savoir faire : - Laurent GUILLEMINAULT qui a mis de côté sa blouse de médecin pour venir travailler à nos côtés pendant un an. J ai beaucoup aimé travailler avec toi pendant ces quelques mois où tu es venu agrandir la petite famille «cetuximab» et ton regard de clinicien a été de précieux conseils! - l équipe du CIPA d Orléans avec qui nous avons fait une grande majorité des expérimentations animales : Alain LE PAPE, Stéphanie LERONDEL, Maryline LEMÉE, Stéphanie RÉTIF, Sabrina PESNEL et Julien SOBILO. Merci d avoir chouchouté nos animaux! - les équipes 6 et 7 de l UMR CNRS 6239-GICC de Tours avec qui nous avons étroitement collaboré et qui nous ont approvisionné en cetuximab (vue notre consommation, ce n était pas négligeable!) : Nicolas CONGY-JOLIVET et Gilles THIBAULT pour nous avoir gentiment aidés sur les études de cytométrie en flux, Gilles PAINTAUD et Nicolas AZZOPARDI pour leur précieuse aide sur la pharmacocinétique, Marc OHRESSER pour les différentes constructions plasmidiques FcRn α et β2m et Hervé WATIER, Marie-Cécile ROUSSANNE et Charlotte MAGDELAINE pour leurs conseils avisés tout au long de ce projet. - les collègues du bâtiment M : Sandrine LEGUELLEC et Laurent VECELLIO pour leur gentillesse, leur grande disponibilité et leurs conseils sur les aérosols, Jérome MONTHARU et Georges ROSEAU (du PPF animalerie) pour la bonne humeur qu ils ont apportée aux expérimentations animales et Michèle DE MONTE pour ses conseils sur les études statistiques. - Serge GUYETANT, Claire BLÉCHET, Sandra REGINA et Catherine COCO pour la collecte des prélèvements pulmonaires et des données anatomo-pathologiques et cliniques. Merci d avoir pris le temps pour les études immunohistochimiques et pour l analyse des données clinico-pathologiques des patients.

6 - le laboratoire Novaxia dirigée par Brigitte LEGRAIN et le docteur Dominique-Henri DOUVIN pour les analyses anatomo-pathologiques des prélèvements de souris. - José HUREAUX du CHU d Angers pour m avoir formée pour les premières aérosolisations chez la souris et Isabelle Valo pour les études anatomopathologiques. - Serge BERNARD et Hervé LEROUX de l INRA de Nouzilly qui nous ont gentiment accueillis dans leur laboratoire pour l étude de tolérance. - Jacques BARBET et Alain FAIVRE-CHAUVET de l INSERM U892 de Nantes pour le marquage du cetuximab à l iode le laboratoire du LFB Biotechnologies pour la purification de l anticorps anti-fcrn α. - Anthony COURTOIS du laboratoire de Biotechnologie et Molécules Marines de Brest pour le marquage du cetuximab au FITC. - le Professeur ANTHONIOZ et Claudine PROUIN du laboratoire de cytologie du CHU Bretonneau pour leur gentillesse. - Patrick VOURC H pour nous avoir fait partager son expérience sur les études épigénétiques. - Yves COURTY pour ses conseils avisés en biologie moléculaire, Pascale REVERDIAU et Sophie IOCHMANN pour leur expérience sur les modèles animaux et la méthylation. - Sophie HAMARD, Jérôme JAILLET, Christelle PARENT et Nathalie RICHE, pour leur bonne humeur, leur gentillesse et leur aide technique et diverse

7 de côtoyer : Ainsi que toutes les personnes du bâtiment 47C et de l équipe 3A que j ai eu la chance Sylvie ATTUCCI, Martine BERTON, Camille BIANCHI, Eric BOISSINOT, Michèle BRILLARD, Jacques CHANDENIER, Sandrine DALLET-CHOISY, Elisabeth DIOT, Patrice DIOT, Annick ESNARD, Frédéric ESNARD, Michèle FERRER, Francis GAUTHIER, Daniel GRIMBERT, Yves GRUEL, Gilles LALMANACH, Valérie LEBLOND, Fabien LECAILLE, Caroline MAJORAL, Sylvain MARCHAND-ADAM, Emmanuelle MERCIER, Thierry MOREAU, Chantal VALAT, Marie-Louise ZANI. Et particulièrement mes co-thésards et collègues ATER avec qui j ai passé de très bons moments au labo, au Ptit Bota, au squash et ailleurs! Kévin BARANGER, Guillaume GAUD, Alexandre GAUTHIER, Florian VEILLARD et aussi Mireille AINCIBURU, Benjamin BRILLET, Sandrine CASTELLA, Gwenhael JEGOT, Timofey KALUPOV, Valentine PANEL, Hélène SERRANO. Ainsi que les nouveaux et les anciens que j oublie sûrement Pour finir un grand merci à mes parents, mes frères, mes grands-parents et toute ma famille, mes amis et bien sûr Nico pour leur présence et leur soutien inconditionnel... Merci à tous!

8 RÉSUMÉ Le but de cette étude a été d évaluer l intérêt de l aérosolthérapie d anticorps monoclonaux (AcM) dans le traitement du cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules (CBNPC) à travers l exemple du cetuximab, un AcM anti-egfr. L expression du récepteur FcRn, élément essentiel dans la pharmacocinétique et la biodistribution des IgGs thérapeutiques a également été étudiée dans le CBNPC. Nos résultats démontrent que l AcM peut résister aux contraintes physiques de la nébulisation. Les données de biodistribution et pharmacocinétique, obtenues dans le modèle animal mis en place, indiquent que suite à une administration pulmonaire, l Ac s accumule de façon précoce et prolongée au niveau pulmonaire chez l animal et qu il passe lentement et faiblement dans le compartiment sanguin. De plus, les tumeurs chez la souris paraissent sensibles à l aérosolthérapie avec du cetuximab. L analyse au niveau transcriptionnel et protéique du récepteur FcRn chez des patients atteints d un CBNPC a révélé que le récepteur est moins exprimé, au niveau transcriptionnel, dans le tissu tumoral que dans le tissu sain adjacent à la tumeur. Cette altération de l expression pourrait être consécutive à l hyperméthylation du promoteur de ce gène. Mots-clés : cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules, aérosolthérapie, anticorps thérapeutiques, récepteur FcRn.

9 ABSTRACT The project aims at determining whether aerosoltherapy is well suited for monoclonal antibodies (Mab), in Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC). In addition, exploration of the expression of FcRn, an IgG receptor contributing to increased half-life and biodistribution of Mab, has been studied in NSCLC. Using cetuximab, an anti-egfr Mab as a model, we showed that Mab resist the physical constraints of nebulization. Biodistribution and pharmacokinetic analyses, using a murine model that we established, revealed that cetuximab is highly and durably accumulated within the lungs and is slowly and weakly released into the bloodstream following airways delivery. Moreover, animal tumors seem sensitive to cetuximab aerosoltherapy. Altogether, our findings highlight the interest of Mab aerosoltherapy for NSCLC treatment. Expression analysis of FcRn at both the transcript and protein levels showed that the receptor is downregulated in NSCLC. FcRn alteration of expression in the tumor might be due to hypermethylation of the gene promoter as often found in cancer. Keywords : non small cell lung cancer, aerosoltherapy, therapeutic antibody, FcRn receptor.

10 ABRÉVIATIONS Ac : anticorps ADN : acide désoxynucléique ADNg : ADN génomique AMM : autorisation de mise sur le marché ARN : acide désoxyribonucléique ARNm : ARN messager ASC : aire sous la courbe BSA : bovine serum albumin β2m : β2-microglobuline CBNPC : cancer bronchique non à petites cellules CBPC : cancer bronchique à petites cellules CMH : complexe majeur d histocompatibilité CV : coefficient de variation Ct : threshold cycle DAB : diaminobenzydine DAMM : diamètre aérodynamique médian en masse dntp : désoxyribonucléoside triphosphate DPI : dry powder inhaler EDTA : acide éthylène-diamine-tétraacétique EGF : epidermal growth factor EGFR : epidermal growth factor receptor ELISA : enzyme linked immunosorbent assay FcRn : neonatal Fc receptor FITC : fluoresceine isothiocyanate HRP : horseradish peroxydase i.p. : intrapéritonéale i.v. : intraveineuse Ig : immunoglobuline

11 kb : kilobase kda : kilodalton MDI : metered dose inhaler PBS : tampon phosphate de sodium PCR : polymerase chain reaction PVDF : polyvinylidene fluoride Q-PCR : PCR quantitative RT : transcription reverse rpm : révolutions par minute SDS : sodium dodécyl sulfate SDS-PAGE : sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Tc 99m : Technetium 99m TKI : tyrosine kinase inhibitor TMA : tissue micro-arrays TNM : tumor node metastasis Tris : tri-(hydroxylméthyl)-amino-méthane U : unité VEGF : vascular endothelial growth factor

12 TABLE DES MATIÈRES Liste des Figures...12 Liste des Tableaux...14 Listes des Annexes...15 AVANT-PROPOS...16 REVUE BIBLIOGRAPHIQUE...19 Chapitre I : le cancer broncho-pulmonaire...20 I - Rappel : anatomie des voies respiratoires...20 I.1 - Anatomie du poumon normal...20 I.2 - Les voies respiratoires...20 II - Epidémiologie et étiologie du cancer broncho-pulmonaire...24 III - Le cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules...26 IV- Carcinogenèse bronchique...27 V- Traitements actuels du cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules...31 V.1 - Thérapies conventionnelles...31 V.2 - Thérapie ciblée...32 Chapitre II : l aérosolthérapie...34 I - Principe de l aérosolthérapie...34 II - Avantages de l aérosolthérapie...35 III - Problématiques de l aérosolthérapie...35 III.1 - Stabilité du médicament...35 III.2 - Dépôt du médicament...36 III.3 - Tolérance et efficacité du médicament...37 IV- Aérosolthérapie et pathologies pulmonaires...38 IV.1 - Généralités...38 IV.2 - Aérosolthérapie et cancer...39 Chapitre III : les anticorps thérapeutiques...42 I - Généralités...42 I.1 - Structure des anticorps...42 I.1a - Les anticorps «naturels»...42 I.1b - Les anticorps à visée thérapeutique...43 I.2 - Pharmacologie des Ac thérapeutiques et de leurs dérivés...47 I.2a - Pharmacodynamie des anticorps thérapeutiques...47 I.2a α - Mécanisme Fab dépendant : Fixation directe et neutralisation...47 I.2a β - Mécanisme Fc dépendant...48 I.2a γ - Pharmacodynamie des anticorps conjugués...49 I.2b - Pharmacocinétique des anticorps thérapeutiques...49 II - Les anticorps thérapeutiques anticancéreux...53 II.1 - Les anticorps approuvés aujourd hui en oncologie...53

13 II.2 - Les anticorps ciblant l EGFR...54 III - Le cetuximab (C225 ou Erbitux )...56 III.1 Rappel : la voie de signalisation de l EGFR...56 III.1a - Structure du récepteur...56 III.1b - Voies de signalisation de l EGFR...57 III.1c - EGFR et cancer...57 III.2 - Liaison du cetuximab à l EGFR...58 III.3 - Mode d action du cetuximab...60 III.3a - Arrêt du cycle cellulaire...60 III.3b - Effet anti-angiogénique, effet anti-métastatique...60 III.3c - Effet anti-apoptotique...60 III.4 - Indications du cetuximab et études cliniques...61 III.4a - Indications du cetuximab...61 III.4b - Toxicité et effets secondaires...61 III.4c - Facteurs prédictifs de réponse au cetuximab...61 III.4d - Etudes cliniques...62 Chapitre IV : le récepteur FcRn...64 I - Structure et présentation générale...64 I.1 - Structure du récepteur FcRn...64 I.2 - Localisation chromosomique et organisation génique des gènes FCGRT et β2m...65 I.3 - Liaison au domaine Fc des IgGs...67 I.4 - Homologie de séquence inter-espèces...67 II - Expression tissulaire et fonctions...67 II.1- Profil d expression du récepteur FcRn...67 II.2 - Rôles du récepteur FcRn...68 PARTIE I : PROPRIETES AERODYNAMIQUES, IMMUNOLOGIQUES ET PHARMACOLOGIQUES DU CETUXIMAB APRES AEROSOLISATION...70 I -Etude des propriétés aérodynamiques du cetuximab nébulisé...73 II -Etude in vitro des propriétés immunologiques et pharmacologiques du cetuximab nébulisé...74 III -Résultats et discussion...75 PARTIE II : BIODISTRIBUTION, PHARMACOCINETIQUE ET EFFICACITE DU CETUXIMAB ADMINISTRE PAR AEROSOL DANS UN MODELE ANIMAL DE TUMEUR BRONCHO-PULMONAIRE...86 Matériels et Méthodes...88 I - Etudes in vitro - Validation de l aérosolisation du cetuximab...90 I.1 - Préparation du cetuximab...90 I.1a - Concentration du cetuximab...90 I.1b - Nébulisation du cetuximab...90 I.2 - Culture cellulaire...91 I.3 - Cytométrie en flux...91 I.4 - Prolifération cellulaire...91 I.5 - Western-blot...91 II - Etudes in vivo...92 II.1- Protocoles...92 II.1a - Ethique...92 II.1b - Souris...92

14 II.1c - Sacrifices / euthanasie...92 II.2- Technique d aérosolisation...93 II.3 - Toxicité du cetuximab administré par aérosol chez la souris...93 II.3a - Traitement des souris...93 II.3b - Suivi des souris, analyses hématologique et histologiques post-mortem...94 II.4 - Mise en place d un modèle animal de tumeur broncho-pulmonaire ectopique sensible au cetuximab.96 II.4a - Préparations cellulaires...96 II.4b - Administrations intrabronchiques...96 II.4c - Suivi de la croissance tumorale...97 II.4c α - Tomodensitométrie thoracique...97 II.4c β - Analyse histologique...97 II.4d - Sensibilité du modèle vis-à-vis du cetuximab...97 II.5 - Biodistribution du cetuximab administré par aérosol...98 II.5a - Marquage du cetuximab avec le Xenofluor II.5b - Analyse de l affinité du cetuximab-xenofluor-750 pour l EGFR...98 II.5c - Etude de la biodistribution du cetuximab par imagerie infrarouge...99 II.5c α - Principe de l imagerie infrarouge...99 II.5c β - Capacité du cetuximab-xenofluor750 à fixer les cellules A431 in vivo 100 II.5c γ - Biodistribution du cetuximab administré par différentes voie II.6 - Pharmacocinétique du cetuximab administré par aérosol II.6a - Administration du cetuximab-xenofluor II.6b - Prélèvements sanguins.101 II.6c - Dosage du cetuximab II.6c α - Principe et procédure..102 II.6c β - Validation du dosage II.6d - Analyse pharmacocinétique.103 II.7- Efficacité du cetuximab administré par aérosol III Statistiques Résultats I - Validation de l aérosolisation du cetuximab par le Microsprayer TM I.1 - Validation de l aérosolisation du cetuximab par le Microsprayer TM in vitro I.1a - Effet de la nébulisation par le Microsprayer TM et de la concentration sur la solution de cetuximab I.1b - Reconnaissance et affinité pour l EGFR du cetuximab concentré ou aérosolisé par le Microsprayer TM I.1c - Inhibition de la prolifération cellulaire par le cetuximab concentré ou aérosolisé par le Microsprayer TM I.1d - Inhibition de la phosphorylation de l EGFR par le cetuximab aérosolisé par le Microsprayer TM..111 I.2 - Validation de l aérosolisation du cetuximab par le Microsprayer TM in vivo : efficacité du dépôt pulmonaire de cetuximab et étude de sa toxicité par administration pulmonaire chez la souris I.2a - Décès des animaux I.2a α Hémorragies liées au geste.113 I.2a β Décès sans explication après analyse histologique I.2b - Dépôts pulmonaires II.2c - Suivi des animaux et analyse histologique post-mortem II - Etablissement d un modèle animal de tumeur broncho-pulmonaire ectopique sensible au cetuximab II.1 - Mise en place du modèle animal II.2 - Homogénéisation des lots de souris en fonction de la taille des tumeurs II.3 - Sensibilité des tumeurs au cetuximab III - Biodistribution du cetuximab administré par aérosol III.1 - Validation du marquage du cetuximab avec le Xenofluor750 TM...125

15 III.2 - Etude de la biodistribution du cetuximab par imagerie infrarouge III.2a Administration par voie intraveineuse III.2b Administration par voie inhalée III.2c Administration par voie intrapéritonéale IV - Pharmacocinétique du cetuximab administré par aérosol V- Efficacité du cetuximab administré par aérosol Discussion PARTIE III : EXPRESSION DU RECEPTEUR FCRN DANS LE CANCER BRONCHO-PULMONAIRE NON A PETITES CELLULES Matériels et Méthodes I - Matériel biologique I.1 - Prélèvements tissulaires I.2 - Lignées cellulaires II - Analyse des transcrits de la chaîne α du récepteur FcRn et de la β2-microglobuline II.1 - Préparation des ARN II.2 - Transcription inverse II.3 - Réactions de PCR quantitatives en temps réel II.3 a - Principe II.3 b - Mode opératoire II.3 c - Etablissement des courbes d étalonnage II.3 d - Contrôles de la spécificité de l amplification III - Analyse de l expression protéique de la chaîne α du récepteur FcRn III.1 - Préparation des échantillons III.2 - Localisation de l expression de la protéine FcRn α par immunohistochimie IV - Etude de la méthylation du gène FCGRT IV.1 - Détermination des sites CpG IV.2 - Préparation des ADN génomiques IV.3 - Traitement des ADNg au bisulfite de sodium IV.4 - Methylated Specific PCR ou MSP V - Analyse statistiques V.1 - Analyses non paramétriques V.2 - Analyse de la survie globale des patients Résultats I - Analyse des transcrits de la chaîne α du récepteur FcRn et de la β2-microglobuline I.1 - Validation de la méthode I.1 a - Normalisation des résultats I.1 b - Spécificité des dosages I.1 c - Linéarités des dosages I.1 d - Reproductibilité des dosages I.2 - Analyse quantitative de l expression de FcRn α et de la β2-microglobuline I.2 a - Analyse comparative des expressions dans les tissus tumoraux et non tumoraux I.2a α - Analyse statistique des différences d expression I.2a β - Analyse des différences d expression en fonction des paramètres physiopathologiques I.2a γ - Analyse de la survie globale des patients I.2b - Analyse comparative des expressions dans les lignées cellulaires II - Analyse de l expression protéique de la chaîne α du récepteur FcRn dans les tissus tumoraux et non tumoraux II.1 - Validation de la méthode...180

16 II.2 - Expression dans les tissus tumoraux et non tumoraux III- Etude de la méthylation du gène FCGRT III.1 - Détermination de la présence d ilots CpG dans la séquence génique FCGRT III.2 - Méthylation des ilots CpG Discussion DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ANNEXE TRAVAUX PERSONNELS

17 FIGURES Figure 1 : Division des voies aériennes inférieures, selon le modèle de poumon de Weibel (Patton et al. 2007) Figure 2 : Représentation schématique du revêtement épithélial tapissant les voies respiratoires intrapulmonaires, d après Huchon, Figure 3 : Eléments constitutifs de la muqueuse et de la sous-muqueuse bronchiques d après A. Godwin (Cornell University Medical College) Figure 4 : Carcinogénèse bronchique, d après Hirsch et al., Figure 5 : Voie de signalisation de l EGFR et facteurs impliqués dans la carcinogenèse bronchique, d après Uramoto et al., Figure 6 : Différents mécanismes de régulation épigénétique, d après Sawan et al., Figure 7 : Répression d un gène par des mécanismes épigénétiques au cours de la carcinogénèse, d après Vaissière et al., Figure 8 : Dépôt des particules dans le tractus pulmonaire selon leur DAMM, d après Dautzenberg et al., Figure 9 : Structure de base d une immunoglobuline (Ig) : deux chaînes légères identiques et deux chaînes lourdes identiques reliées par des ponts disulfures (en rouge) Figure 10 : Structure des anticorps thérapeutiques d après Carter, Figure 11 : Les différents formats d anticorps, d après Baty et al Figure 12 : Mécanismes d action des anticorps thérapeutiques, d après Congy-Jolivet et al, Figure 13 : Les récepteurs à tyrosines kinases de la famille HER et leurs principales voies de signalisation, d après Ciardiello et al., Figure 14 : Transduction du signal après activation de l EGFR d après Nyati et al., Figure 15 : Modélisation de la fixation du ligand sur le récepteur à l EGF, d après Li, Figure 16 : Propriétés anti-tumorales du cetuximab, d après 59 Figure 17 : Structure schématique et cristallographique du récepteur FcRn, d après Raghavan et al Figure 18 : Représentation schématique de la structure du gène FCGRT codant la chaîne α du récepteur FcRn, selon Simister et al., 1996 ; Zhu et al., 2001 ; Sachs et al., 2006 (A) et Mikulska et al., 2000 (B) Figure 19 : Représentation schématique de la structure du gène codant la β2 microglobuline Figure 20 : Le récepteur FcRn permet le transfert périnatal des IgGs d après Roopenian et al., Figure 21 : Rôle du FcRn dans le transport et le recyclage des IgGs à travers les cellules endothéliales, d après Ternant et al., Figure 22 : Principe de fonctionnement d un impacteur en cascade, d après Dautzenberg et al., Figure 23 : Exemple de montage utilisant un impinger Figure 24 : Photographie du Microsprayer TM IA-1Clong et de son utilisation pour une administration endotrachéale chez la souris Figure 25 : Image radiologique du positionnement du cathéter avant injection intrabronchique de cellules A431 chez une souris BALB/c Nude Figure 26 : Image scintigraphique du dépôt des cellules A431 additionnées de Tc 99m chez une souris BALB/c Nude Figure 27 : Différentes méthodes pour administrer un aérosol chez le petit rongeur, d après Sakagami Figure 28 : Reconnaissance de l EGFR par le cetuximab après nébulisation Figure 29 : Effet du cetuximab nébulisé sur la croissance des cellules A Figure 30 : Inhibition de la phosphorylation de l EGFR par le cetuximab après nébulisation

18 Figure 31 : Imagerie scintigraphique d un dépôt d aérosol dans les voies respiratoires d une souris BALB/c après administration avec le Microsprayer TM de cetuximab en présence d un traceur radioactif (Tc 99m ) Figure 32 : Histologie de différents organes d une souris BALB/c traitée avec 2 mg de cetuximab par aérosol une fois par semaine pendant 5 semaines Figure 33 : Variation de poids et hémogramme des souris après cinq semaines de traitement au cetuximab par voie pulmonaire Figure 34 : Histologie des tumeurs pulmonaires ou trachéales retrouvées chez les souris après une induction intrabronchique de cellules A Figure 35 : Tomodensitométrie thoracique d une souris BALB/c Nude porteuse de tumeur bronchopulmonaire de cellules A Figure 36 : Tomodensitométrie thoracique (avant et après traitement au cetuximab) et analyse histologique post-mortem des poumons d une souris porteuse de tumeur broncho-pulmonaire avant le traitement Figure 37 : Etude de l affinité du cetuximab-xenofluor750 TM et du cetuximab natif pour l EGFR par cytométrie en flux avec des cellules A Figure 38 : Fixation du cetuximab-xenofluor750 TM sur une tumeur de cellules A431 implantées en sous-cutanée chez la souris BALB/c Nude Figure 39 : Biodistribution du cetuximab-xenofluor750 TM administré par différentes voies chez la souris BALB/c Nude porteuse de tumeur broncho-pulmonaire Figure 40 : Immunodétection du cetuximab dans des extraits protéiques pulmonaires de souris ayant reçu l anticorps par différentes voies Figure 41 : Imagerie infrarouge ex vivo des poumons d une souris BALB/c Nude porteuse de tumeur broncho-pulmonaire 48 heures après avoir reçu du cetuximab-xenofluor750 TM par voie aérosol Figure 42 : Concentrations sériques moyennes et biodistribution par imagerie optique proche infrarouge de cetuximab-xénofluor750 TM durant les 336 heures suivant l administration par différentes voies chez la souris BALB/c Nude porteuse de tumeur pulmonaires A Figure 43 : Effet du cetuximab administré par aérosol sur des tumeurs A431 implantées en intrabronchique chez la souris BALB/c Nude Figure 44: Principe de la PCR en temps réel utilisant le SYBR Green Figure.45: Représentation schématique des constructions plasmidiques pcr2.1-fcrn α et pgem-t Easy - β2m, d après M. Ohresser Figure 46 : Principe de conversion d un résidu cytosine non méthylé en un résidu uracile après traitement au bisulfite de sodium, d après Clark et al., Figure 47 : Courbe de fusion obtenue lors de la quantification de transcrits FcRn α par PCR en temps réel Figure 48 : Courbes étalons établies lors de la quantification de transcrits FcRn α par PCR en temps réel Figure 49 : Droite d étalonnage établie lors de la quantification de transcrits FcRn α par PCR en temps réel Figure. 50: Quantification des transcrits FcRn α et β2-microglobuline dans les tissus pulmonaires non tumoraux et tumoraux Figure 51 : Comparaison des courbes de survie des patients présentant un cancer broncho-pulmonaire et une expression de FcRn α dans les tissus non tumoraux et tumoraux inférieure ou supérieure à la médiane, selon la méthode de Kaplan-Meier Figure 52 : Immunodétection de la protéine FcRn α dans les cellules MDCKII et MDCKII clone Figure 53 : Immunodétection de FcRn α sur des tissus broncho-pulmonaires normaux Figure 54 : Immunohistochimie de FcRn α dans des tissus pulmonaires non tumoraux et tumoraux de type carcinome épidermoide ou adénocarcinome Figure 55 : Immunohistochimie sur tissu micro-arrays de tumeur broncho-pulmonaire Figure 56 Représentation graphique de la séquence génomique de 19.9 kb du gène FCGRT Figure 57 : Mise au point de la MSP avec des amorces spécifiques des îlots CpG 1, 2 et 4 détectés dans la séquence FCGRT Figure 58 : Analyse de la méthylation du promoteur du gène FCGRT de patients atteints de CBNPC par la méthode de la MSP

19 TABLEAUX Tableau 1 : Classification TNM d après Spira et al., Tableau 2 : Traitements du cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules en fonction du stade d extension tumorale, d après Lemarié et al., Tableau 3 : Mode de dépôt des particules dans l arbre respiratoire selon leur taille Tableau 4 : Caractéristiques des isotypes d immunoglobulines humaines, d après Lobo et al Tableau 5 : Anticorps anticancéreux actuellement disponibles sur le marché, modifié d après Magdelaine-Beuzelin et al., Tableau 6 : Les anticorps anti-egfr approuvés ou en développement, d après Roberts et al, Tableau 7 : Essais cliniques pour le traitement du CBNPC, association du cetuximab à une chimiothérapie, d après Morgensztern, Tableau 8 : Répartition des dépôts d aérosol dans les voies respiratoires des souris BALB/c après administration par le MicrosprayerTM de PBS ou cetuximab en présence de Tc99m Tableau 9 : Formation de foyers tumoraux pulmonaires 6 ou 8 semaines après l implantation intrabronchique de cellules A431 seules ou avec des adjuvants chez la souris BALB/c Nude Tableau 10 : Formation de foyers tumoraux pulmonaires 6 ou 8 semaines après l implantation intrabronchique de cellules A431 additionnées d EDTA à 10 mm chez la souris BALB/c Nude Tableau 11 : Comparaison des paramètres pharmacocinétiques du cetuximab-xénofluor750 TM administré par aérosol et par voie intraveineuse chez la souris BALB/c Nude porteuse de tumeur A431 broncho-pulmonaire Tableau 12 Description des caractéristiques physiopathologiques de la cohorte de patients atteints de cancer broncho-pulmonaire Tableau 13: Séquences des différentes amorces oligonucléotidiques spécifiques des gènes codant pour FcRn α, β2-microglobuline ou la sous unité ribosomale 18S utilisées dans les réactions de PCR conventionnelles et de PCR en temps réel Tableau 14: Conditions des réactions de PCR quantitatives en temps réel pour l amplification des gènes codant pour FcRn α, β2-microglobuline ou la sous unité ribosomale 18S Tableau 15: Séquences et températures d hybridation des différentes amorces oligonucléotidiques spécifiques des îlots CpG de la séquence FCGRT utilisées dans les réactions de PCR conventionnelles Tableau 16 : Contrôle de la reproductibilité inter-essai sur les valeurs standards de la gamme d étalonnage FcRn α Tableau 17. : Reproductibilité inter-essai sur les standards des gammes d étalonnage β2m et 18S Tableau 18: Relation entre l expression du gène codant FcRn α dans les tissus broncho-pulmonaires non tumoraux et tumoraux et différentes variables physiopathologiques Tableau 19 : Quantification des transcrits de FcRn α dans les lignées cancéreuses pulmonaires et les lignées de cellules épithéliales bronchiques immortalisées par PCR en temps réel

20 ANNEXE Annexe 1 : Fonctionnements des appareils de nébulisation, selon Dautzenberg et al.,

21 Avant-propos

22 Avant-propos Le cancer du poumon est aujourd hui la première cause de mortalité par cancer en France avec morts par an et, représente un réel problème de santé publique. Au niveau mondial, on estime qu il est responsable d environ décès annuellement, soit 18% des décès par cancer (Hill et al., 2008). Malgré la découverte de nouvelles molécules thérapeutiques, le gain sur la survie est modeste et les progrès des traitements systémiques restent lents. L aérosolthérapie dans le traitement du cancer broncho-pulmonaire représente une alternative très attractive et reste pourtant à ce jour très peu explorée. La voie pulmonaire pourrait, en effet, renforcer l efficacité thérapeutique du traitement en augmentant la concentration locale du médicament tout en limitant les effets systémiques indésirables et la dégradation au niveau hépatique et/ou rénal de la molécule. Une stratégie de traitement en plein essor dans le traitement des cancers, l immunothérapie passive, passe par l utilisation d anticorps monoclonaux recombinants et montre des résultats très satisfaisants (Glennie et al., 2003). Actuellement, la voie d administration privilégiée pour les anticorps thérapeutiques est la voie systémique. L objectif principal de ma thèse était d évaluer l intérêt de l aérosolthérapie d anticorps monoclonaux recombinants pour le traitement du cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules (CBNPC). Dans cette étude, le cetuximab (Erbitux ), une IgG1 chimérique ciblant l EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), a été choisi comme modèle. Plusieurs éléments ont conduit à ce choix : - L EGFR est sur-exprimé dans 40 à 80% des CBNPC (Mao, 2001). - L EGFR est situé à la surface des cellules tumorales et représente donc une cible moléculaire de choix. - Le cetuximab est disponible commercialement puisqu il a reçu une autorisation de mise sur le marché (AMM) dans le traitement du cancer colorectal métastatique et du cancer des voies aéro-digestives supérieures. - Le cetuximab est actuellement en étude de phase III pour le traitement du CBNPC en administration intraveineuse (Hanna et al., 2006). Par ailleurs, le récepteur FcRn exprimé au niveau de l épithélium bronchique et par les macrophages alvéolaires a été décrit comme intervenant spécifiquement dans le transport intracellulaire et la protection des IgGs. De récentes études ont démontré qu il jouait un rôle majeur dans la biodisponibilité de protéines de haut poids moléculaire conjuguées au domaine 17

23 Avant-propos Fc des immunoglobulines. En effet, en les excluant des voies endocytiques qui mènent à leur catabolisme, il augmente leur demi-vie sérique et joue alors un rôle essentiel dans leur pharmacocinétique (Bitonti et al., 2004 ; Low et al., 2005 ; Dumont et al., 2006). Le récepteur FcRn pourrait donc être un facteur important dans la pharmacocinétique des anticorps thérapeutiques administrés par voie pulmonaire et in fine dans la réponse à ce type de traitement. Le second objectif de mon travail de thèse était d étudier l expression du récepteur FcRn dans le cancer broncho-pulmonaire afin d estimer son rôle dans la biodistribution et la pharmacocinétique des IgGs thérapeutiques anti-tumorales au niveau pulmonaire. 18

24 Revue bibliographique

25 Revue bibliographique CHAPITRE I : LE CANCER BRONCHO-PULMONAIRE I- Rappel : anatomie des voies respiratoires. L appareil respiratoire a une situation unique dans l organisme car il est en communication directe et constante avec l environnement extérieur. Il exerce de multiples fonctions : une fonction respiratoire via les échanges gazeux et de nombreuses fonctions non respiratoires (régulation du métabolisme acido-basique, filtration de toxines, etc ). Il possède un ensemble complexe d éléments cellulaires et de terminaisons nerveuses contribuant à le protéger des agressions extérieures par clairance des particules inhalées, sécrétions de mucus et de surfactant, et un système de défenses immunitaires. I.1- Anatomie du poumon normal. Chaque poumon a une face externe convexe plaquée sur la paroi thoracique, une face interne concave faisant face au médiastin, une face basale reposant sur le diaphragme et un sommet ou apex situé à la base du cou. Les poumons sont des organes spongieux ayant une forme pyramidale. Ils sont entourés par la plèvre, sont dissymétriques et se divisent en lobes et en segments. Le poumon droit est formé de trois lobes (supérieur, moyen et inférieur) subdivisés en dix segments et le poumon gauche de deux lobes (supérieur et inférieur) subdivisés en dix segments également. I.2- Les voies respiratoires. L air respiré pénètre par les voies aériennes supérieures c est-à-dire les fosses nasales ou la bouche, puis le pharynx et le larynx avant d atteindre les voies respiratoires inférieures. 20

26 Revue bibliographique Les voies respiratoires inférieures se divisent en trois compartiments (Figure 1) : - les voies de conduction qui vont de la trachée aux bronchioles terminales, - la zone transitionnelle qui correspond aux bronchioles respiratoires, - une zone respiratoire d échange gazeux qui correspond aux territoires alvéolaires comprenant eux-mêmes les canaux et les sacs alvéolaires. Figure 1 : Division des voies aériennes inférieures, selon le modèle de poumon de Weibel (Patton et al., 2007). L aspect morphologique des voies de conduction respiratoires est similaire de la trachée aux petites bronches intra-lobulaires. Seule la composition de leur paroi varie parallèlement à la diminution du calibre. Les parois bronchiques sont tapissées par un épithélium de revêtement cylindrique. Celui-ci repose, par l intermédiaire d une membrane basale continue, sur un chorion formé de tissu conjonctif, de tissu élastique et de muscle lisse. Le chorion est parcouru par des vaisseaux sanguins, lymphatiques et des structures nerveuses. 21

27 Revue bibliographique La composition de l épithélium de revêtement reste identique de la trachée aux bronchioles terminales. Cependant son épaisseur et la proportion des différents types cellulaires varient. Cet épithélium comprend cinq types principaux de cellules (Figure 2) : - les cellules ciliées : environ un tiers des cellules épithéliales dans les grosses bronches. Leur rôle prinicpal est la propulsion du film muqueux et des particules inhalées en direction du larynx. - les cellules basales : représentent moins de 10% des cellules épithéliales dans les grosses bronches. Elles contiennent des filaments de kératine et possèdent des desmosomes. Elles feraient partie des cellules souches permettant le renouvellement de l épithélium à l état physiologique ou après différentes agressions. - les cellules à mucus : environ 10% des cellules épithéliales dans les grosses bronches. Elles contiennent des vacuoles de mucus et leur nombre peut augmenter rapidement dans certaines conditions pathologiques. - les cellules neuroendocrines : environ 1% des cellules épithéliales. Leur rôle exact n est pas bien défini, elles pourraient intervenir dans la réponse inflammatoire. - les cellules de Clara : présentes seulement au niveau des bronchioles. Elles interviennent notamment dans la protection des voies respiratoires et le renouvellement des cellules bronchiolaires et alvéolaires. Figure 2 : Représentation schématique du revêtement épithélial tapissant les voies respiratoires intra-pulmonaires, d après Huchon, CC : cellule ciliée, CM : cellule à mucus, CB, cellule basale, C CI : cellule de Clara, P1 : pneumocyte I, P2 : pneumocyte II. 1 : épithelium, 2 : membrane basale, 3 : sous-muqueuse. 22

28 Revue bibliographique Il existe d autres types cellulaires, plus rarement rencontrés dans l épithélium respiratoire, comme les cellules intermédiaires ou parabasale, les cellules séreuses ou encore les cellules cylindriques non ciliées. La sous-muqeuse dont l épaisseur diminue parallèlement au calibre de la bronche, est composée d un réseau de tissu conjonctif et élastique. Elle contient des glandes séromuqueuses qui s ouvrent dans la lumière bronchique par l intermédiaire d un canal excréteur tapissé par des cellules muqueuses puis ciliées : elles produisent plus de 90% du mucus bronchique. Plus en profondeur, siège le cartilage (Figure 3). Figure 3 : Eléments constitutifs de la muqueuse et de la sous-muqueuse bronchiques d après A. Godwin (Cornell University Medical College). Les alvéoles, siège des échanges gazeux entre l air et le sang circulant, sont tapissées par un épithélium simple. Celui-ci comporte deux types cellulaires : - les pneumocytes de type I (90% de la surface alvéolaire) indifférenciés, incapables de se diviser et très sensibles aux agressions. - les pneumocytes de type II sécrètent l hypophase du surfactant et sont capables de se diviser assurant ainsi la régénération du revêtement alvéolaire lors de dommages de l alvéole. Ces cellules sont reliées entre elles par des jonctions serrées leur conférant un rôle de barrière. Les capillaires alvéolaires forment le plus vaste réseau de capillaires de l organisme. Ils sont situés dans la paroi alvéolaire et sont de type continu non fenêtré. 23

29 Revue bibliographique II- Epidémiologie et étiologie du cancer broncho-pulmonaire. Malgré la découverte de nouvelles molécules thérapeutiques, le cancer du poumon reste à ce jour la première cause de mortalité par cancer en France avec décès par an. Au niveau mondial, on estime qu il est responsable d environ décès annuellement, soit 18% des décès par cancer. Depuis quelques années, une augmentation du nombre de femmes touchées par le cancer du poumon est observée malgré une diminution globale de la mortalité par cancer (Hill et al., 2008). En pratique, on distingue deux catégories de cancers broncho-pulmonaires : les cancers bronchiques à petites cellules (CBPC : 20% des cas) qui représentent la forme la plus agressive et les cancers bronchiques non à petites cellules qui restent les plus fréquents (CBNPC : 80% des cas). Le pronostic vital des cancers bronchiques est très faible avec moins de 15% de survivants à 5 ans et représente le plus bas pour les tumeurs solides. En effet, le diagnostic est souvent posé lorsque la maladie est à un stade avancé et les patients ne peuvent être traités chirurgicalement. L incidence du cancer du poumon est en très grande partie liée à la consommation de tabac et sa réduction passe d abord par une meilleure prévention du tabagisme. Le tabagisme actif, facteur de risque principal du cancer bronchique, est responsable de 90% des cas (Collins et al., 2007). La fumée du tabac contient de nombreux carcinogènes, le principal étant le benzo-a-pyrène. Le rôle du tabagisme passif est également prouvé : il multiplie par trois le risque de cancer du poumon, mais n'est directement responsable que de 100 cancers par an en France. Outre le tabac, il existe des carcinogènes professionnels, environnementaux ou domestiques qui agissent le plus souvent en synergie avec le tabac. On peut citer l amiante, le radon, la silice, le chrome, l arsenic, le cadmium ou encore la pollution atmosphérique et l exposition professionnelle à la fumée de diesel (Lemarié, 2008). 24

30 Tableau 1 : Classification TNM d après Spira et al., Définition des catégories TNM (T : Tumor, N : Node, Metastasis) et classification en stades.

31 Revue bibliographique III- Le cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules. Les CBNPC regroupent les carcinomes épidermoïdes, les adénocarcinomes et les carcinomes à grandes cellules (Huchon, 2001 ; Collins et al., 2007). - Le carcinome épidermoïde est le plus fréquent (35-40%). Il est caractérisé par la présence de foyers de kératinisation et de jonctions intercellulaires. Il se développe sur les gros troncs bronchiques (bronches lobaires ou segmentaires), sous forme plus ou moins différenciée et mature. La formation de métastases est très répandue. - L adénocarcinome (25-35% des cas) est reconnu grâce à l observation de structures glandulaires tubulaires, acineuses ou papillaires. Il se développe le plus souvent en tumeur périphérique et peut se présenter sous forme d un nodule périphérique solitaire, d une atteinte multifocale ou une forme de progression rapide s étendant de lobe en lobe. La formation précoce de métastases est courante. Il est plus fréquent chez la femme et représente la forme histologique du non fumeur. Le carcinome bronchiolo-alvéolaire fait partie de ce groupe, il se présente sous la forme d'une masse périphérique ou d'une condensation pneumonique. Son évolution se fait de proche en proche par voie bronchique avec parfois hypersécrétion majeure. - Le carcinome à grandes cellules (10-15% des cas) apparaît souvent dans les bronches distales et se retrouve sous forme indifférenciée. Il est caractérisé par des cellules à cytoplasme large et à noyau atypique. Il regroupe les carcinomes à grandes cellules avec composante neuroendocrine, les carcinomes avec cellules géantes, les carcinomes à cellules fusiformes. Le TNM (Tumor Node Metastasis) est une classification de référence pour les CBNPC établie par l International Association for the Study of Lung Cancer (Tableau 1). Il est basé sur l examen clinique appuyé par les données d imagerie (ctnm) et sur les données chirurgicales et anatomopathologiques (ptnm). Il permet de décrire précisément l extension anatomique de la tumeur. La catégorie T (T = Tumor) représente la tumeur primitive. La catégorie N (N = Nodes) décrit l extension ganglionnaire régionale. Les initiales T et N sont affectés d un indice progressivement croissant avec l extension tumorale. La catégorie M (M = Metastasis) traduit l absence ou la présence de métastases à distance. Le TNM est utilisé pour établir une classification en stades basée sur le degré d évolution de la tumeur (stade 0 à IV) (Spira et al., 2004). 26

32 Revue bibliographique IV- Carcinogenèse bronchique. La carcinogenèse est un processus multi-étape au cours duquel il existe une accumulation progressive d altérations génétiques, moléculaires et phénotypiques qui permettent l émergence finale du cancer. Pour le cancer épidermoïde, les modifications morphologiques de l épithélium bronchique sont décrites en plusieurs stades : l hyperplasie, la métaplasie (lésions bénignes) ; la dysplasie légère, modérée ou sévère, le carcinome in situ (lésions pré-cancéreuses) et enfin le carcinome invasif (lésions cancéreuses) (Jetten et al., 1989 ; Brambilla et al., 2001) (Figure 4). Cependant, une filiation longitudinale entre ces altérations n a jamais été démontrée et rien ne permet d affirmer que l apparition de métaplasie ou dysplasie aboutira forcément à la formation d un carcinome invasif. Epithélium normal Hyperplasie Dysplasie Carcinome in situ Carcinome invasif Figure 4 : Carcinogénèse bronchique, d après Hirsch et al., 2001 Diverses altérations génétiques sont rapportées dans la carcinogenèse bronchique, citons comme exemples : - l EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) ou erbb1 est surexprimé dans 60 à 80% des CBNPC (pour les carcinomes épidermoïdes dans près de 100% des cas). Sa surexpression est plus rare dans les CBPC (Mao, 2001 ; Herbst et al., 2008). Dans l épithélium bronchique normal, son expression est restreinte au niveau des cellules basales et elle s étend plus largement dans les tissus dysplasiques et métaplasiques (Hirsch et al., 2003). Cette surexpression est la plupart du temps liée à l amplification du gène en plusieurs copies, voire une multiplication du chromosome 7 portant le gène de l EGFR. Des mutations (ponctuelles faux sens ou délétions), activant constitutivement le domaine kinase intracellulaire du récepteur, ont également été décrites (Wistuba, et al., 2006) (Figure 5). La stimulation de ce récepteur entraîne un signal constitutif de prolifération cellulaire. Beaucoup 27

33 Revue bibliographique de tumeurs sécrètent également de l EGF, ligand naturel de l EGFR, réalisant ainsi une boucle autocrine. La surexpression de l EGFR est souvent une indication d agressivité de la tumeur et associée à un mauvais pronostic vital dans le CBNPC (Volm et al., 1998) (pour plus de détails sur la voie de signalisation de l EGFR voir chapitre III, paragraphe III-1). - Kras, un proto-oncogène, est muté dans 30% des adénocarcinomes bronchiques primitifs (Reynolds et al., 1991). Il en résulte une activation constitutive, non régulée des cascades de signalisation en aval des récepteurs membranaires aux facteurs de croissance. Cette mutation est associée à un mauvais pronostic vital. - p53, un anti-oncogène, est muté dans 60% des cancers broncho-pulmonaires. La protéine p53 est un facteur de transcription qui, sous sa forme sauvage, active les gènes régulant négativement le cycle cellulaire (p21 et Gadd45). Une forte corrélation a été démontrée entre la fréquence des mutations de p53 et la durée globale de l intoxication tabagique (Le Calvez et al., 2005). Dans les cancers bronchiques les mutations du gène p53 sont très précoces et induites par le benzo-a-pyrène. EGF EGFR Kras mutation Figure 5 : Voie de signalisation de l EGFR et facteurs impliqués dans la carcinogenèse bronchique, d après Uramoto et al.,

34 Revue bibliographique - Myc (proto-oncogène) et la cycline D1 (régulateur du cycle cellulaire) sont également sur-exprimés et mutés dans de nombreux cancers humains (Forgacs et al., 2001). Ces altérations entraînent une stimulation anarchique de la prolifération cellulaire. Parallèlement aux altérations génétiques, on retrouve dans l apparition du cancer des événements dits épigénétiques. Dans les cellules normales, les phénomènes épigénétiques, tels que la méthylation de l ADN, les modifications des histones, et l interférence ARN ont un rôle crucial dans le contrôle de l activité génique (Figure 6). Figure 6 : Différents mécanismes de régulation épigénétique, d après Sawan et al., La méthylation de l ADN est une modification covalente d un résidu cytosine (C) localisé en 5 d un résidu guanine (G) dans un dinucléotide CpG. Les modifications des histones sont des modifications post-traductionnelles de l extrémité N-terminale de groupement d histones (H3, H4, H2A, H2B). L interférence ARN est un mécanisme de répression de gène qui fait intervenir des microarn. 29

35 Revue bibliographique Dans la carcinogénèse, la méthylation de l ADN et les modifications des histones initient des processus qui peuvent résulter à une perte ou une activation de la transcription de gènes (Sato et al., 2003 ; Sawan et al., 2008). Dans de nombreux types de cancers, on retrouve des gènes suppresseurs de tumeurs rendus silencieux par méthylation de novo de leur promoteur, comme p16 ou RASSF1A dans la carcinogénèse bronchique (Singal et al., 1999 ; Mao, 2001 ; Esteller et al., 2008) (Figure 7). De plus, les résidus cytosines méthylés au sein d îlots CpG semblent être des cibles préférentielles du benzo-a-pyrène, puissant carcinogène retrouvé dans la fumée de cigarette, qui, en se fixant, fragilise ainsi l ADN (Yoon et al., 2001). Figure 7 : Répression d un gène par des mécanismes épigénétiques au cours de la carcinogénèse, d après Vaissière et al., Quand un gène est exprimé dans les tissus normaux, les îlots CpG contenus dans la séquence promotrice du gène ne sont généralement pas méthylés et les histones sont acétylés. Lors de la carcinogénèse, une déacétylation des histones et une méthylation progressive des îlots CpG peuvent être observées et accompagnées d une répression du gène. 30

36 Revue bibliographique V- Traitements actuels du cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules. Pour le traitement du CBNPC de nombreux facteurs sont à prendre en compte : l extension tumorale telle qu elle est définie par la classification TNM, la notion de résécabilité et d opérabilité, l état général du malade Le tableau 2 présente les standards thérapeutiques couramment utilisés aujourd hui dans le traitement du CBNPC en fonction des stades d extension tumorale. Rappelons que 60% des malades sont diagnostiqués tardivement, c est-à-dire aux stades IIIB ou IV. Stades Traitements IA T1N0M0 chirurgie seule IB T2N0M0 chirurgie +/- chimiothérapie si mauvais pronostic IIA T1N1M0 IIB T2N1M0 chirurgie + chimiothérapie chirurgie + chimiothérapie +/- radiothérapie pariétale IIB T3N0M0 IIIA T1N2M0 T2N2M0 T3N1M0 T3N2M0 IIIB TxN3M0 IV TxNxM1 chirurgie + chimiothérapie +/- radiothérapie médiastinale chimiothérapie +/- thérapie ciblée Tableau 2 : Traitements du cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules en fonction du stade d extension tumorale, d après Lemarié et al., V.1- Thérapies conventionnelles. Pour la chirurgie, l intervention de choix est la lobectomie dont les complications postopératoires sont moins importantes que pour la pneumonectomie (Collins et al., 2007 ; Lemarié, 2008). La chimiothérapie est généralement basée sur une administration de cisplatine et/ou de drogues de 3 ème génération (vinorelbine, paclitaxel, docetaxel et gemcitabine). En pré-opératoire, la chimiothérapie permet d'obtenir une réduction du volume tumoral, ce qui facilite ensuite le geste chirurgical (Betticher et al., 2005). La radiothérapie est destinée à visée palliative lors de la présence de métastases douloureuses comme les métastases osseuses (Jaseem et al., 2007). Lorsque la tumeur est de petite taille, une 31

37 Revue bibliographique radiothérapie directement au cœur de la tumeur, sans intervention chirurgicale, est maintenant réalisable, avec la curiethérapie endobronchique. V.2- Thérapies ciblées. Les nouvelles thérapeutiques ou thérapeutiques ciblées offrent des perspectives importantes pour le traitement du cancer broncho-pulmonaire. Ces médicaments agissent en bloquant les voies de signalisation qui permettent l extension de la tumeur (inhibition de l angiogenèse ou de la prolifération cellulaire par exemple). En France, le bevacizumab (anticorps monoclonal anti-vegf Vascular Endothelial Growth Factor) et l erlotinib (inhibiteur de tyrosine kinase ou TKI de l EGFR) ont aujourd hui obtenu une autorisation de mise sur le marché dans le traitement du CBNPC. Le bevacizumab associé en première ligne à des agents chimiothérapeutiques augmente le taux de réponse au traitement de 4 à 20% par rapport à la chimiothérapie seule et apporte un gain modeste sur la survie de 2 à 2,8 mois (Reck et al., 2008). Les patients traités par l erlotinib, après échec d une chimiothérapie en première ou seconde ligne de traitement, montrent un gain sur la survie par rapport aux patients ayant reçu un placebo (6,7 contre 4,7 mois) (Shepherd et al., 2005). Des études de phase III sont en cours en seconde ligne de traitement en association avec une chimiothérapie. Le gefintinib, autre TKI de l EGFR, a également été utilisé dans le traitement du CBNPC (de 2003 à 2007) avant d être retiré du marché suite à des résultats insuffisants de la molécule en terme de gain sur la survie (Thatcher et al., 2005). Cependant, ces thérapies peuvent générer des effets secondaires non négligeables pouvant mener à des événements thromboemboliques ou hémorragiques comme c est le cas pour le bevacizumab. Par ailleurs, la réponse à ces thérapies ciblées est fortement patientdépendante. En effet, il a été démontré que le gain sur la survie avec un traitement par un TKI était associé à une surexpression et/ou mutation de l EGFR (Eberhard et al., 2008) tandis qu une mutation de Kras entraîne une résistance à ces molécules (Pao, 2006). D autres facteurs indiquent une réponse potentiellement plus importante aux TKI, comme le type histologique (adénocarcinome), le sexe (femmes) et le statut tabagique (non fumeurs) (Shigematsu et al, 2005 ; Uramoto et al., 2007). Pour le bevacizumab, seul le niveau d ICAM 32

38 Revue bibliographique soluble (pour Intracellular Adhesion Molecule-1) est décrit à ce jour comme un marqueur prédictif de réponse (Stinchcombe et al., 2007). Ces données indiquent qu il est donc utile de sélectionner les patients potentiellement répondeurs en fonction des ces différents critères avant de commencer un traitement lourd pour le malade et très coûteux. En conclusion, malgré l apparition de ces nouvelles molécules et les traitements multimodaux, le taux de survie à 5 ans tous stades confondus pour le cancer du poumon demeure faible. Globalement, les progrès des traitements systémiques restent lents. Une des explications à la réponse médiocre des patients à ces divers traitements pourrait être l insuffisance de quantité de médicament retrouvé au niveau du site tumoral pulmonaire, après une administration systémique. Une alternative attractive et peu explorée pour le traitement du cancer broncho-pulmonaire consisterait en une administration par aérosol. En effet, cette voie pourrait renforcer l efficacité thérapeutique du médicament en augmentant sa concentration locale tout en diminuant les effets systémiques indésirables. 33

39 Revue bibliographique CHAPITRE II : L AÉROSOLTHÉRAPIE I- Principe de l aérosolthérapie. L aérosolthérapie est une modalité de traitement consistant à faire inhaler au patient un médicament, solide ou liquide, mis en suspension dans un milieu gazeux sous forme de fines particules (aérosol). Il existe différents types d appareil pour générer les particules d aérosol : les aérosols doseurs de liquide (MDI ou Metered Dose Inhaler), les aérosols doseurs de poudre (DPI ou Dry Powder Inhaler) et les nébuliseurs qui génèrent de fines gouttelettes de principe actif à partir d un médicament liquide (Coates, 2008). Le choix découle de la pathologie à traiter et de la nature du produit. Les MDI et DPI sont des dispositifs préchargés ne permettant pas d administrer toute sorte de médicaments contrairement aux nébuliseurs. Les appareils de nébulisation ou nébuliseurs comportent trois compartiments : un réservoir où est introduit le liquide à nébuliser, une chambre de nébulisation où est généré l aérosol et une source d énergie nécessaire pour créer l aérosol (Dautzenberg et al., 2006). Il existe trois types de nébuliseurs : - le nébuliseur pneumatique : une source de gaz (compresseur, oxygène ou air médical) envoie un débit de gaz dans le nébuliseur où le médicament est alors pulvérisé. Le nébuliseur pneumatique effectue un tri de particules pour ne produire que les plus fines. Les plus grosses particules sont recyclées pour être à nouveau nébulisées. - le nébuliseur ultrasonique qui transforme le médicament en aérosol grâce aux vibrations d'un quartz, il fonctionne avec ou sans interface d eau. - le nébuliseur à membrane qui produit un aérosol par passage d'une solution à travers une membrane perméable. 34

40 Revue bibliographique II- Avantages de l aérosolthérapie. L aérosolthérapie dans le traitement des pathologies pulmonaires est une voie de traitement qui permet d envisager un traitement loco-régional, ce qui présente en théorie plusieurs avantages par rapport à un traitement systémique : - cibler directement et rapidement l action du médicament au niveau du tractus pulmonaire (Patton et al., 2004). - éviter un captage hépatique et/ou rénal du médicament avant d atteindre sa cible. - réduire la dégradation de la molécule ; la quantité d enzymes métaboliques étant moins importante au niveau pulmonaire qu au niveau du foie ou du tractus gastrointestinal (Labiris et al., 2003 ; Patton et al., 2007). - limiter le dépôt du médicament dans d autres organes et sa dilution dans l organisme. Ainsi, la concentration et la période d exposition du médicament au niveau du site pulmonaire sont considérablement augmentés tandis que la dose de médicament diffusant dans le reste de l organisme est limitée ce qui réduit la toxicité systémique. III- Problématiques de l aérosolthérapie. Plusieurs problématiques, reposant à la fois sur les propriétés physico-chimiques et biochimiques des médicaments et la technologie utilisée pour générer l aérosol, doivent être considérés avant d utiliser cette modalité d administration chez les patients. III.1- Stabilité du médicament. La stabilité du médicament au cours du processus d aérosolisation peut être altérée. Les contraintes physiques imposées par l aérosolisation peuvent entraîner une agrégation et/ou une dénaturation de la molécule, s accompagnant d une réduction de son efficacité thérapeutique et d une augmentation de son immunogénécité (Schellekens, 2005). Citons comme exemple, le nébuliseur ultrasonique : les vibrations du quartz entraînent un réchauffement de la solution ce qui peut altérer l intégrité des médicaments thermosensibles. 35

41 Revue bibliographique III.2- Dépôt du médicament. Il est important de contrôler le dépôt du médicament inhalé dans le territoire pulmonaire. Le dépôt des particules nébulisées dans les voies respiratoires dépend de la taille des particules formées, celle-ci est désignée par le DAMM (Diamètre Aérodynamique Médian en Masse) ou MMAD (Mass Median Aerodynamic Diameter) (Figure 8). Le DAMM est calculé à partir de mesures granulométriques basées sur différentes méthodes, citons l impaction en cascade, la diffraction laser ou encore la vélocimétrie laser. Plus la taille des particules en suspension est petite, plus les particules diffusent profondément au niveau de l'arbre respiratoire. Ainsi les particules supérieures à 5µm seront en grande partie bloquées au niveau de la sphère ORL, entre 2 et 6µm elles se localiseront plutôt au niveau de l arbre trachéo-bronchique. Les particules de taille inférieure se déposeront plus facilement dans le poumon profond, c est-à-dire au niveau des bronchioles et des alvéoles. Cependant, il faut noter que les particules entre 0,1µm et 1µm pourront être exhalées diminuant ainsi le dépôt au niveau du poumon profond. La technique d aérosolisation doit donc être adaptée pour chaque médicament de façon à produire des particules pour un dépôt optimal dans le territoire pulmonaire ciblé. DAMM : > 5µm 2 à 6µm <0,5-3µm ORL Bronches Poumon profond Figure 8 : Dépôt des particules dans le tractus pulmonaire selon leur DAMM, d après Dautzenberg et al.,

42 Revue bibliographique Il existe trois mécanismes intervenant dans le dépôt d aérosol dans l arbre respiratoire : l impaction, la sédimentation et la diffusion. Ces mécanismes dépendent du diamètre des particules et de leur vitesse de déplacement. Le débit d air décroît progressivement à mesure que l on s achemine des voies aériennes supérieures vers les petites bronches et les alvéoles pulmonaires. Ainsi, au niveau de la sphère ORL, le dépôt des particules se fera par impaction et concernera les plus lourdes d entre elles. L impaction résulte de l incapacité, pour une particule emmenée dans le flux aérien, à éviter un obstacle, que ce soit une courbe ou une bifurcation. Ainsi, la vitesse décroissant, le dépôt se fera par sédimentation sous l action de la pesanteur, au sein des bronches et de la trachée et intéressera les gouttelettes de taille moyenne. Les plus petites gouttelettes, quant à elles, diffuseront dans les alvéoles en étant projetées contre les parois du fait des mouvements browniens du gaz. Taille des particules 5-30 µm 2-6 µm 3 µm ou moins Zone de dépôt Rhinopharynx Arbre trachéobronchique Bronchioles & alvéoles Mode de dépôt Impaction Sédimentation Diffusion Tableau 3 : Mode de dépôt des particules dans l arbre respiratoire selon leur taille. Le dépôt du médicament est également influencé par les modalités d inhalation de l aérosol, c est-à-dire la ventilation du patient. Il va donc falloir prendre en compte la respiration du patient (débit respiratoire, pauses ou non entre l inspiration et l expiration, etc ) et sa capacité respiratoire qui peut être diminuée par la pathologie elle-même. Une respiration lente et profonde va favoriser un dépôt dans les poumons des particules moyennes et de petites tailles. Par ailleurs, si le patient retient sa respiration lorsque l aérosol est dans les poumons, cela va favoriser le dépôt par sédimentation. III.3- Tolérance et efficacité du médicament. La tolérance (dose maximale tolérée), la toxicité spécifique (en particulier au niveau pulmonaire pour les patients mais aussi pour le personnel médical), l efficacité thérapeutique 37

43 Revue bibliographique et la pharmaco-cinétique du médicament inhalé doivent être étudiés car ces paramètres sont propres à chaque molécule et peuvent varier en fonction du mode d administration (Agu et al., 2001 ; Dautzenberg et al., 2006). IV- Aérosolthérapie et pathologies pulmonaires. IV.1- Généralités. Aujourd hui l aérosolthérapie est utilisée en routine hospitalière pour administrer directement vers l organe cible diverses molécules, comme des broncho-dilatateurs, des corticostéroïdes ou des antibiotiques, chez des patients atteints de pathologies pulmonaires inflammatoires et infectieuses (asthme, broncho-pneumopathie chronique obstructive, mucoviscidose...) (Lemarié, 2008). L inhalation est également exploitée dans le traitement des maladies systémiques, comme le diabète, car le poumon représente une voie d entrée idéale vers le compartiment sanguin et le reste de l organisme du fait de son importante surface d échange alvéolo-capillaire. L insuline a été la première molécule à visée systémique commercialisée sous forme d aérosol. Les résultats cliniques montrent une équivalence de la forme inhalée et de la voie sous cutanée (Bellary et al., 2006). Malgré ces résultats encourageants, les patients ayant pris l habitude de la forme injectable ne trouvaient pas d avantages à utiliser ce mode d administration. Ceci, associé à l incertitude des risques à long terme de cette modalité d administration pour l insuline à visée systémique, ont conduit a retiré l insuline inhalée du marché. Ce premier échec de la forme aérosol à visée systémique doit être pris comme exemple mais ne doit pas être un frein au développement de nouvelles thérapeutiques administrées par voie inhalée (Heuzé-Vourc h et al., 2008). En effet, l aérosolthérapie a depuis longtemps fait ses preuves dans les traitements loco-régionaux de diverses pathologies pulmonaires (asthme, broncho-pneumopathie chronique obstructive...). Avant de développer un traitement avec cette modalité d administration, il est donc important de prendre en compte la pathologie à traiter, le site d action du médicament (traitement locorégional ou à visée systémique) et l impact de l accumulation du médicament dans le tractus pulmonaire. 38

44 Revue bibliographique IV.2- Aérosolthérapie et cancer. En ce qui concerne les tumeurs pulmonaires, l aérosolthérapie est particulièrement attrayante pour le traitement de patients présentant un cancer primitif du poumon sans obstruction bronchique, comme c est le cas des carcinomes bronchiolo-alvéolaires et parfois des carcinomes épidermoïdes ou des adénocarcinomes, ou des patients présentant des métastases pulmonaires. Depuis plusieurs décennies, des études ont testé la stabilité de divers médicaments anti-cancéreux, en majorité des molécules de petite taille. Elles ont démontré que ces médicaments pouvaient être aérosolisés quelles que soient leur structure tridimensionnelle, sans perte d activité anti-tumorale et générer des gouttelettes ayant un diamètre aérodynamique compris entre 1 et 5 µm, ce qui est compatible avec un dépôt au niveau des bronches proximales et périphériques (Gagnadoux et al., 2008). Le 5-fluorouracyle (5-FU) a été le premier agent chimio-thérapeutique administré par inhalation chez des patients atteints d un cancer primitif du poumon (Tatsumura et al., 1993). Les résultats ont montré que le 5-FU inhalé était bien toléré par les patients, était assimilé par le poumon et se concentrait au niveau de la zone tumorale. De plus, une réponse thérapeutique a été observée chez 60% des patients. Des essais de phase II sont en cours. Depuis, plusieurs essais de phase I ont été mis en place ou sont en cours de réalisation, chez des patients présentant un cancer primaire ou métastatique au poumon, avec d autres molécules : la 9- nitrocamptothécine (Verschraegen et al., 2004) et le cisplatine encapsulés dans des liposomes (Wittgen et al., 2007), la doxorubicine (Otterson et al., 2007) et la gemcitabine (Gagnadoux et al., 2007). Globalement, les données indiquent que ce type d aérosolthérapie est relativement bien supportée, que les médicaments présentent une bonne biodisponibilité au niveau pulmonaire (s accumulent dans les voies aériennes et le poumon), et quelques réponses thérapeutiques encourageantes ont été observées. Par ailleurs, une étude réalisée chez des patients présentant un cancer du rein avec des foyers métastasiques au niveau du poumon, a montré des résultats intéressants par immunothérapie d interleukine-2 (IL-2) inhalée. L aérosolthérapie d IL-2 prévenait la progression des métastases pulmonaires chez 70% des patients et une régression d au moins 50% de la tumeur a été observée chez 10 à 20% des patients. L un des avantages majeur de cette modalité d administration de l IL-2 réside dans des effets secondaires négligeables comparativement à l IL-2 délivrée par voie intraveineuse qui entraîne une toxicité 39

45 Revue bibliographique considérable (Heuzé-Vourc h et al., 2008). Par conséquent, l administration par voie pulmonaire d agents anti-tumoraux apparaît prometteuse pour le traitement des tumeurs pulmonaires primitives et métastatiques chez les patients sans obstruction bronchique. A ce jour, les différents anti-cancéreux testés par aérosolthérapie dans le traitement d un cancer primitif du poumon sont le plus généralement des molécules hydrophobes à faible poids moléculaire. La voie pulmonaire n a jamais été explorée pour des molécules de poids moléculaire élevé tels que les anticorps thérapeutiques qui comptent aujourd hui parmi les médicaments majeurs et en plein essor en cancérologie. 40

46 IgA IgD IgE IgG IgM Poids moléculaire 160kDa, 400kDa 175kDa 190kDa 150kDa 950kDa, 1150kDa Forme Monomère, dimère Monomère Monomère Monomère Pentamère, hexamère Valence 2, , 12 Concentration sérique 1,5-2,6 0,04 0,0003 9,5-12,5 0,7-1,7 Demie-vie sérique 6 3 2, Tableau 4 : Caractéristiques des isotypes d immunoglobulines humaines, d après Lobo et al., Les concentrations sériques sont en mg/ml et demi-vies sériques en jours. Figure 9 : Structure de base d une immunoglobuline (Ig) : deux chaînes légères identiques et deux chaînes lourdes identiques reliées par des ponts disulfures (en rouge). C : extremité C (carboxy-) terminale et N : extremité C (amino-) terminale, d après Roitt et al., 1994.

47 Revue bibliographique CHAPITRE III : LES ANTICORPS THÉRAPEUTIQUES I- Généralités. Les progrès récents dans le domaine de la biologie moléculaire et du génie génétique ont permis l émergence de nouveaux agents pharmacologiques basés sur l utilisation d anticorps (Ac) monoclonaux. Cette nouvelle stratégie offre la possibilité d une thérapie ciblée avec une reconnaissance spécifique de récepteurs cellulaires de surface (Baty et al., 2006). A ce jour, divers anticorps monoclonaux sont utilisés dans des indications aussi variées que le cancer, le rejet de greffe, les maladies infectieuses ou encore le traitement de pathologies inflammatoires et allergiques. Par ailleurs, plus de 30% des essais cliniques mettent actuellement en jeu l utilisation d anticorps thérapeutiques. I.1- Structure des anticorps. I.1a- Les anticorps «naturels». Le nom d immunoglobuline (Ig) est un terme historiquement utilisé pour désigner les anticorps. Chez l homme, les immunoglobulines (Ig) sont des glycoprotéines retrouvées sous la forme de cinq classes ou isotypes. On retrouve les immunoglobulines alpha (IgA), delta (IgD), epsilon (IgE), gamma (IgG) et mu (IgM). Les immunoglobulines diffèrent par leur forme (monomérique ou polymérique), leur fonction, leur poids moléculaire, leur demi-vie ou encore leur concentration sérique (Tableau 4). Les monomères constituant les immunoglobulines sont composés de deux chaînes lourdes dites chaînes H (Heavy Chain) et deux chaînes légères dites chaînes L (Light Chain) (Figure 9) (Roitt et al., 1994). Celles-ci sont reliées entre elles par un nombre variable de ponts disulfures assurant une flexibilité à la molécule. Chacune des quatre chaînes est composée d un domaine variable (V L ou V H ) et 42

48 Revue bibliographique d une (C L ) ou trois parties constantes (C H1, C H2 et C H3 ) pour les légères et les lourdes respectivement (voir Figure 10). Pour un anticorps donné, les deux chaînes lourdes sont identiques, de même pour les deux chaînes légères. Les IgGs, les plus nombreuses (environ 85% des Ig totales), sont subdivisées en quatre sous-types (IgG1, IgG2, IgG3 et IgG4) ; les IgG1 représentant le soustype le plus abondant (45 à 75% des IgG totales). A l extrémité N-terminale se situent les fragments Fabs. Ils sont constitués de la partie variable et d une partie constante de chaque chaîne (V L, C L,V H et C H1 ). Ils contiennent le site de liaison à l antigène cible. A l extrémité C-terminale se trouve la région Fc. Elle contient le site d interaction avec les cellules effectrices du système immunitaire et avec les molécules impliquées dans la pharmacocinétique des Ac (récepteur FcRn). Elle est exclusivement formée par une partie de la région constante des chaînes lourdes. Les immunoglobulines possèdent des sites de glycosylation, ceux-ci sont retrouvés principalement au niveau du fragment Fc. I.1b- Les anticorps à visée thérapeutique. La première génération d Ac monoclonaux d origine entièrement murine utilisée en thérapie a progressivement laissé place à des Ac de plus en plus sophistiqués. En effet, les anticorps murins produits par la technique des hybridomes établie par Köhler et Milstein en 1975, entraînent une réponse immunitaire importante chez l homme ou HAMA Human Anti- Mouse Antibody empêchant une administration répétée du traitement (Baty et al., 2006). Grâce à la technique de l ADN recombinant, ont été développés des Ac monoclonaux moins immunogènes : les Ac recombinants chimériques ou humanisés et les Ac totalement humains (Levene et al., 2005 ; Sibéril et al., 2005) (Figure 10). 43

49 Revue bibliographique Figure 10 : Structure des anticorps thérapeutiques d après Carter, Les Ac chimériques, humains à 60%, contiennent les parties constantes des chaînes lourdes et légères d Ac humain sur les parties variables respectives d un Ac murin (Carter, 2001 ; Brekke et al., 2003). Ils sont construits à partir d un vecteur d expression eucaryote. Celui-ci comporte un site de clonage en amont de l ADNc codant pour les domaines constants de chaînes légères et lourdes d IgG humaines et permettant l intégration des séquences codant les domaines V H et V L de souris. - Les Ac humanisés, humains à 95%, contiennent les parties hypervariables (CDR ou Complementarity Determining Regions) d un Ac murin sur une immunoglobuline humaine. Une fois les séquences des domaines hypervariables humains sélectionnées et éventuellement modifiées, ces séquences sont clonées dans des vecteurs d expression comportant les séquences codantes des domaines constants humains. Ces Ac humanisés ne comportent qu une fraction minime de l Ac de souris. Ils sont moins immunogènes et mieux tolérés par 44

50 Figure 11 : Les différents formats d anticorps, d après Baty et al., Les fragments Fab et F(ab ) 2 peuvent être obtenus par digestion à la papaïne ou la pepsine d une IgG entière. Le V H V est le plus petit domaine connu capable de lier un antigène avec une bonne affinité.

51 Revue bibliographique l organisme humain. En effet, 85% des anticorps murins générent une forte réponse antianticorps (c est-à-dire chez plus de 15% des patients des traités) contre moins de 10% pour les anticorps humanisés (Hwang et al., 2005). - Les Ac humains sont humains à 100%. Ces anticorps peuvent être obtenus de deux manières, par la technique du phage display ou par transgenèse. Cette dernière repose sur le croisement de souris dont une partie des loci codants pour les immunoglobulines a été inactivée (souris K.O.) et des souris transgéniques ayant reçu une partie des loci codants pour les immunoglobulines humaines. Ces Ac ont une immunogénicité moindre, permettent des traitements répétés et possèdent potentiellement une demi-vie plus importante que les Ac chimériques ou humanisés. Par ailleurs, différents formats d anticorps dépourvus de la région Fc mais gardant la capacité de se lier à l antigène ont également été développés (Figure 11). La forme la plus courante est le fragment scfv monocaténaire où la région V H est reliée au V L par un peptide de liaison. On peut le retrouver sous forme multivalente (diabody, triabody, tetrabody) ou complexée (minibody). La petite taille de ces différents fragments d anticorps est intéressante si l on souhaite une élimination rapide par l organisme ou une meilleure pénétration au sein des tumeurs solides (Nissim et al., 2008 ; Booy et al., 2006). Ces fragments d anticorps peuvent être conjugués à différentes molécules : des radioisotopes pour l imagerie en cancérologie, des enzymes pour des traitements avec des pro-drogues, des toxines... Existent également des fragments d anticorps bispécifiques. Citons l exemple des diabodies bispécifiques qui sont formés par l association de deux molécules scfv différentes (Kortt et al., 2001) ; celles-ci contiennent chacune les domaines V H et V L d Ig différentes. Ces diabodies bispécifiques interagissent avec différentes cibles sur une même cellule ou sur deux cellules différentes. Ils sont utilisés dans le domaine de l oncologie principalement. Leur fonctionnement repose sur la reconnaissance d un antigène à la surface de cellules effectrices du système immunitaire par un des deux épitopes et d un antigène tumoral par le second. Ainsi, l effet anti-tumoral est dirigé plus efficacement contre les cellules cancéreuses. 46

52 I.2- Pharmacologie des Ac thérapeutiques et de leurs dérivés. Revue bibliographique L efficacité d un anticorps thérapeutique dépend de nombreux facteurs et, en particulier, des mécanismes par lesquels passent son action (pharmacodynamie) et des paramètres intervenant dans sa pharmacocinétique. I.2a- Pharmacodynamie des anticorps thérapeutiques. Le mode d action des anticorps thérapeutiques et de leurs dérivés passe par différents mécanismes dont les effets peuvent s additionner et dont il est généralement difficile d en apprécier la part relative. Le mécanisme d action des Ac passe tout d abord par une liaison à l antigène cible, mécanisme mettant en jeu le domaine Fab de l Ac (Figure 12). L effet des fragments d Ac et de leurs dérivés est avant tout lié à cette interaction (Congy-Jolivet et al, 2007 ; Penault-Llorca et al., 2002). I.2a α- Mécanisme Fab dépendant : Fixation directe et neutralisation. - Antagonisme de récepteur de surface : l Ac se lie à un récepteur membranaire, inhibant ainsi la transduction du signal intracellulaire et/ou entraînant une internalisation de ce récepteur diminuant alors sa disponibilité à la surface de la cellule. Exemple : inhibition de la voie de signalisation de l EGFR par le cetuximab. - Neutralisation d antigène soluble : l Ac piège un ligand soluble ou une toxine l empêchant d atteindre sa cible. Ce type d anticorps peut être utilisé, par exemple, après empoisonnement avec du venin d insecte ou de serpent, on parle alors d immunotoxicothérapie. Citons l exemple d un Ac anti-tumoral, le bevacizumab : en liant le VEGF soluble, il inhibe la fixation de ce ligand endogène sur son récepteur (VEGFR) et bloque ainsi les effets angiogéniques et pro-tumoraux que cette liaison active. - Agonisme de récepteur de surface : certains Ac sont capables de lier des récepteurs de membrane et de mimer l effet de leur ligand. Cette propriété peut être intéressante pour cibler des récepteurs induisant la mort cellulaire comme le récepteur TRAIL (TNF related apoptosis inducing ligand) de la famille TNF (Tumor Necrosis Factor). Exemple : le mapatumumab. 47

53 Revue bibliographique Fragment Fab Fragment Fc Figure 12 : Mécanismes d action des anticorps thérapeutiques, d après Congy-Jolivet et al, Description schématique des mécanismes Fab dépendants : fixation à un antigène soluble (A) ou à un antigène membranaire (B) et Fc dépendants : recrutement des cellules effectrices (EC) du système immunitaire via liaison à un récepteur FcγR (C) ou de la protéine C1q du complément (D). Pour les Ac entiers, à ce mécanisme Fab dépendant s ajoute la possibilité de recruter les acteurs du système immunitaire via le domaine Fc des Ac. La portion Fc peut entraîner deux réponses : l activation de la voie du complément ainsi que le recrutement et l activation des cellules effectrices du système immunitaire (Figure 12). I.2a β- Mécanisme Fc dépendant. Fixation de la protéine C1q du complément : L activation de la voie du complément est un moyen de lutte contre la plupart des infections bactériennes. Les Ac peuvent se fixer à la protéine C1q via une partie du domaine CH2. En résulte alors une cascade protéolytique aboutissant à la formation d un complexe d attaque membranaire qui va conduire à la destruction de la cellule cible. On parle de cytotoxicité dépendante du complément ou CDC (complement dependent cytotoxicity). 48

54 Revue bibliographique Opsonisation / phagocytose ou lyse du pathogène : Cette voie implique le recrutement de cellules effectrices du système immunitaire (neutrophiles, macrophages, éosinophiles, cellules NK Natural Killer) via leurs récepteurs de surface au domaine Fc des immunoglobulines (FcγR). On parle de cytotoxité à médiation cellulaire ou ADCC (antibody dependent cytotoxicity). I.2a γ- Pharmacodynamie des anticorps conjugués. Il existe également des anticorps conjugués, les effets des molécules associées s ajoutent alors aux propriétés précédentes (Penault-Llorca et al., 2002, Wu et al., 2005). Ces Ac peuvent être couplés à une drogue qui sera activée in situ en un agent cytotoxique localement efficace. L Ac permet alors une distribution sélective de la drogue vers les cellules pathologiques et diminue ainsi la toxicité générale de la drogue. Exemple : gemtuzumab (anticorps monoclonal anti-cd33 humanisé conjugué à la calicheamicine). Ils peuvent également être conjugués à un élément radioactif ou cytotoxique qui va permettre la libération ciblée de radiations ionisantes, on parle de radio-immunothérapie (Harris, 2004). Exemple : tositumomab I 131 (anticorps murin anti-cd20 conjugué au radio-isotope I 131 ). I.2b- Pharmacocinétique des anticorps thérapeutiques. La pharmacocinétique d un anticorps thérapeutique étudie la cinétique de la molécule dans l organisme, de son absorption à son excrétion en passant par son métabolisme. L étude des paramètres pharmacocinétiques des anticorps thérapeutiques, décrivant les différentes étapes de leur devenir dans l organisme, est primordiale pour définir la zone de concentration assurant leur effet optimal tout en minimisant les risques d effets indésirables, c est l intervalle thérapeutique. Nous allons nous intéresser plus particulièrement à la pharmacocinétique des IgGs qui constituent l isotype de la plupart des anticorps thérapeutiques actuellement sur le marché. 49

55 Revue bibliographique La pharmacocinétique comprend quatre phases : l absorption, la distribution, le métabolisme et l élimination. Absorption. C est le passage des IgGs du site d absorption vers le compartiment sanguin. Aujourd hui la plupart des anticorps anti-cancéreux sont administrés par voie intraveineuse. Distribution dans l organisme. Les immunoglobulines, à cause de leur haut poids moléculaire et de leurs propriétés hydrophiles, sont faiblement distribuées par simple diffusion à travers les tissus. Leur diffusion à travers les cellules endothéliales vasculaires est quasiment inexistante dans la plupart des organes à l exception du foie, de la moelle osseuse ou encore de la rate où l endothélium vasculaire est fenêstré et plus «perméable» (Wang et al., 2008). Les immunoglobulines peuvent atteindre l espace intracellulaire de deux manières différentes : par endocytose médiée par un récepteur ou par endocytose de phase fluide (Lobo et al., 2004). Dans le cas de l endocytose médiée par un récepteur, les IgGs interagissent avec les récepteurs Fcγ (c est-à-dire FcγRI, FcγRII, FcγRIII) présents à la surface de diverses cellules comme les monocytes, les macrophages ou encore les lymphocytes B. Ce mécanisme met en jeu une liaison entre le domaine Fc de l IgG au récepteur Fcγ des cellules du système immunitaire. L'interaction entre un récepteur Fcγ et un complexe antigène-anticorps peut induire une phagocytose du complexe ou encore une sécrétion de cytokines, de perforine ou de granzyme (réponse ADCC). L endocytose de phase fluide est retrouvée au niveau des cellules endothéliales notamment. Ce mécanisme ne met pas en jeu l action d un récepteur et les IgGs sont captées et endocytées par un mécanisme qui reste encore mal compris. Cependant, une fois au sein des endosomes, les IgGs peuvent interagir avec le récepteur FcRn (neonatal Fc Receptor) ou récepteur de Brambell (Ghetie et al., 2000 ; Junghans et al., 1997). Les IgGs liées au récepteur FcRn sont alors protégées de la dégradation et relarguées dans le plasma ou l espace interstitiel (Ghetie et al., 1997). Les IgGs non liées au FcRn sont dégradées dans les lysosomes. Brambell a été le premier à décrire ce récepteur comme étant un récepteur 50

56 Revue bibliographique spécifique et saturable des IgGs les protégeant de la dégradation et augmentant ainsi leur demi-vie sérique (voir chapitre IV : le récepteur FcRn). Ce récepteur permet aussi le passage transcellulaire des IgGs facilitant leur transfert du compartiment sanguin vers les tissus et au travers des épithelia (passage transendothélial). Métabolisme et élimination. Les IgGs sont transformées dans l organisme par catabolisme, celui-ci a lieu principalement au niveau du système réticulo-endothélial. Les cellules réticulo-endocytaires sont retrouvées au niveau du foie (cellules de Kupffer représentant environ 30% des cellules hépatiques), de la rate ou encore de la moelle osseuse et présentent des propriétés phagocytaires. Compte tenu de leur masse élevée, peu d IgGs intactes sont éliminées suite à une filtration par les reins. Au contraire, les petits fragments d anticorps (dérivés d anticorps ou fragments obtenus après protéolyse) sont en majorité excrétés via les néphrons. Il faut noter, par ailleurs, que le métabolisme et l élimination des IgGs dépendent de leur immunogénécité, de leur degré de glycosylation et de leur susceptibilité vis-à-vis de la protéolyse. Quel que soit le degré «d humanisation» des anticorps thérapeutiques, il reste toujours une part d immunogénicité des Ac après administration chez l homme. Il sera intéressant d en appréhender l importance dans la pharmacocinétique des Ac pour les thérapies futures. Le récepteur FcRn, en protégeant les IgGs de la dégradation dans les voies lysosomales, limite leur métabolisme et leur élimination de l organisme leur conférant ainsi une longue demi-vie et une persistance dans les tissus. Cette propriété offre potentiellement un effet thérapeutique prolongé pour les IgGs utilisées en clinique. Notons par ailleurs que les anticorps thérapeutiques entiers présentent une demi-vie plus longue que les fragments d anticorps ceux-ci étant dépourvus du domaine Fc (quelques minutes pour les fragments jusqu à plusieurs semaines pour les anticorps entiers). Modifier la pharmacocinétique de ces médicaments est un sujet d étude attractif dans la thérapie par anticorps. En effet, en augmentant l affinité des anticorps pour le FcRn, leur biodisponibilité et donc leur efficacité peuvent être prolongés (Dalla Acqua et al., 2006 ; Datta-Mannan et al., 2007). 51

57 Anticorps Antigène cible Indications principales Murins Date de mise sur le marché Ibritumomab tiuxetan Tositumomab CD20 Lymphome non hodgkinien Lymphome non hodgkinien FDA 19/02/02 FDA 27/06/03 Chimériques Cetuximab EGFR Cancer colorectal métastatique et ORL FDA 12/02/04 EMEA 29/06/04 Rituximab CD20 Lymphome non hogkiniens FDA 26/11/97 EMEA 02/06/98 Humanisés Alentuzumab CD52 Leucémie lymphoïde chronique FDA 05/07/01 EMEA 06/07/01 Bevacizumab VEGF Cancer colorectal métastatique FDA 26/02/04 CBNPC EMEA 12/01/05 Trastuzumab HER2 Cancer du sein FDA 25/09/98 EMEA 28/08/00 Gemtuzumab CD33 Leucémie myéloïde chronique FDA 17/05/00 ozogamicin Nimotuzumab EGFR Cancer de la tête et du cou EMEA 15/08/04 FDA 07/11/04 Humain Panitumumab EGFR Cancer colorectal métastatique FDA 27/09/06 Tableau 5 : Anticorps anticancéreux actuellement disponibles sur le marché, modifié d après Magdelaine-Beuzelin et al., 2007 et le site internet FDA : U.S. Food and Drugs Administration. EMEA : European Medecines Agency.

58 Revue bibliographique II- Les anticorps thérapeutiques anticancéreux. La clé du développement des thérapies ciblées passe par la capacité à définir les processus moléculaires intervenant dans la transformation d une cellule saine en une cellule pathologique. L essor des anticorps thérapeutiques en cancérologie a pu voir le jour grâce à une connaissance accrue des processus de cancérisation et une meilleure définition des facteurs intervenant dans la prolifération tumorale, mais également grâce à l amélioration de l ingénierie des Ac monoclonaux. Les Ac anti-tumoraux ciblent les cellules tumorales ou le microenvironnement tumoral via des antigènes de surface définis comme étant a priori plus exprimés que sur les cellules normales (Glennie et al., 2003). II.1- Les anticorps approuvés aujourd hui en oncologie. En oncologie, l objectif de l administration d Ac thérapeutiques est d induire la destruction directe ou indirecte des cellules tumorales. Les cibles thérapeutiques peuvent donc être sur les cellules cancéreuses elles-mêmes ou dans le microenvironnement c est le cas des facteurs angiogéniques. A ce jour, dix anticorps sont approuvés dans le domaine de l oncologie. Ceux-ci ont différentes cibles (Tableau 5) : - Des marqueurs transmembranaires de la prolifération des lymphocytes B : CD20 pour le rituximab (MabThera ), l ibritumomab tiuxetan (Zevalin ) et le tositumomab (Bexxar ) ; CD33 pour le gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg ) et CD52 pour l alemtuzumab (MabCampath ). - Des ligands solubles : VEGF pour le bevacizumab (Avastin ). - Des récepteurs de la famille des tyrosines kinases : HER2 pour le trastuzumab (Herceptin ) et EGFR pour le cetuximab (Erbitux ), le nimotuzumab (Theracim ) et le panitumumab (Vectibix ). 53

59 Revue bibliographique II.2- Les anticorps ciblant l EGFR. De nombreux anticorps monoclonaux sont actuellement en phase clinique d évaluation et une partie d entre eux ciblent le récepteur à l EGF (Tableau 6). En effet, l EGFR a été décrit dans le développement de nombreux cancers chez l homme, il représente un élément clé du processus de croissance tumorale (Roberts et al., 2007) et donc une cible thérapeutique très attractive. Molécule Nom générique Anticorps Statut Indications (type de cancer) IMC-C225 Cetuximab IgG1 chimérique Approuvé CCR, CETC (Erbitux) Phase II-III CBNPC, pancréas, sein et autres tumeurs solides ABX-EGF Panitumumab IgG2 entièrement Approuvé CCR (Vectibix) humaine Phase I-III CBNPC, rectum, vessie, sein, ovaire EMD Matuzumab IgG1 humanisée Phase II CBNPC, estomac, uterus et autres tumeurs solides h-r3 Nimotuzumab IgG1 humanisée Phase III Diverses tumeurs solides (TheraCIM) Approuvé et particulièrement CBNPC mab 2F8 Zalutumumab IgG1 entièrement Phase III CBNPC, CETC (HuMax-EGFr) humaine rhumab 2C4 Pertuzumab IgG1 humanisée inhibant la Phase II Sein, ovaire (Omnitarg) dimérisation de HER2 avec les autres membres de la famille HER ch806 IgG2 chimérique Phase I Tumeurs solides avancées Anti-EGFR viii MDX-214 fusion d'egf avec un fragment Phase II Tumeurs solides avancées Fab entièrement humain d'un anti-cd89 (IgA FcR) Tableau 6 : Les anticorps anti-egfr approuvés ou en développement, d après Roberts et al, CCR : Cancer colorectal, CETC : carcinome épidermoide de la tête et du cou, CBNPC : cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules. 54

60 Milieu extracellulaire Cytoplasme Figure 13 : Structure schématique des récepteurs de la famille HER, d après «La famille HER», laboratoire GlaxoSmithKline Oncology, Figure 14 : Transduction du signal après activation de l EGFR d après Nyati et al., (2006). La voie JAK/STAT est impliquée dans la prolifération et la survie cellulaire, la voie PI3K-Akt dans l inhibition de l apoptose et Ras/Raf-MAPK dans la motilité cellulaire.

61 Revue bibliographique III- Le cetuximab (C225 ou Erbitux ). Le cetuximab est le premier anticorps anti-egfr ayant obtenu une autorisation de mise sur le marché (2004). C est une IgG1 chimérique d environ 152 kda qui lie spécifiquement l EGFR avec une affinité supérieure à celle de ses ligands endogènes (Vincenzi et al., 2008). Il est composé de deux chaînes lourdes de 449 acides aminés et de deux chaînes légères de 214 acides aminés chacune. Les quatre chaînes sont liées par un ensemble de liaisons non-covalentes et de ponts disulfures. Des sites de N-glycosylation sont retrouvés sur chacune des chaînes lourdes. Le cetuximab prévient la fixation des ligands endogènes de l EGFR, inhibant ainsi l activation du récepteur et les voies de signalisation sous-jacentes. Il peut également entrainer une réponse immunitaire de type ADCC (antibody dependent cytotoxicity) pouvant contribuer à son effet anti-tumoral. III.1- Rappel : la voie de signalisation de l EGFR. L EGFR est exprimé dans de nombreux tissus et particulièrement dans les tissus d origine épithéliale comme la peau ou le tractus gastro-intestinal. Dans les tissus sains, il maintient la survie des cellules et permet la prolifération cellulaire. Dans les tissus cancéreux, la surexpression de l EGFR contribue à la croissance et à la survie des cellules tumorales. III.1a- Structure du récepteur. L EGFR est le premier récepteur transmembranaire de la famille des récepteurs à tyrosine kinase HER à avoir été identifié. On retrouve dans cette famille quatre membres : EGFR ou HER1/erbB1, HER2 ou erbb2/neu, HER3 ou erbb3 et HER4 ou erbb4. Ils sont composés d un domaine extracellulaire contenant le site de fixation au ligand, d un segment transmembranaire et d un segment intracellulaire pourvu de domaines tyrosines kinases (Figure 13) (Mendelsohn et al., 2003 ; Baselga, 2001). 56

62 Revue bibliographique III.1b- Voies de signalisation de l EGFR. Les ligands de l EGFR sont des facteurs de croissance : l EGF (Epidermal Growth Factor), le TGF-α (Transforming Growth Factor-α) et l amphireguline (Dutta et al., 2007, Ciardiello et al., 2008). La fixation du ligand sur le récepteur induit la formation d homodimères ou d hétérodimères (le plus souvent avec ErbB2). La dimérisation des récepteurs entraîne l autophosphorylation des domaines intra-cytoplasmiques adjacents et l activation des tyrosines kinases intrinsèques présentes sur chaque récepteur. Plusieurs voies de transduction du signal peuvent alors activées (Figure 14) (Nyati et al., 2006). La voie Ras/Raf-MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) aboutit à l activation de facteurs de transcription via ERK (Extracellular Signal Regulated Kinase) à l origine de la motilité cellulaire (Nishinaka et al., 2001). L EGFR phosphorylé peut également activer la PI3K (phosphatidyl inositol-3-kinase) via la protéine Gab1. La PI3K mène à un signal antiapoptotique via Akt puis NFκB (Vivanco et al., 2002). L EGFR possède également un rôle dans la prolifération et la survie cellulaire via JAK2 (Janus Kinase2) / STAT3 (Signal Transducer and Activator of Trancription3) (Bowman et al., 2000). D autres voies de signalisation sont impliquées dans l adhésion cellulaire et l angiogénèse. Après son activation, le récepteur est internalisé, puis recyclé ou dégradé. Différents mécanismes sont mis en route pour permettre un retour de la cellule à son état initial incluant une ubiquitination et une déphosphorylation du récepteur, une inactivation des kinases, une dissociation du ligand, une translocation des récepteurs actifs à la surface ou une dégradation par le protéasome (Yarden et al., 2007). Un groupe de répresseurs transcriptionnels et de protéines liant l ARN assurent également une désactivation du signal intracellulaire. III.1c- EGFR et cancer. Dans les cellules tumorales, le contrôle des voies de signalisation de l EGFR est souvent altérée, ce qui aboutit à une induction de la prolifération cellulaire (Dutta et al., 2007). Ceci passe par une surexpression de l EGFR (dans 60 à 80% des tumeurs bronchopulmonaires), une activation du récepteur indépendante de la fixation du ligand ou une sécrétion accrue des ligands entraînant la formation d une boucle autocrine. Dans certains cas, l expression d un variant du récepteur (EGFR viii) est également retrouvé, il se caractérise par la capacité à activer constitutivement ses propres domaines tyrosines kinases. Dans le 57

63 Revue bibliographique CBNPC et dans divers types de cancers, la surexpression d EGFR est associée à un mauvais pronostic vital (Maurrizi et al., 1996 ; Volm et al., 1998 ; Umekita et al., 2000). III.2- Liaison du cetuximab à l EGFR. Le cetuximab présente une affinité pour l EGFR de 5 à 10 fois supérieure à celle de ses ligands naturels comme l EGF ou TGF-α (Goldstein et al., 1995). À l état physiologique, l EGFR est présent à la surface des cellules dans une conformation compactée (Figure 15). Cependant, une petite fraction de ces récepteurs se trouve sous forme relachée, permettant ainsi la fixation des ligands sur les domaines I et III. Le domaine II est alors démasqué et va interagir avec le domaine II d un autre récepteur ErbB. La dimérisation des récepteurs entraîne la transduction du signal intracellulaire. Le cetuximab, via les domaines variables de ses chaînes L et H, se fixerait sur le domaine III de l EGFR empêchant ainsi de démasquer le domaine II et donc la dimérisation des récepteurs. Figure 15 : Modélisation de la fixation du ligand sur le récepteur à l EGF, d après Li, A. La plupart des récepteurs à l EGF présents à la surface de la cellule sont sous forme compactée. B. Une faible proportion se trouve sous forme relâchée permettant d accueillir le ligand. C. La fixation du ligand sur les domaines I et III démasque le domaine II. Deux domaines II se lient entre eux et permettent la dimérisation des récepteurs. Cependant des études publiées récemment contredisent l effet du cetuximab sur la dimérisation du récepteur (Perez-Torres, 2006 ; Yoshida et al., 2008). En effet, ces équipes ont montré sur des lignées cancéreuses pulmonaires que le cetuximab permettait une dimérisation mais également une internalisation du récepteur. Il interviendrait alors en aval, ne permettant pas la phosphorylation de MAPK et d Akt ; il inhiberait l activation des voies de transduction sous-jacentes et in fine la tumorigenèse. 58

64 Figure 16 : Propriétés anti-tumorales du cetuximab, d après

65 Revue bibliographique III.3- Mode d action du cetuximab. L effet anti-tumoral direct du cetuximab passe par une inhibition de la liaison des ligands endogènes sur le récepteur à l EGF et ainsi de l activation des voies de signalisation sous-jacentes. Une variété de processus régulés par l activation de l EGFR est ainsi interrompu (Figure 16). III.3a- Arrêt du cycle cellulaire. Le cetuximab bloque la progression du cycle cellulaire en phase G1. En effet, il augmente l expression de p27 kip1, un inhibiteur du cycle cellulaire, in vitro (Peng et al., 1996) et in vivo chez la souris nude porteuse de tumeurs d origine humaine (Mendelsohn, 2000). III.3b- Effet anti-angiogénique, effet anti-métastatique. Le cetuximab entraîne une diminution de la production de facteurs angiogéniques in vitro et in vivo tels que le VEGF ou le bfgf (Basic Fibroblast Growth Factor) (Petit et al., 1997 ; Baselga, 2001). Des effets anti-métastatiques lui ont également été attribués. En effet, des études ont montré qu il inhibe l expression et l activité de métalloprotéases telle que la MMP-9 (Matrix MetalloProteinase). Cette diminution est corrélée avec une réduction de la croissance tumorale et de l invasion tumorale chez la souris nude (O-Charoenrat et al., 2000). III.3c- Effet pro-apoptotique. Différentes études rapportent une altération de la balance Bax (pro-apoptotique) / Bcl2 (anti-apoptotique) sous l effet du cetuximab. Par exemple, dans la lignée cellulaire DiFi (carcinome du colon), le cetuximab entraîne une augmentation de l expression de Bax et induit l activation de nombreuses caspases. Par ailleurs, en combinaison avec certains agents chimiothérapeutiques, il augmente la mort par apoptose in vitro et in vivo dans différents modèles (Bruns et al., 2000 ; Ciardiello et al., 1999). 60

66 Revue bibliographique III.4- Indications du cetuximab et études cliniques. Le cetuximab est utilisé par voie intra-veineuse avec un schéma généralement de 400 mg/m 2 en dose de charge suivie d une injection hebdomadaire de 250 mg/m 2. III.4a- Indications du cetuximab. Dans un premier temps, le cetuximab a été approuvé par la FDA pour le traitement de patients atteints d un cancer colorectal métastatique (CCM) positif à l EGFR. Il est utilisé soit en monothérapie pour les patients intolérants à l irinotecan ou bien en combinaison avec cet agent chimiothérapeutique lorsque les patients ne répondent pas à son action seule (Cunningham et al., 2004 ; Lynch et al, 2007). Puis, il a été approuvé en 2005 pour le traitement en première ligne de patients atteints d un cancer ORL en combinaison avec une radiothérapie (Marshall, 2006). III.4b- Toxicité et effets secondaires. La toxicité principale du cetuximab est cutanée et caractéristique des traitements ciblant l EGFR. Les réactions acnéiformes sont très fréquentes (80%) et importantes, pouvant aller jusqu au grade 3 dans une proportion de patients non négligeables (15%) (Lynch, et al., 2007). Elles nécessitent généralement l utilisation de traitements loco-régionaux. Le traitement par cetuximab peut également entrainer des troubles digestifs (diarrhée, nausées et vomissements), des problèmes de neutropénie, d anémie ou encore d asthénie. Des réactions anaphylactiques sévères bien que peu fréquentes ont aussi été rapportées (1 4% des cas). III.4c- Facteurs prédictifs de réponse au cetuximab. Dans le cadre du traitement du cancer colorectal métastatique, les études cliniques n ont révélé auncune corrélation entre le niveau d expression d EGFR et la réponse au cetuximab. Contrairement au traitement par TKI, les mutations dans le domaine tyrosine kinase de l EGFR n ont pas été associées à une sensibilité accrue à l anticorps (Vincenzi et al., 2008). 61

67 Revue bibliographique Différents phénomènes de résistance au cetuximab ont également été rapportés dans le CCM. Les patients présentant une mutation de Kras, par exemple, montrent une résistance au cetuximab et un moins bon pronostic vital (Lièvre et al., 2008). Notons qu un phénomène identique est retrouvé dans le CCM avec le panitumumab (autre anticorps anti-egfr). Une mutation de la PI3K ou une perte d expression de PTEN peuvent également être associés à une résistance au cetuximab (Jhawer et al., 2008). III.4d- Etudes cliniques. Le cetuximab est actuellement en étude dans le traitement du CBNPC. Plusieurs essais de phase II ont été mis en place pour évaluer l efficacité du cetuximab en première ligne en association avec différents agents chimiothérapeutiques : la carboplatine et le docetaxel ou le paclitaxel, la gemcitabine et la carboplatine. Certaines de ces études sont répertoriées dans le tableau 7 (Govindan, 2004 ; Morgensztern, 2007). Le cetuximab en association avec une chimiothérapie est plutôt bien toléré, il présente un taux de réponse de 26 à 37% et un taux de survie à un an entre 40 et 49%. Différentes études de phase III ont été entreprises. Etude Traitement Nombre de Réponse TSM Survie TP/SSP (mois) patients partielle (%) (mois) à 1 an (%) Thienelt et al P Cb C Robert et al G Cb C ,3 10,3 45 Kelly et al P Cb C ,2 10,5 49 P Cb C ,4 8,7 43 Tableau 7 : Essais cliniques de phase II pour le traitement du CBNPC, association du cetuximab à une chimiothérapie, d après Morgensztern, Abréviations : C = cetuximab, Cb = carboplatine, Cp = cisplatine, P = paclitaxel, G = gemcitabine. TP = Temps jusqu à progression, SSP = Survie sans progression, TSM = Temps de survie médian. En seconde ligne, le cetuximab est également testé en association avec le docetaxel chez des patients atteints de CBNPC réfractaire à la chimiothérapie. Le taux de réponse partiel est de 28% et 17% des patients présentent une stabilité dans la progression de la maladie (Marshall, 2006). De nouvelles études sont par ailleurs menées pour étudier son effet en association avec une radiothérapie. L effet du cetuximab seul a également été évalué (essai de phase II) dans le traitement du CBNPC réfractaire à la chimiothérapie (Hanna et al., 2006). Le taux de réponse global était de 4,5% et 30,3% des patients présentaient une stabilité de la 62

68 Revue bibliographique maladie. Bien que ce taux de réponse reste faible, il est comparable au traitement à l erlotinib ou au docetaxel dans des groupes de patients similaires. L une des études cliniques entreprise en première ligne avait pour but de comparer le taux de réponse au traitement cisplatine / vinorelbine en association ou non avec le cetuximab. En phase II, les patients traités avec le cisplatine et la vinorelbine seuls présentaient un taux de réponse plus faible qu avec l association au cetuximab (20% contre 31,7%) (Bunn et al., 2002 ). En phase III (étude FLEX), les effets secondaires répertoriés étaient principalement : nausées, neutropénie, vomissements, anorexie, fatigue, réaction acnéiformes et diarrhée. Les patients traités par du cetuximab avec une association de cisplatine / vinorelbine présentaient un taux de survie supérieur aux patients traités avec l association cisplatine / vinorelbine seule. Cette étude a été la première à démontrer un bénéfice sur la survie d un agent anti- EGFR en association à une chimiothérapie à base de cisplatine dans le CBNPC et confirme l intérêt clinique du cetuximab dans le traitement de cette pathologie (Von Pawel et al., 2006 ; Pirker et al., 2008). 63

69 Revue bibliographique CHAPITRE IV : LE RÉCEPTEUR FcRn I- Structure et présentation générale. I.1- Structure du récepteur FcRn. Le récepteur FcRn ou récepteur de Brambell est un hétérodimère, composé d une chaîne lourde (chaîne α) et d une chaîne légère, la β2 microglobuline (ou β2m) (Simister et al., 1985). La chaîne α est composée de trois domaines extracellulaires nommés α1, α2 et α3, d un domaine transmembranaire et d une courte séquence cytoplasmique (Raghavan et al., 1996) (Figure 17). La chaîne α est une molécule apparentée au CMH de classe I (complexe majeur d histocompatibilité) d une taille de 51 kda chez la souris et de kda chez l homme. Les trois domaines extracellulaires et le domaine transmembranaire montrent des homologies de séquence avec les régions correspondantes des molécules du CMH de classe I. L homologie entre les domaines cytoplasmiques est moins importante, en accord avec les activités fonctionnelles différentes des deux types de protéines. La β2 microglobuline est une protéine d environ 12 kda, elle est retrouvée à la surface de la plupart des cellules nucléées associée aux molécules du CMH de classe I (Gussow et al., 1987). 64

70 Revue bibliographique Figure 17 : Structure schématique et cristallographique du récepteur FcRn, d après Raghavan et al., I.2- Localisation chromosomique et organisation génique des gènes FCGRT et β2m. Chez l homme, la chaîne alpha du récepteur est codée par le gène FCGRT localisé sur le chromosome 19 dans la région q13.33 (Figure 18). La plupart des études rapportent la présence de six exons chez l homme (Simister et al., 1996 ; Zhu et al., 2001 ; Sachs et al., 2006) mais l équipe de Mikulska en 2000 décrit la présence d un septième exon en région 5 non codante suggérant la possibilité d un épissage alternatif. Brièvement, la structure du gène est la suivante : l exon 1 contient une région 5 non traduite et la séquence codant le peptide signal. Les exons 2, 3 et 4 codent respectivement les régions extracellulaires α1, α2 et α3. L exon 5 contient la séquence codant la région transmembranaire. Les séquences codant le domaine intracellulaire sont retrouvées sur les exons 5 et 6. L exon 6 comprend également une région 3 non traduite. A ce jour, il n y a pas d informations disponibles sur la régulation du gène FCGRT. Le gène codant la β2 microglobuline est localisé sur le chromosome 15 dans la région q21-q22.2, il a une taille d environ 8 kb. Il est composé de quatre exons et de trois introns (Figure 19). 65

71 Revue bibliographique A- Ex 1 Ex 2 Ex 3 Ex 4 Ex 5 Ex 6 (5 UTR, PS) (α1) (α2) (α3) (TM, I) (I, 3 UTR) B- Figure 18 : Représentation schématique de la structure du gène FCGRT codant la chaîne α du récepteur FcRn, selon Simister et al., 1996 ; Zhu et al., 2001 ; Sachs et al., 2006 (A) et Mikulska et al., 2000 (B). Les exons sont représentés par des rectangles rouges pour les régions extracellulaires α1, α2 et α3, orange pour le peptide signal (PS), jaune pour la région transmembranaire (TM) et tachetés pour la région intracellulaire (I). Les rectangles gris correspondent aux régions 5 et 3 non traduites. Les flèches correspondent aux 2 sites potentiels d initiation de la transcription. Les deux traits obliques indiquent une rupture dans l échelle de la représentation. Ex 1 Ex 2 Ex 3 Ex 4 Figure 19 : Représentation schématique de la structure du gène codant la β2 microglobuline. Les exons sont représentés par des rectangles verts foncés pour les régions traduites et par des rectangles gris pour les régions 5 et 3 non traduites. La flèche correspond au site d initiation de la transcription. Les deux traits obliques indiquent une rupture dans l échelle de la représentation. 66

72 Revue bibliographique I.3- Liaison au domaine Fc des IgGs. Le FcRn lie les IgGs de manière ph dépendante : le FcRn, principalement localisé au niveau des membranes des endosomes, lie les IgGs à ph acide 6-6,5 et non à ph physiologique (ph 7,4). L interaction entre le récepteur et le domaine Fc des IgGs est médiée en grande partie par les histidines présentes sur les domaines CH2 et CH3 des IgGs (Reff et al., 2001). I.4- Homologie de séquence inter-espèces. Le récepteur FcRn est retrouvé dans diverses espèces de mammifères et reste relativement conservé d une espèce à l autre. La chaîne lourde du récepteur présente 91% d homologie entre le rat et la souris et 65% entre l homme et le rat (Simister et al., 1996). En dépit de ces fortes homologies, le FcRn humain présente une affinité très stringente pour les IgGs et ne lie que les IgGs humaines et de lapin. Le FcRn murin, quant à lui, a une faible spécificité et lie la plupart des IgGs. Il présente par ailleurs une forte affinité pour les IgGs humaines (Datta-Mannan et al., 2007). II- Expression tissulaire et fonctions. II.1- Profil d expression du récepteur FcRn. L expression du récepteur FcRn a été rapportée dans un premier temps au niveau de l intestin des nouveaux nés chez les rongeurs (Brambell, 1966 ; Rodewald et al., 1973) et au niveau du placenta chez l humain (Leach, 1996). Par la suite il a été retrouvé au niveau de divers autres tissus soulignant son importance dans tout le corps. Comme cité précédemment (chapitre III, paragraphe I2b), il est exprimé chez l homme au niveau des cellules endothéliales (Ward et al., 2003), mais aussi des cellules épithéliales des intestins (Israel et al., 1997), des cellules présentatrices d antigène (Zhu et al., 2001, Vidarsson et al., 2006), des cellules épithéliales glomérulaires rénales (McCarthy et al., 2000) ou encore des cellules épithéliales pulmonaires (Spiekerman et al., 2002). Au niveau pulmonaire chez le primate, le FcRn est principalement exprimé par les cellules épithéliales des voies aériennes supérieures. 67

73 Revue bibliographique II.2- Rôles du récepteur FcRn. Le premier rôle attribué au FcRn a été le transport des IgGs de la mère à l enfant : à travers l intestin des nouveaux nés chez les rongeurs et à travers le placenta chez l humain. Dans les deux cas, le FcRn permet la transcytose des IgGs à travers un épithélium polarisé (épithélium intestinal ou syncytiotrophoblaste) (Figure 20). Figure 20 : Le récepteur FcRn permet le transfert périnatal des IgGs d après Roopenian et al., a/ Chez les rongeurs le FcRn est exprimé à la surface des entérocytes et permet le passage des IgGs maternelles de la lumière de l intestin vers le sang du nouveau-né. b/ Chez l homme, les IgGs maternelles sont captées par le syncytiotrophoblaste et relarguées dans la circulation sanguine du foetus. Par la suite, des études in vivo ont montré que les IgGs avaient une demi-vie sérique très réduite chez les souris déficientes pour la β2-microglobuline. Notamment, Israel et coll. ont démontré en 1996 qu après injection intraveineuse d IgG1 radiomarquées chez la souris, les IgGs étaient plus rapidement dégradées chez les animaux β2m -/- que chez les animaux β2m -/+ ou β2m +/+ avec des demi-vies de 25 heures et de 5 jours respectivement pour les souris β2m -/- et les souris β2m +/+ (Israel et al., 1996). En effet, comme l avait proposé Brambell quelques années auparavant, le récepteur FcRn grâce à sa liaison avec le domaine Fc des IgGs, les protège de la dégradation dans les lysosomes et permet leur recyclage vers l espace extracellulaire (Figure 21) (Ghetie et al., 1996 ; Ghetie et al., 1997). Le récepteur 68

74 Revue bibliographique FcRn facilite aussi le passage transcellulaire des IgGs autorisant leur transfert du compartiment sanguin vers les tissus et au travers des épithelia (Figure 21). Figure 21 : Rôle du FcRn dans le transport et le recyclage des IgGs à travers les cellules endothéliales, d après Ternant et al., Notons que le récepteur FcRn protège également l albumine de la dégradation catabolique intracellulaire. L albumine et les IgGs constituent les deux protéines plasmatiques les plus abondantes, elles lient le FcRn par des mécanismes distincts et sur des sites indépendants (Anderson et al., 2006). En résumé, le FcRn possède trois fonctions principales. - Il permet la transcytose in vitro et in vivo des IgGs à travers les cellules polarisées des épithéliums. Ce mécanisme intervient, par exemple, lors de l absorption des IgGs maternels à travers le placenta ou par le nouveau né à travers l épithélium du petit intestin (Ghetie et al., 2002). - Il intervient dans le maintien de l homéostasie des IgGs. Sa liaison aux IgGs au niveau des endosomes permet leur recyclage à la surface cellulaire et les protège de la dégradation par catabolisme (Ward et al., 2003). - Des études récentes ont par ailleurs montré qu il pouvait intervenir comme récepteur de phagocytose dans les neutrophiles (Vidarsson et al., 2006). 69

75 PARTIE I Propriétés aérodynamiques, immunologiques et pharmacologiques du cetuximab après aérosolisation

76 Résultats I Pour administrer une molécule thérapeutique par voie inhalée, il est nécessaire de prendre en compte plusieurs paramètres : - premièrement, la pénétration et le dépôt de l aérosol de la molécule considérée dans les voies aériennes. Celles-ci dépendent des caractéristiques physiques de l aérosol, notamment de ses propriétés aérodynamiques, des paramètres respiratoires du patient et de l anatomie des voies aériennes. Ces données seront importantes pour évaluer le site d action de la molécule. - deuxièmement, l activité biologique du médicament après aérosolisation. En effet, l aérosolisation qui impose des contraintes physiques et mécaniques aux médicaments, peut entraîner une agrégation ou une détérioration des molécules actives. Il est donc nécessaire de vérifier l effet de l aérosolisation sur les propriétés d une molécule avant d envisager une administration par voie pulmonaire chez un patient. - troisièmement, l absorption de la molécule au niveau de son site d action et les mécanismes mis en jeu. Ce premier chapitre décrit l impact de l aérosolisation sur les propriétés aérodynamiques, immunologiques et pharmacologiques des anticorps thérapeutiques antitumoraux avec comme modèle d étude le cetuximab, un anticorps anti-egfr. Tout comme le cetuximab, la plupart des anticorps thérapeutiques présents actuellement sur le marché sont commercialisés sous forme liquide. La nébulisation permettant spécifiquement la transformation d un liquide médicamenteux en un aérosol, cette méthode s est imposée naturellement pour aérosoliser le cetuximab. Le cetuximab a été nébulisé par différents appareils qui utilisent chacun l un de trois types de nébulisation existants (Annexe 1). - un nébuliseur à membrane (AeronebPro ) qui génère des gouttelettes d aérosol grâce au passage de la solution au travers d une membrane vibrante. - un nébuliseur pneumatique (PARI LC+ ) qui nébulise la solution aqueuse de médicament par l action d un compresseur à flux d air. - un nébuliseur ultrasonique (SYST AM LS290) qui forme des particules d aérosol grâce aux vibrations d'un quartz. 71

77 Etage x Etage 2 Etage 1 Figure 22 : Principe de fonctionnement d un impacteur en cascade, d après Dautzenberg et al., 2006.

78 Résultats I Les paragraphes suivants résument brièvement le contexte scientifique et les résultats de ces travaux qui ont fait l objet d une publication en 2007 : Maillet et al., Pharmaceutical Research, 2008 ; 25 (6) : (pages 77 à 85 du manuscrit). I- Etude des propriétés aérodynamiques du cetuximab nébulisé. En général, un aérosol est polydispersé c est-à-dire que les particules qui le constituent sont de tailles inégales. Pour prédire au mieux le dépôt d un médicament aérosolisé dans les voies aériennes et donc, son site d action, il est nécessaire de mesurer les propriétés physiques de l aérosol. Les particules constituant un aérosol peuvent être caractérisées selon leur diamètre aérodynamique qui reflète leur dépôt dans l arbre pulmonaire. Ainsi, plus la taille des particules en suspension est petite, plus les particules diffuseront profondément au niveau de l'arbre respiratoire. Les caractéristiques aérodynamiques des particules constituant l aérosol varient selon la nature de la molécule et du type de nébuliseur utilisé. Pour ces raisons, une étude granulométrique par impaction en cascade a été réalisée pour évaluer la répartition des particules de l aérosol de cetuximab selon leur taille après aérosolisation avec les différents nébuliseurs. Cet appareil est constitué de plusieurs plaques percées de fentes de taille de plus en plus petites et traversées par un flux d air (chaque étage correspondant à un diamètre de coupure) (Figure 22). Les particules d une masse définie contenant le cetuximab vont s impacter sur les plaques d impaction correspondant à leur diamètre de coupure. Ainsi, les particules les plus grandes qui ont les masses les plus importantes seront arrêtées sur les premières plaques et les plus petites sur les dernières. La quantité de cetuximab déposée sur chaque étage de l impacteur a été mesurée par un dosage protéique et ainsi la distribution de l aérosol déterminée en classes granulométriques. Cette étude a permis de déterminer le DAMM pour diamètre aérodynamique médian en masse ou MMAD (Mass Median Aerodynamic Diameter) pour lequel 50% du total de la masse de cetuximab est située au-dessus de cette taille et, la fraction respirable qui correspond au pourcentage de particules de DAMM inférieur à 5 µm, c est-à-dire les particules pouvant se déposer dans les voies aériennes inférieures (FPF pour Fine Particule Fraction). 73

79 Résultats I II- Etude in vitro des propriétés immunologiques et pharmacologiques du cetuximab nébulisé. L efficacité d un anticorps thérapeutique est dépendante de sa capacité à fixer son ligand et de ses propriétés pharmacologiques. Afin de déterminer l impact de la nébulisation sur la capacité du cetuximab à lier l EGFR et sur son pouvoir cytotoxique, des études in vitro avec des lignées cellulaires d intérêt ont été effectuées. Pour pouvoir mettre les cellules en contact de l anticorps après nébulisation, un impinger a été connecté en sortie des nébuliseurs pour remettre les particules d aérosol en solution (Figure 23). Les tests in vitro avec l anticorps nébulisé ou natif remis en solution ont été réalisés sur deux lignées cellulaires : les A549 (carcinome bronchiolo-alvéolaire humain) et les A431 (carcinome épidermoïde humain d origine épidermique) qui sur-expriment toutes les deux l EGFR. Les A431 ont été choisies car elles représentent les cellules de référence, dans la littérature, pour les études sur le cetuximab (Saleh et al., 1999 ; Matar et al., 2004). La liaison et l affinité du cetuximab pour l EGFR ont été comparées par cytométrie en flux avant et après nébulisation avec les différents appareils. L inhibition de la phosphorylation de l EGFR et de la croissance cellulaire par le cetuximab aérosolisé et natif ont également été étudiées sur les cellules A431. Flux d air Nébuliseur pneumatique Pompe Impinger Figure 23 : Exemple de montage utilisant un impinger. L aérosol est généré à l aide d un nébuliseur pneumatique. Il est collecté en phase liquide dans l impinger connecté à une pompe d aspiration. 74

80 Résultats I III- Résultats et discussion. Dans cette étude, nous avons démontré que les particules de l aérosol formé par les différents types de nébuliseurs présentaient des caractéristiques aérodynamiques proches (DAMM entre 1.6 et 2.7 µm et fraction respirable entre 58 et 84%), malgré des valeurs de DAMM légèrement plus élevées pour le nébuliseur à membrane. Quel que soit le type de nébuliseur, les caractéristiques étaient appropriées pour un dépôt dans l arbre trachéobronchique (2-6µm) et les voies aériennes périphériques (<3 µm). Par contre, la présence d agrégats dans la solution de cetuximab a été observée après nébulisation avec le PARI LC+ et le SYST AM LS290, ceux-ci étant plus nombreux et plus volumineux avec le nébuliseur ultrasonique. La formation d agrégats en phase liquide (impinger) pourrait être expliquée par le principe de fonctionnement des nébuliseurs pneumatiques et ultrasoniques utilisant un système de recyclage des particules de taille inadéquate dans le réservoir. L agrégation du cetuximab en solution ne peut être négligée car la formation de ces structures est souvent à l origine d une dénaturation et d une perte d activité des protéines (Fangmark et al., 1996). Cependant, elle doit être relativisée car notre étude a été réalisée à température ambiante, ce qui ne prédit pas le comportement du cetuximab dans les voies respiratoires à 37 C et 100% d humidité relative (environnement retrouvé dans les voies respiratoires). L absence de reproductibilité des résultats obtenus avec le cetuximab nébulisé avec le SYST AM, due à la présence de nombreux agrégats, a conduit à disqualifier ce nébuliseur. Les résultats obtenus avec les nébuliseurs à membrane et pneumatique démontrent que la capacité de fixation du cetuximab nébulisé pour l EGFR était similaire à celle de l anticorps natif (IC50 de 1, mg/ml et 1, mg/ml contre 1, mg/ml). Mais aussi, que l inhibition de la phosphorylation de l EGFR et de la croissance cellulaire des cellules A431 par l anticorps nébulisé et l anticorps natif restaient équivalente. En conclusion, dans les conditions que nous avons testées, le nébuliseur à membrane semble être l appareil le plus approprié pour nébuliser la solution d anticorps utilisée comme modèle (le cetuximab). Celui-ci maintient en effet, les propriétés de l anticorps aérosolisé tout en limitant la formation d agrégats et en créant des particules d aérosol compatibles à un dépôt pulmonaire efficace. Pour la première fois, nous avons démontré qu un anticorps thérapeutique anti-cancéreux, à travers l exemple du cetuximab, pouvait résister aux contraintes imposées par la nébulisation, tout en mettant en avant l importance du choix du mécanisme de nébulisation. 75

81 Résultats I Cette étude est décrite dans l article ci-après : Maillet A, Congy-Jolivet N, Le Guellec S, Vecellio L, Hamard S, Courty Y, Courtois A, Gauthier F, Diot P, Thibault G, Lemarie E and Heuze-Vourc'h N. Aerodynamical, Immunological and Pharmacological Properties of the Anticancer Antibody Cetuximab Following Nebulization. Pharm Res (2008) 25 (6) :

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91 PARTIE II Biodistribution, pharmacocinétique et efficacité du cetuximab administré par aérosol dans un modèle animal de tumeur broncho-pulmonaire

92 L utilisation d anticorps monoclonaux recombinants est en plein essor depuis quelques années dans le domaine de la cancérologie et montre des résultats très satisfaisants. Une dizaine d anticorps anti-tumoraux sont actuellement sur le marché et de nombreux autres en études cliniques ou pré-cliniques. L administration de ces nouveaux médicaments par voie pulmonaire dans le traitement du cancer broncho-pulmonaire n a, à ce jour, pas encore été explorée et apparaît pourtant très attractive. Après avoir démontré dans la partie I, à travers l exemple du cetuximab, que les anticorps thérapeutiques pouvaient résister aux contraintes physiques imposées par la nébulisation, nous avons évalué dans cette deuxième partie, l intérêt clinique d une aérosolthérapie d anticorps thérapeutiques dans le traitement du cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules. Pour cela, nous avons mis en place une étude pré-clinique chez l animal. Cette étape indispensable va permettre d estimer la faisabilité et la reproductibilité du mode d administration, ainsi que l absence de toxicité additionnelle de l anticorps et son efficacité par voie pulmonaire. Le chapitre suivant décrit l étude de l administration loco-régionale de cetuximab dans un modèle animal de tumeur broncho-pulmonaire. Les différentes étapes ont été de : - vérifier que la méthode d aérosolisation choisie permettait le maintien des propriétés immunologiques et pharmacologiques du cetuximab in vitro et un dépôt pulmonaire efficace chez l animal. - vérifier l absence de toxicité additionnelle de l anticorps quand il était administré par voie pulmonaire chez la souris. - établir un modèle murin de tumeur pulmonaire sensible à l anticorps. - étudier la biodistribution et la pharmacocinétique du cetuximab administré par différentes voies en utilisant le modèle animal. - étudier l efficacité anti-tumorale du cetuximab par aérosol dans le modèle animal. 87

93 Matériels et Méthodes

94 Figure 24 : Photographie du Microsprayer TM IA-1C long (gauche) et de son utilisation pour une administration endotrachéale chez la souris (droite).

95 Matériels et Méthodes II I- Etudes in vitro - Validation de l aérosolisation du cetuximab. I.1- Préparation du cetuximab. I.1a- Concentration du cetuximab. Le cetuximab ou Erbitux (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) est fourni en solution aqueuse neutre (tampon phosphate de sodium (PBS) contenant 10 mm de phosphate de sodium et 145 mm de chlorure de sodium) à une concentration de 2 mg/ml. Afin de limiter la dénaturation de l anticorps, le cetuximab a été concentré passivement à l aide d une membrane Vivapore (Vivascience, Germany) dont le cut-off est de 7.5 kda, de façon à avoir une concentration finale de 44 mg/ml. La concentration protéique a été estimée à l aide du kit «BCA Protein Assay» (Pierce, Rockford, USA), en suivant les recommandations du fournisseur. Cette méthode combine la réaction du biuret (réduction des ions de Cu 2+ en Cu 1+ par les protéines) avec la chélation par les ions Cu 1+ de l acide bicinchoninique conduisant à une coloration violette des solutions protéiques (Smith et al., 1985). Pour étudier l impact de la concentration sur les propriétés du cetuximab, des études in vitro ont été réalisées. Pour cela, le cetuximab concentré a été redilué après concentration dans du PBS 1X pour rapporter sa concentration à 2 mg/ml. I.1b- Nébulisation du cetuximab. Le cetuximab a été aérosolisé à l aide d un Microsprayer TM long (IA-1C, Penn- Century Inc., USA) ajusté à une seringue haute pression FMJ-250 (Penn-Century). Ce système permet une administration de l aérosol chez la souris directement dans la trachée (Figure 24). Après nébulisation, la solution de cetuximab a été observée au microscope optique pour évaluer la formation d agrégats protéiques (Axiovert 25, Zeiss, Germany). 90

96 Matériels et Méthodes II I.2- Culture cellulaire. La lignée A431 (ATCC : CRL 1555) est une lignée adhérente de cellules issues d un carcinome épidermoïde cutané d origine humaine. Ces cellules surexpriment constitutivement l EGFR et représentent la lignée de référence pour les études sur le cetuximab (Saleh et al., 1999 ; Matar et al., 2004). Les cellules ont été cultivées dans un incubateur à 37 C, dans une atmosphère humide contenant 5% de CO 2 dans l air. Le milieu de culture RPMI-Glutamax concentré en glucose (Roswell Park Memorial Institute Medium ; 4500 mg/ml de glucose, Invitrogen) était additionné de 10% de sérum de veau fœtal (SVF, Invitrogen), de pénicilline à 100 U/mL et de streptomycine à 100 µg/ml (Invitrogen). I.3- Cytométrie en flux. La reconnaissance de l EGFR par le cetuximab natif, concentré ou aérosolisé par le microsprayer a été analysée par cytométrie en flux en utilisant les cellules A431 comme décrit précédemment (cf partie I). I.4- Prolifération cellulaire. L inhibition de la prolifération des cellules A431 par le cetuximab natif ou aérosolisé par le microsprayer a été étudiée de la même façon que dans la partie I. I.5- Western-blot. L inhibition de la phosphorylation de l EGFR par le cetuximab natif ou aérosolisé par le microsprayer a été étudiée en utilisant les cellules A431 comme décrit précédemment (cf partie I). 91

97 Matériels et Méthodes II II- Etudes in vivo. Les études in vivo ont été réalisées au Centre d Imagerie du Petit Animal (CIPA) d Orléans dirigé par le Professeur Alain Le Pape et à l INRA de Nouzilly dans le laboratoire du Docteur Serge Bernard. II.1- Protocoles. II.1a- Ethique. Les différentes études de ce projet ont fait l objet d une demande d autorisation auprès du CREEA Centre (Comités Régionaux d'ethique en Matière d'expérimentation Animale). Les protocoles ont tous été acceptés par le comité d éthique régional et les expérimentations ont été faites dans le respect des règles d éthique et de bien être des animaux. L état de santé des animaux a été suivi tout au long des expérimentations et les souris ont été euthanasiées si leur état de santé l exigeait. II.1b- Souris. Les souris BALB/c et BALB/c Nude femelles âgées respectivement de 5 et 4 à 5 semaines ont été obtenues auprès de Charles River Laboratories, Paris, France. Cinq à dix animaux ont été placés par cage dans des portoirs ventilés afin de respecter le statut sanitaire et, nourris avec des granules humidifiés. Deux semaines ont été laissées aux animaux pour s acclimater au nouvel environnement avant chaque expérimentation. II.1c- Sacrifices / euthanasie. Les souris ont été sacrifiées par élongation cervicale après une anesthésie par un mélange air/isoflurane 2%. Pour la caractérisation des tumeurs pulmonaires, les poumons ont été récupérés après ligature et section haute de la trachée. Le formol injecté dans les poumons permet d éviter le collapsus des alvéoles. Les pièces autopsiques ont été placées dans du formol pendant 48h puis dans de l éthanol 70% et adressées au laboratoire Novaxia qui a réalisé les analyses histologiques. 92

98 Matériels et Méthodes II II.2- Technique d aérosolisation. La méthode d aérosolisation a été modifiée d après la procédure décrite par Bivas- Benita (Bivas-Benita et al., 2005). Brièvement, la souris a été anesthésiée avec un mélange de kétamine/xylazine en injection intra péritonéale. Une fois endormie, elle a été suspendue sur le dos par la mâchoire supérieure sur une table inclinée à 45 C. La mâchoire a été ouverte à l aide d un otoscope (Hallowell EMC, Pittsfield, USA) et la langue délicatement dégagée à l aide d une spatule. L otoscope muni d une source de lumière, a permis de maintenir la gueule ouverte et de visualiser la trachée. Une fois la trachée visible, l extrémité du microsprayer a été insérée dans la trachée et le spray injecté au niveau pulmonaire. Immédiatement après l administration la souris a été ôtée du support et sa température corporelle maintenue par une source de chaleur jusqu à son réveil. Le Technetium 99m (Tc 99m ), un traceur radioactif, a été ajouté à la solution pour contrôler la qualité du dépôt d aérosol dans l appareil respiratoire. Les imageries scintigraphiques ont été effectuées avec un Gamma Imager (Biospace Mesures, France) ou une gamma caméra OPTI-CGR avec un temps d acquisition de 60 secondes. II.3- Toxicité du cetuximab administré par aérosol chez la souris. II.3a- Traitement des souris. Les souris BALB/c ou BALB/c Nude ont été réparties en quatre groupes de 10 souris et traitées sur cinq semaines avec différents traitements : - 2 mg de cetuximab administré par voie intra péritonéale (i.p.) : 1 mg dans 100 µl administré deux fois par semaine. Ce groupe correspond au traitement décrit classiquement dans la littérature (Masui et al., 1984 ; Goldstein et al., 1995 ; Matar et al., 2004). - 1 mg de cetuximab administré par aérosol : 1 mg de cetuximab additionné de Technetium 99m dans 50 µl administré une fois par semaine. - 2 mg de cetuximab administré par aérosol : 2 mg de cetuximab additionnée de Technetium 99m dans 50 µl administré une fois par semaine µl de PBS additionné de Technetium 99m administré par aérosol une fois par semaine (groupe témoin). 93

99 Matériels et Méthodes II Le cetuximab provenait d une solution concentrée 22 fois. Si nécessaire des dilutions ont été faîtes avec du PBS 1X (Invitrogen). Immédiatement après la nébulisation, une image scintigraphique a été effectuée. La répartition de l aérosol a été déterminée grâce aux intensités scintigraphiques retrouvées au niveau des différentes parties des voies respiratoires des animaux. Ces intensités ont été rapportées en pourcentage de l activité totale. II.3b- Suivi des souris, analyses hématologiques et histologiques post-mortem. Les souris ont été pesées avant les traitements puis une fois par semaine. Des prélèvements sanguins ont été effectués au niveau sublingual avant traitement, à la troisième semaine et avant sacrifice. Le sang a été récupéré dans des tubes BD microtainer TM (BD Biosciences, Bedford, USA) recouverts d EDTA et les paramètres hématologiques analysés à l aide de l appareil ScilVetABC (Scil, France). Les variations de poids et d hémogrammes ont été comparées entre les différents groupes de souris entre le premier jour et le 42 ème jour de l expérience. Les souris ont été sacrifiées après les cinq semaines de traitement. Les poumons, la trachée, les reins, la rate, l estomac, la peau, le foie et le colon ont été prélevés, fixés et adressés à un anatomo-pathologiste (I. Valo, CHU d Angers ou D.-H. Douvin, laboratoire Novaxia, Saint Laurent Nouan selon les expérimentations) pour une analyse histologique. 94

100 Figure 25 : Image radiologique du positionnement du cathéter avant injection intrabronchique de cellules A431 chez une souris BALB/c Nude Figure 26 : Image scintigraphique du dépôt des cellules A431 additionnées de Tc 99m chez une souris BALB/c Nude

101 Matériels et Méthodes II II.4- Mise en place d un modèle animal de tumeur broncho-pulmonaire ectopique sensible au cetuximab. II.4a- Préparations cellulaires. Pour déterminer les conditions optimales d obtention de tumeurs pulmonaires profondes chez l animal, la suspension cellulaire injectée en intrabronchique a été préparée dans différentes conditions (concentration variable et utilisation d adjuvants ou non) : Concentrations cellulaires : 2, ou de cellules A431 Adjuvants : - BD TM PuraMatrix TM Peptide Hydrogel (BD Biosciences) à 3 mg/ml. L hydrogel est une matrice synthétique constituée d acides aminés standards et de 99% d eau (Holmes et al, 2000). Il crée un microenvironnement en trois dimensions pour la croissance de cellules in vitro et in vivo. - EDTA (acide éthylène-diamine-tétraacétique) à 10 mm (Kang et al., 2006). - EDTA à 10 mm avec du Matrigel TM Basement Membrane Matrix (BD Biosciences) à 4 mg/ml. Le Matrigel est une préparation extraite du sarcome murin Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) contenant différents facteurs de croissance et protéines de matrice extracellulaire. Il a été décrit comme permettant la prolifération cellulaire in vitro (Taniguchi et al., 1989) et la croissance tumorale in vivo (Staudt et al., 2004). II.4b- Administrations intrabronchiques. L administration de cellules en intrabronchique a été réalisée selon le document de référence IM-DRF-005 interne au service d imagerie du CIPA (Centre d Imagerie du Petit Animal) d Orléans, de la façon suivante : La souris a été anesthésiée à l aide du mélange xylazine/kétamine. Une incision dans la peau est faite au niveau de la trachée et celle-ci a été dégagée à l aide des pinces. Une ouverture y a été opérée et un cathéter souple introduit dans la trachée. La position du cathéter a été contrôlée par radiographie X à haute résolution basse énergie en utilisant un générateur Faxitron MX20 (Faxitron X-Ray LLC, Wheeling, USA) (Figure 25). Un volume de 25 µl de cellules A431 a été injecté progressivement dans les poumons. Le Tc 99m a été ajouté à la préparation cellulaire pour s assurer d un dépôt pulmonaire satisfaisant. Une fois l injection finie, le cathéter a été ôté et une image scintigraphique effectuée avec un Gamma Imager 96

102 Matériels et Méthodes II (Biospace Mesures) (Figure 26). Le plan cutané de la souris a été recousu et la température corporelle de l animal maintenue par une source de chaleur jusqu à son réveil. Les inductions tumorales ont duré de 6 à 8 semaines. II.4c- Suivi de la croissance tumorale. II.4c α- Tomodensitométrie thoracique. La tomodensitométrie thoracique (ou scanner thoracique) est une technique d'imagerie médicale qui consiste à réaliser une reconstruction 3D du tissu pulmonaire. L appareil utilisé dans cette étude a été l explore Locus (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK), il balaie l animal par un faisceau de rayons X et l analyse tomographique permet in fine la reconstruction 3D du tissu. La présence on non de tumeur pulmonaire chez les souris induites a été évaluée par tomodensitométrie thoracique 3 et 5 semaines après l induction en utilisant l explore Locus (General Electric). II.4c β- Analyse histologique. Les souris ont été sacrifiées après 6 semaines d induction tumorale, les poumons prélevés et fixés. La localisation et la taille des tumeurs ont été détaillées pour chaque souris et comparées aux résultats obtenus par tomodensitométrie thoracique. II.4d- Sensibilité du modèle vis-à-vis du cetuximab. Une fois les conditions optimales d obtention de tumeurs broncho-pulmonaires établies, une étude pour évaluer la sensibilité du modèle vis-à-vis du cetuximab a été réalisée. La présence de tumeurs thoraciques a été analysée par scanner thoracique chez des souris BALB/c Nude après 3 semaines d induction tumorale. Les souris présentant une tumeur intrabronchique ont été traitées par voie intrapéritonéale avec 2 fois 1 mg de cetuximab ou avec du PBS 1X pour le lot témoin pendant 3 semaines. Un second scanner a été effectué à la fin du traitement, la localisation et la taille des tumeurs ont été détaillées pour chaque souris. Les souris ont été sacrifiées et les pièces autopsiques ont été analysées histologiquement. Les données histologiques ont été comparées aux résultats obtenus par scanner thoracique. 97

103 II.5- Biodistribution du cetuximab administré par aérosol. Matériels et Méthodes II II.5a- Marquage du cetuximab avec le Xenofluor-750. Le Xenofluor-750 est un fluorophore dont la longueur d onde d excitation se situe à 750 nm et la longueur d onde d émission à 780 nm. Le marquage du cetuximab a été réalisé avec le kit de marquage XenoFluor 750 Fluorescent Dye Kits for In Vivo Imaging (Caliper Life Sciences, USA) selon les recommandations du fournisseur. Brièvement, 1 ml de cetuximab à 2 mg/ml a été tamponné avec 100 µl de bicarbonate de sodium 0,1 M ph 8,3 afin de faciliter la réaction entre l ester de succinimidyl présent sur le Xenofluor-750 et les groupements amines du cetuximab. Le cetuximab a ensuite été transféré dans un tube contenant du Xenofluor-750 et le mélange incubé à 4 C pendant toute la nuit sous une agitation douce. Le cetuximab-xenofluor-750 a ensuite été purifié par chromatographie d exclusion en utilisant la matrice et la colonne fournies dans le kit. L absorbance à 280 nm (A 280 ) et à 749 nm (A 749 ) du conjugué purifié a permis de déterminer la concentration du cetuximab-xenofluor-750 et le nombre de molécules de Xenofluor-750 par molécules de cetuximab selon les formules respectives : - Concentration protéique = [A 280 (A 749 x 0,04)] x facteur de dilution 2, Nombre de molécules de Xenofluor-750 = A 749 x facteur de dilution. 2, x concentration protéique (M) II.5b- Analyse de l affinité du cetuximab-xenofluor-750 pour l EGFR. Cette analyse a eu pour but de comparer l affinité du cetuximab-xenofluor-750 et celle du cetuximab natif vis-à-vis de l EGFR des cellules A431. Pour cela, nous avons réalisé un test de compétition entre le cetuximab-fitc (Iso Thio Cyanate de Fluoresceine) et le cetuximab-xenofluor-750 ou le cetuximab natif. Cent mille cellules A431 ont été incubées avec du cetuximab non marqué ou du cetuximab-xenofluor-750 à différentes concentrations : 0 µg/ml, 0,1 µg/ml, 0,3 µg/ml, 1 µg/ml, 3 µg/ml, 10 µg/ml, 30 µg/ml, 100 µg/ml et 300 µg/ml pendant 30 minutes à 4 C. 98

104 Matériels et Méthodes II Puis le cetuximab, couplé au FITC, a été ajouté à la solution pour obtenir une concentration finale de 1 µg/ml. Le mélange est incubé 30 minutes à 4 C, puis lavé avec 1 ml de PBS. La lumière émise par le cetuximab-fitc associé aux cellules a été mesurée à l aide d un cytomètre en flux EPICS XL en utilisant le logiciel Expo32 software (Beckman Coulter Inc, USA). II.5c- Etude de la biodistribution du cetuximab par imagerie infrarouge. II.5c α- Principe de l imagerie infrarouge. L'imagerie optique de fluorescence infrarouge repose sur l injection d une molécule fluorescente à un organisme vivant, où le fluorophore utilisé possède la caractéristique d'être excité à des longueurs d'ondes situées dans le proche infrarouge (qui pénètrent relativement profondément dans les tissus) et d émettre dans cette même gamme. Ce fluorophore restitue l'énergie absorbée, lors d'une excitation lumineuse optimale, sous la forme d'un rayonnement (d'émission) de longueur d'onde spécifique (supérieure à celle d'excitation, car de moindre énergie). Ce rayonnement est émis pendant une durée qui définit le temps nécessaire au retour à l'état fondamental de la molécule excitée (temps de relaxation). Il est ainsi possible de caractériser la fluorescence d'une molécule soit par la mesure de son spectre d'émission, soit par la mesure de son temps d'émission de fluorescence. L inconvénient majeur de l imagerie optique de fluorescence est lié à certaines molécules constitutives de l'organisme qui sont «naturellement» fluorescentes et dont l excitation provoque une autofluorescence pouvant gêner l interprétation des images. Travailler dans l infrarouge permet cependant de diminuer ce phénomène. L imagerie de fluorescence a été réalisée sur un appareil Ivis Lumina (Caliper Life sciences, USA) dont les paramètres d acquisition étaient les suivants : mode Fluorescence par réflectance, filtres: Ex : ICG ( nm) Em : ICG ( nm) Bkg : ICGbkg ( nm), réglages: binning medium et large FOV D. Pour éviter que l animal ne bouge durant l acquisition des images, il a été anesthésié avec de l isoflurane gazeux à 2% dans l air. Les images ont été traitées afin de soustraire l autofluorescence des tissus biologiques. Le temps d exposition a été ajusté en fonction du signal émis et variait entre 1 et 20 secondes. 99

105 Matériels et Méthodes II II.5c β- Capacité du cetuximab-xenofluor-750 à fixer les cellules A431 in vivo. Après 6 semaines d induction tumorale, une souris BALB/c Nude ayant été injectée en sous-cutanée avec 2, de cellules A431 en présence de Matrigel à 4 mg/ml, a reçu 72.5 µg de cetuximab-xenofluor-750 par administration intraveineuse (i.v.). La fluorescence au niveau de la tumeur a été évaluée par imagerie infrarouge 20 heures après l administration de cetuximab-xenofluor-750. II.5c γ- Biodistribution du cetuximab administré par différentes voies. Sept semaines après l induction intrabronchique des tumeurs, les souris ont été réparties de façon aléatoire en différents groupes et ont reçu entre 60 et 80 µg de cetuximab- Xenofluor-750 (selon les expériences) administrés par voie i.p., i.v. dans la veine de la queue, ou inhalée. La distribution du cetuximab dans l organisme a été analysée par imagerie infrarouge in vivo à t = 20min, t = 1h, t = 8h, t = 24h, t = 48h, et t = 72h et ex vivo au niveau pulmonaire après sacrifice des animaux. Puis, une étude histologique a été pratiquée sur les poumons fixés pour déterminer les caractéristiques des tumeurs pulmonaires. La qualité du cetuximab retrouvée dans les poumons 48h après une administration pulmonaire ou i.v. a également été évaluée. Pour cela, après le sacrifice des animaux, les poumons prélevés ont été congelées dans l azote liquide. Des coupes de µm d épaisseur ont été préparées à partir des tissus congelés à l aide d un cryostat (Cryotome Special Motorized Electronic, Thermo Electron Corporation, Cergy-Pontoise, France) puis placées dans des tubes avant l extraction protéique. Les tissus ont été lysés avec un tampon RIPA (Tris-HCl 50 mm, ph 7.4, NP-40 1%, sodium deoxycholate 0.25%, NaCl 150 mm, EDTA 1 mm) additionnés d un cocktail d inhibiteurs de protéases puis, les protéines pulmonaires ont été récupérées dans le surnageant après centrifugation à g pendant 15 min à 4 C. Les protéines ont ensuite été séparées par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 10 % selon la technique SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis). La migration a été réalisée en présence de Tris 25 mm, de glycine 250 mm et de SDS à 0,05 %, à 80 Volts pour le gel de concentration et à 110 Volts pour le gel de séparation. 100

106 Matériels et Méthodes II Après la migration, les protéines ont été électro-transférées pendant 1h30 à 70 Volts, sur une membrane de PVDF (Polyvinylidene fluoride, Millipore, Guyancourt, France) préhumidifiée dans du méthanol à 100 %. Ce transfert a été réalisé en présence d un tampon contenant de la glycine à 39 mm, du Tris à 48 mm, du SDS à 0,037% et 20% d éthanol. Les sites de fixation non spécifiques des membranes ont été bloqués pendant 1 heure à température ambiante avec du TBS contenant 0,1% de Tween 20 (Tris 20 mm ph 7.5, NaCl 500mM) et 5% de lait en poudre. La membrane a ensuite été mise en contact avec un anticorps secondaire anti-igg humaines couplé à une peroxydase reconnaissant les chaines lourdes et légères (Jackson ImmunoResearch, Newmarket, UK) dilué au 1/ ème pendant 1h à température ambiante sous agitation douce. Après 3 lavages de 10 minutes avec du TBS contenant 0,1% de Tween 20 à température ambiante, l activité peroxydasique des complexes immuns formés a été révélée en utilisant le kit SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific, Rockford, USA) conformément au protocole du fournisseur. II.6- Pharmacocinétique du cetuximab administré par aérosol. II.6a- Administration du cetuximab-xenofluor750 TM. Sept semaines après inoculation tumorale, les souris ont reçu 72,5 µg de cetuximab- Xenofluor par deux voies d administration : sept souris par voie intraveineuse dans un volume de 200 µl et sept autres par voie inhalée dans un volume de 50 µl. Le cetuximab marqué a été suivi par imagerie en fluorescence à t = 2h, t = 8h, t = 24h, t = 48h, t = 72h, t = 7j et t = 15j après administration. II.6b- Prélèvements sanguins. Des prélèvements sanguins d environ 50 µl ont été réalisés au niveau mandibulaire au temps t = 0h, t = 2h, t = 8h, t = 24h, t = 48h, t = 72h, t = 7j et t = 15j après administration du cetuximab-xenofluor. Ils ont été réalisés avant chaque examen d imagerie à l exception du t = 0h qui a été effectué la veille de l administration de l anticorps afin que les souris n aient pas de sang dans la bouche au moment de l administration de l aérosol. 101

107 Matériels et Méthodes II Les prélèvements sanguins ont été recueillis dans des tubes BD microtainer TM (BD Biosciences) contenant de l EDTA puis centrifugés afin d obtenir le plasma. II.6c- Dosage du cetuximab. II.6c α- Principe et procédure. Le dosage du cetuximab a été effectué par la technique ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). L antigène cible utilisé pour le dosage est une forme recombinante du domaine extracellulaire de l EGFR humain (EGFR-ECD404SG) produite dans la lignée de cellules humaines HEK293 et purifiée du milieu de culture par chromatographie d affinité. Brièvement, 125 ng d EGFR-ECD404SG ont été fixés au fond des puits d une plaque 96 puits dans un tampon de carbonate-bicarbonate 1 N, ph 9.6 et les plaques incubées une nuit à 4 C. Les puits ont ensuite été rincés avec du PBS additionné de Tween 20 à 0.05 % et les sites de fixation non spécifique bloqués avec un tampon PBS-BSA pendant 2h à température ambiante. Après un nouveau lavage, les standards (solution de cetuximab à 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 5, 10, 20 et 30 µg/ml), les contrôles de qualité (CQ) qui permettent de valider le dosage (cetuximab à 0.75, 7.5 and 15 µg/ml) et les échantillons dilués au 1/100 ème dans une solution de PBS-BSA ont été ajoutés dans les puits. Après une incubation d 1 h à température ambiante, 100 µl d une solution de F(ab ) 2 anti-igg humaines couplé à la peroxydase ont été ajoutés à chaque puits et les plaques incubées 1h. Cent µl de substrat peroxydase OPD (FAST-orthophenylendiamine dihydrochloride) ont ensuite été ajoutés à chaque puits, puis la réaction stoppée avec 50 µl d acide sulfurique 4 N. Les lectures ont été effectuées à 492 nm et 620 nm à l aide de l appareil iems ELISA (Thermo Labsystems, Issy les Moulineaux, France). Les contrôles et échantillons ont été déposés en duplicats et la moyenne de l ensemble des valeurs calculées. II.6c β- Validation du dosage. Les CQ ont été analysés 5 fois le même jour (étude intra-jour) et 5 fois à des jours différents (étude inter-jour). Les coefficients de variation ont été calculés pour ces deux études. 102

108 Matériels et Méthodes II II.6d- Analyse pharmacocinétique. Les concentrations plasmatiques de cetuximab obtenues après administration pulmonaire et intraveineuse ont été étudiées à la fois par analyse non compartimentale et par analyse compartimentale. Dans le cadre de l analyse non compartimentale, les aires sous la courbe des concentrations de cetuximab en fonction du temps (ASC) ont été calculées ainsi que la fraction absorbée (F), qui quantifie la biodisponibilité du médicament après administration par voie pulmonaire. Le temps d absorption moyen du cetuximab (mean absorption time, MAT), correspond au temps moyen nécessaire à une molécule de cetuximab inhalée pour rejoindre le compartiment sanguin et permet de quantifier la vitesse d absorption. Ce temps a été calculé par : MAT = MRT aerosol MRT i.v. où MRT est le temps de résidence moyen (mean residence time) du cetuximab dans l organisme après l administration. La modélisation pharmacocinétique compartimentale a été réalisée par approche de population à l aide du logiciel WinNonMix Professional (Pharsight, Mountain View, USA). La meilleure description des concentrations de cetuximab au cours du temps a été obtenue grâce à un modèle bicompartimental avec absorption d ordre 1. L analyse compartimentale a permis d estimer les paramètres pharmacocinétiques du cetuximab : constante d absorption, clairance centrale et inter-compartimentale, volumes de distribution, ainsi que les demi-vies de distribution et d élimination. II.7- Efficacité du cetuximab administré par aérosol. Après 8 semaines d induction tumorale, des souris Balb/c Nude ont été reparties en deux groupes : un groupe contrôle non traité (4 souris) et un groupe traité par aérosol avec 2 mg de cetuximab + Tc 99m une fois par semaine pendant 3 semaines (5 souris). Les souris ont été sacrifiées à la fin des 3 semaines de traitement et une analyse histologique effectuée sur les prélèvements pulmonaires. III- Statistiques. Les résultats des figures 29 (page 110) et 33 (page 117) et du tableau 8 (114) sont exprimés en médianes calculées sur l ensemble des valeurs. Les données issues de l étude in 103

109 Matériels et Méthodes II vitro d inhibition de la croissance des cellules A431 par le cetuximab aérosolisé et de l étude de toxicité ont été analysées par un test de Kruskal et Wallis. Pour ces différents tests, une probabilité inférieure ou égale à 0,05 (p 0,05) a été considérée comme statistiquement significative. 104

110 Résultats

111 Figure 27 : Différentes méthodes pour administrer un aérosol chez le rongeur. (a) administration intratrachéale, (b) administration orotrachéale, (c) aérosol par intubation chez le rat, (d) chambre d inhalation, d après Sakagami 2006.

112 Résultats II I- Validation de l aérosolisation du cetuximab par le Microsprayer TM. Une méthode couramment employée pour l administration d aérosol chez les rongeurs est la chambre d inhalation. Ce système non-invasif engendre une bonne distribution de l aérosol dans les poumons mais limite la quantité de médicament déposée dans les voies respiratoires (pertes de la solution dans la chambre d inhalation, sur les poils, dans le museau ou la bouche de l animal). Ceci représente un inconvénient majeur quand on souhaite comparer différentes voies d administration pour un médicament car la quantité qui atteint les poumons ne peut être définie. Une méthode alternative, que nous avons choisie pour cette étude, est l administration endotrachéale (orotrachéale ou intratrachéale) (Figure 27). Celle-ci permet une application directe de la solution au niveau des poumons tout en limitant les pertes au niveau des voies aériennes supérieures ; la dose injectée est quantifiable, l administration relativement rapide et le coût raisonnable (Patton et al., 2004 ; Bivas-Benita et al., 2005 ; Cryan et al., 2007). Dans notre projet, visant à nébuliser le cetuximab chez la souris, le dispositif utilisé pour l administration endotrachéale a été le Microsprayer TM. Il permet de générer un aérosol de médicament en solution et de le déposer au niveau des voies respiratoires inférieures de l animal suite à une administration dans la trachée. La validation de l aérosolisation du cetuximab par le Microsprayer TM s est faite en deux temps : - premièrement, nous avons vérifié par des études in vitro que l anticorps gardait ses propriétés immunologiques et pharmacologiques après aérosolisation. - deuxièmement, nous avons vérifié chez l animal, l efficacité du dépôt pulmonaire du cetuximab administré par le Microsprayer TM et l absence de toxicité additionnelle de l anticorps par aérosol. 107

113 Résultats II vitro. I.1- Validation de l aérosolisation du cetuximab par le Microsprayer TM in Comme le volume maximum pouvant être administré par voie pulmonaire chez la souris est de 50 µl et, que la quantité de cetuximab à injecter est de quelques milligrammes (ce qui correspond à environ 1 ml), la solution de cetuximab commercial a dû être concentrée 22 fois. Cependant, la concentration tout comme la nébulisation d un médicament est un processus qui peut entraîner une agrégation ou une détérioration des principes actifs présents dans la solution. Il a donc été nécessaire avant d envisager une administration chez l animal de vérifier l effet de l aérosolisation et de la concentration sur les propriétés du cetuximab. Pour vérifier que, ni la concentration, ni la nébulisation par le Microsprayer TM n altéraient les propriétés du cetuximab, une méthodologie similaire à celle de la partie I a été utilisée. Dans un premier temps, une analyse par microscopie optique de la solution concentrée et/ou aérosolisée a été effectuée. Puis, des études in vitro ont été mises en place pour évaluer les propriétés de l anticorps après aérosolisation et/ou nébulisation : capacité de l anticorps à reconnaître l EGFR, maintien de son affinité pour le récepteur, capacité à inhiber la phosphorylation du récepteur et à inhiber la croissance des cellules A431. I.1a- Effet de la nébulisation par le Microsprayer TM et de la concentration sur la solution de cetuximab. Les solutions concentrées et/ou nébulisées de cetuximab ont été observées par microscopie optique afin de déterminer la présence éventuelle d agrégats dans la solution. Cette analyse n a pas révélé d agrégation de la molécule de cetuximab après concentration et/ou nébulisation avec le Microsprayer TM. 108

114 Résultats II I.1b- Reconnaissance et affinité pour l EGFR du cetuximab concentré ou aérosolisé par le Microsprayer TM. La reconnaissance de l EGFR par le cetuximab aérosolisé ou concentré a été comparée à celle de l anticorps natif par une étude de cytométrie en flux en utilisant les cellules A431 qui sur-expriment ce récepteur. Les résultats, présentés figure 28, montrent que les intensités de fluorescence moyennes correspondant aux cellules incubées avec le cetuximab natif (39,7) ou nébulisé avec le Microsprayer TM (40,6) sont proches. Des résultats similaires ont été obtenus avec le cetuximab concentré (figure non présentée). La reconnaissance de l EGFR par le cetuximab concentré ou aérosolisé avec le Microsprayer TM n est donc pas modifiée par la nébulisation. Nombre relatif de cellules Cetuximab natif 39,7 Cetuximab nébulisé 40,6 Log de l intensité de fluorescence Log de l intensité de fluorescence Figure 28 : Reconnaissance de l EGFR par le cetuximab après nébulisation. Les cellules A431 ont été incubées avec 10 µg/ml de cetuximab ou de contrôle isotypique pendant 1h. Après rinçage, elles ont été mises en présence d un F(ab )2 anti-igg humaines couplé au FITC pendant 30 minutes, lavées et enfin analysées par cytométrie en flux. En gris, sont représentés les histogrammes correspondants au traitement avec le contrôle isotypique et en noir avec le cetuximab. L intensité de fluorescence moyenne est indiquée en haut à droite des histogrammes. L affinité de l anticorps aérosolisé ou concentré a également été évaluée, elle est similaire à celle de l anticorps natif (résultats non présentés). 109

115 Résultats II I.1c- Inhibition de la prolifération cellulaire par le cetuximab concentré ou aérosolisé par le Microsprayer TM. Le cetuximab a la propriété d inhiber la croissance des cellules exprimant l EGFR in vitro (Albanell et al., 2001). La figure 29 illustre la réduction de la prolifération des cellules A431 après incubation avec du cetuximab natif ou aérosolisé. Quelle que soit la forme de cetuximab utilisée, on observe une réduction de la prolifération d environ 45% indiquant que le cetuximab garde un effet anti-prolifératif après aérosolisation. Des résultats similaires ont été obtenus avec le cetuximab concentré (figure non présentée). Croissance des A431 (%) ns Témoin Cetuximab natif Cetuximab nébulisé Traitement Figure 29 : Effet du cetuximab nébulisé sur la croissance des cellules A cellules A431 ont été incubées avec 50 µg/ml de cetuximab pendant 48h puis comptées à l aide d une cellule de Malassez. Les résultats sont exprimés en pourcentage, par rapport à la croissance relative du groupe témoin et représentent les médianes de trois expériences. Points : p<0.025 par rapport au témoin. 110

116 Résultats II I.1d- Inhibition de la phosphorylation de l EGFR par le cetuximab aérosolisé par le Microsprayer TM. La fixation du cetuximab sur l EGFR prévient la liaison de ses ligands naturels (Yoshida et al., 2008), inhibant ainsi la phosphorylation du récepteur et au final la transduction du signal intracellulaire. Dans cette étude, nous avons évalué la capacité du cetuximab nébulisé à inhiber la phosphorylation de l EGFR. La figure 30 montre que le cetuximab natif et le cetuximab aérosolisé limitent de façon similaire la phosphorylation de l EGFR induite par l EGF dans les cellules A431. L anticorps aérosolisé par le Microsprayer TM conserve donc sa capacité à interférer avec la voie de signalisation de l EGFR. anti-egfr phosphorylé anti-egfr Figure 30 : Inhibition de la phosphorylation de l EGFR par le cetuximab après nébulisation cellules A431 ont été incubées avec 50 µg/ml de cetuximab pendant 24h puis avec 10 ng/ml d EGF recombinant pendant 10 min et finalement lysées. Les protéines des lysats cellulaires ont été séparées en SDS-PAGE dans des conditions réductrices et dénaturantes. L EGFR a été immuno-détecté après transfert des protéines sur une membrane de PVDF avec un anticorps polyclonal anti-egfr total et un anticorps polyclonal anti-egfr phosphorylé. 1 : témoin, 2 : cetuximab natif, 3 : cetuximab nébulisé En conclusion : la concentration ou la nébulisation du cetuximab par le Microsprayer TM n entraînent pas d agrégation de la molécule. De plus, l anticorps concentré et/ou nébulisé par le Microsprayer TM conserve ses propriétés pharmacologiques et immunologiques in vitro. 111

117 Résultats II I.2- Validation de l aérosolisation du cetuximab par le Microsprayer TM in vivo : efficacité du dépôt pulmonaire de cetuximab et étude de sa toxicité par administration pulmonaire chez la souris. Le traitement des patients par perfusion de cetuximab peut engendrer diverses réactions d hypersensibilités pouvant inclure : un bronchospasme, de l urticaire et/ou une hypotension. De plus, une éruption acnéique pouvant aller jusqu au grade 3 est observé chez environ 80% des patients après traitement par le cetuximab et représente la toxicité systémique majeure du cetuximab. Ces effets indésirables entraînés par l administration de cetuximab chez l homme sont dus à l interaction de l anticorps avec sa cible, l EGFR. Le cetuximab ne reconnaissant pas l EGFR murin, les effets toxiques attendus chez les rongeurs sont donc limités. Une étude de toxicité du cetuximab effectuée chez le rat après administration intrapéritonéale ( n a révélé aucun effet de l anticorps sur : le poids des animaux, leur consommation de nourriture, les paramètres hématologiques et l état général des animaux. Cependant, la toxicité relative d un médicament étant dépendante de la voie d administration, il est important de vérifier qu une nouvelle modalité d administration n engendre pas d effets indésirables additionnels de la molécule. Pour ces raisons, nous avons mis en place une étude pour vérifier l absence de toxicité additionnelle du cetuximab administré par voie pulmonaire chez la souris. Cette étude a été réalisée en deux temps, tout d abord sur des souris BALB/c Nude puis sur des souris BALB/c. Ces deux souches de souris ont le même fond génétique. Les animaux ont été repartis en quatre groupes et ont reçu un traitement hebdomadaire de : 2 x 1 mg de cetuximab par voie i.p. (groupe 1), de 1 mg (groupe 2) ou 2 mg (groupe 3) de cetuximab additionné de Tc 99m par aérosol ou de PBS additionné de Tc 99m par aérosol (groupe 4). La dose de 2 mg est équivalente chez une souris de 25 g aux 250 mg/m 2 de cetuximab administrés en perfusion hebdomadaire chez l homme. Elle a été calculée selon les données du site de la façon suivante : Dose homme en mg/m 2 / coefficient Km homme = dose homme en mg/kg : 250/37 = 6,75 mg/kg Dose home en mg/kg * coefficient Km homme / coefficient animal Km = dose animal en mg/kg) : (6.75*37)/3 = 83,33 mg/kg 112

118 Résultats II Pour un animal de 25 grammes : * = 2.01 mg. Cette dose représente également la quantité couramment utilisée, d après la littérature, pour traiter des tumeurs A431 sous-cutanée par voie i.p. chez le petit rongeur (Masui et al., 1984 ; Goldstein et al., 1995 ; Matar et al., 2004). La dose de 1 mg correspond à la quantité maximum de cetuximab administrée en une seule injection. En général, les études de toxicologie avec des doses répétées chez les rongeurs s effectuent sur 4 à 5 semaines ; pour cette étude, un traitement de 5 semaines a été choisi pour évaluer la toxicité du cetuximab administré par voie pulmonaire. Les souris ont été suivies pendant les 5 semaines de traitement et une analyse histologique post-mortem a été effectuée sur divers organes. I.2a- Décès des animaux. Durant les deux premières semaines de traitement, nous avons constaté la perte de quelques animaux dans les minutes suivant l aérosolisation. I.2a α- Hémorragies liées au geste. Plusieurs des décès peuvent être attribués à une hémorragie massive suite à une blessure dans la gueule de l animal avec l otoscope ou le Microsprayer TM. I.2a β- Décès sans explication après analyse histologique. D autres décès ont été observés et n ont pas pu être expliqués par l analyse anatomopathologique post-mortem. Nous pensons qu ils sont principalement dus à l obstruction de la trachée par le Microsprayer TM qui, si elle est prolongée, aboutit à un arrêt respiratoire et cardiaque de l animal. Par ailleurs, les décès étant retrouvés dans des groupes traités au cetuximab par aérosol et non dans des groupes témoins, d autres raisons peuvent être mises en cause comme l administration de la molécule elle même qui pourrait entrainer (1) une réaction de première infusion ou (2) une réaction anaphylactique sévère comme cela est décrit dans certains cas chez l homme. Enfin, la pression exercée par l aérosol de microsprayer sur les parois des poumons pourrait également être incriminée. 113

119 Résultats II I.2b- Dépôts pulmonaires. Cette étude a également permis de démontrer que la méthode d aérosolisation choisie était satisfaisante et ainsi de valider la technique. En effet, les imageries scintigraphiques ont confirmé un dépôt pulmonaire pour 103 des 112 administrations avec le Microsprayer TM (Figure 31) ; dans les 9 autres cas, la radioactivité a été retrouvée au niveau de l œsophage et de l estomac. Le Microsprayer TM offre donc un dépôt pulmonaire efficace, comme le montre le tableau 8, avec en moyenne 78% du dépôt de cetuximab retrouvé au niveau des voies respiratoires inférieures de l animal et avec une distribution homogène de la solution dans les poumons. Figure 31 : Imagerie scintigraphique d un dépôt d aérosol dans les voies respiratoires d une souris BALB/c après administration avec le Microsprayer TM de cetuximab en présence d un traceur radioactif (Tc 99m ). L imagerie a été effectuée directement après l administration de l aérosol chez la souris avec une gamma caméra OPTI-CGR avec un temps d acquisition de 60 secondes. Localisation du dépôt Gueule Estomac Voies respiratoires inférieures % / dépôt total 11% 11% 78% Tableau 8 : Répartition des dépôts d aérosol dans les voies respiratoires des souris BALB/c après administration par le Microsprayer TM de PBS ou cetuximab en présence de Tc 99m. Les pourcentages de dépôt ont été obtenus grâce aux imageries scintigraphiques et représentent la médiane des résultats pour les 30 souris aérosolisées. 114

120 A B 100µm 50µm C D 50µm E 50µm F 50µm G 50µm H 25µm 50µm Figure 32 : Histologie de différents organes d une souris BALB/c traitée avec 2 mg de cetuximab par aérosol une fois par semaine pendant 5 semaines. A-foie, B-iléon, Cœsophage, D-peau, E-poumon, F-rate, G-rein, H-trachée

121 Résultats II II.2c- Suivi des animaux et analyse histologique post-mortem. Lors de la manipulation avec les BALB/c Nude, un nombre relativement important de décès a été observé dans les différents groupes ayant reçu un traitement par aérosol. Les populations n étant plus suffisamment importantes à la fin de l expérimentation pour faire des analyses statistiques, les résultats ne sont pas présentés. Les données présentées dans les figures 32 et 33 correspondent à l étude effectuée avec les souris BALB/c, de même fond génétique que les BALB/c Nude, et présentent des résultats comparables à l étude sur les souris immunodéficientes. Le suivi des souris pendant les cinq semaines de traitement n a pas mis en évidence de différences dans la prise de nourriture et la prise de poids des animaux entre les différents groupes. En effet, comme le montre la figure 33 A, les variations des poids entre la fin et le début du traitement ne sont pas significatives entre les différents groupes de souris avec des médianes de poids initiaux et finaux de 20 et 23,9 g pour le groupe 1, de 19,55 et 23 g pour le 2, de 19,3 et 22,9 g pour le 3 et de 19,4 et 22 g pour le 4. La figure 33 B et C, montre par ailleurs, une augmentation légère mais non significative du nombre de leucocytes et d erythrocytes circulants après le traitement des souris avec le cetuximab par voie systémique et pulmonaire (groupes 1, 2 et 3). Il est probable que la nature moléculaire du cetuximab engendre une légère réaction inflammatoire chez l animal. Cette analyse hématologique n a pas été effectuée chez les souris BALB/c Nude. Des études histologiques post-mortem ont été effectuées sur différents organes. Au niveau de l estomac, site où l on peut retrouver l anticorps après une ingestion du contenu buccal résiduel, aucune anomalie anatomopathologique n a été observée pour les prélèvements des différents groupes. Aucune toxicité n a par ailleurs été retrouvée au niveau des poumons, de la trachée, de l œsophage, des reins, de la rate, de la peau, du foie et du colon des animaux par le traitement au cetuximab après les cinq semaines de traitement (Figure 32). 116

122 Résultats II Figure 33 : Variation de poids et hémogramme des souris après cinq semaines de traitement au cetuximab par voie pulmonaire. Les souris BALB/c âgées de 8 semaines ont été traitées par des administrations de cetuximab ou de PBS pendant 5 semaines. Aérosol Tc : administration de PBS additionné de Tc 99m par aérosol une fois par semaine, Aérosol 1 mg : administration d 1mg de cetuximab additionné de Tc 99m par aérosol une fois par semaine, Aérosol 2 mg : administration de 2 mg de cetuximab additionné de Tc 99m par aérosol une fois par semaine, IP 2 mg : administration d 1 mg de cetuximab par i.p. deux fois par semaine. Les résultats représentent les médianes obtenues dans chaque groupe. Des tests de Kruskal et Wallis ont été réalisés pour comparer les variations de poids et de paramètres hématologiques dans les différents groupes. Les résultats des groupes traités au cetuximab ont été comparés avec le groupe Aérosol Tc, les différences ne sont pas significatives. 5 Différence de poids des souris entre J1 et J42 (g) Aérosol Tc Aérosol 1mg Aérosol 2mg IP 2mg A- Le poids des souris a été relevé au début (J1) et à la fin des traitements (J42) et la différence de poids calculée pour chaque souris. Leucocytes (bleu) Erythrocytes (jaune) Quantité de leucocytes et d érythrocytes à J42 (nb/mm 3 ) Aérosol Tc Aérosol 1mg Aérosol 2mg IP 2mg B- Hémogramme complet des souris à la fin des traitements (J42), données issues d une analyse à l aide de l appareil ScilVetABC. 117

123 Résultats II % des différents types de leucocytes à J Aérosol Tc Aérosol 1mg Aérosol 2mg IP 2mg % lymphocytes % monocytes % granulocytes C- Pourcentage des différents types de leucocytes à la fin des traitements (J42), données issues d une analyse à l aide de l appareil ScilVetABC. En conclusion : l administration endotrachéale de cetuximab chez le rongeur permet un dépôt pulmonaire efficace de l anticorps et ne génère pas de toxicité additionnelle à la voie systémique. II- Etablissement d un modèle animal de tumeur broncho-pulmonaire ectopique sensible au cetuximab. Pour étudier l efficacité thérapeutique du cetuximab administré par aérosol dans le traitement du CBNPC, il nous fallait mettre en place un modèle animal de tumeur bronchopulmonaire sensible au cetuximab. Pour cela, nous avons choisi d implanter des cellules cancéreuses humaines par voie endotrachéale chez des souris immunodéficientes. L implantation en intrabronchique de cellules tumorales chez la souris immunodéficiente a été décrite pour la première fois par l équipe de McLemore et al. en 1987 avec différents types de lignées cancéreuses d origine pulmonaire (A549, H460, H358 et H125). Cette technique donne des résultats satisfaisants en termes de fréquence de formation tumorale et de localisation des foyers dans le poumon. Dans un premier temps, il nous a donc fallu déterminer une lignée cellulaire à injecter qui soit suffisamment sensible à l anticorps. In vitro, nous avons testé la réponse au cetuximab de plusieurs lignées de cancer du poumon non à petites cellules disponibles au laboratoire (A549, H1838, H460). En accord avec la littérature, aucune d elles n a présenté de 118

124 Résultats II réponse satisfaisante au traitement (Janmaat et al., 2003). Nous avons donc choisi de mettre en place un modèle ectopique de tumeur pulmonaire en implantant les cellules A431 (d origine épidermique) dans le poumon des souris. Ces cellules répondent correctement à l anticorps et par ailleurs, servent de référence pour l ensemble des études sur le cetuximab (Saleh et al., 1999 ; Matar et al., 2004). II.1- Mise en place du modèle animal. Afin de déterminer les conditions optimales pour le développement de tumeurs A431 dans les poumons, les cellules ont été implantées chez l animal à différentes concentrations et en présence ou non d adjuvant. Pour la plupart des conditions, la fréquence de formation de tumeurs pulmonaires 6 ou 8 semaines après l implantation était faible voire inexistante. Seule, l induction avec 2, cellules en présence d EDTA a permis d obtenir des tumeurs pulmonaires profondes dans une grande majorité des cas (7 animaux / 7) (Tableaux 9 et 10). Quantité de cellules Tumeur pulmonaire (nombre d animaux) Localisation des tumeurs A431 seules 2, non (0/3) trachée A431 + EDTA 10 mm non (0/3) trachée 2, oui (3/3) poumon oui (2/3) poumon ± trachée A431 + EDTA 10 mm + hydrogel à 3mg/mL A431 + EDTA 10mM + matrigel à 4mg/mL 2, oui (1/3) poumon non (0/3) trachée 2, oui (3/3) poumon ± trachée Tableau 9 : Formation de foyers tumoraux pulmonaires 6 ou 8 semaines après l implantation intrabronchique de cellules A431 seules ou avec des adjuvants chez la souris BALB/c Nude. 119

125 A C 50µm 50µm B D 10µm 10µm Figure 34 : Histologie des tumeurs pulmonaires ou trachéales retrouvées chez les souris après une induction intrabronchique de cellules A431. Les souris ont reçu une injection intrabronchique de 2, cellules A431 additionnées de 10mM d EDTA. Après 6 ou 8 semaines d induction tumorale, les souris ont été sacrifiées et les poumons analysés histologiquement. A et B : tumeurs intrapulmonaires; C et D : tumeurs trachéales. Tumeurs pulmonaires Tumeurs trachéales Induction du 28/11/06 3/3 0/3 Induction du 06/12/07 4/4 1/4 Tableau 10 : Formation de foyers tumoraux pulmonaires 6 ou 8 semaines après l implantation intrabronchique de cellules A431 additionnées d EDTA à 10 mm chez la souris BALB/c Nude.

126 Résultats II Certains auteurs ont émis l hypothèse que l EDTA, un agent chélateur du calcium, serait à l origine de perturbations des contacts cellules-cellules médiés par les cadhérines calcium-dépendantes (Kang et al., 2006). L EDTA agirait donc en déstabilisant les interactions entre cellules ce qui faciliterait l implantation des cellules A431 dans le parenchyme pulmonaire. Dans ces conditions, les analyses macroscopiques et histologiques effectuées sur les prélèvements autopsiques ont révélé que les poumons des animaux présentaient le plus souvent un foyer tumoral unique, relativement plat et de taille comprise entre 1 et 10 mm (Figure 34). Par ailleurs, chez certains animaux, le développement d un foyer tumoral au niveau de la trachée a également pu être observé (Tableaux 9 et 10). Celui-ci se serait probablement développé à l endroit de l insertion du cathéter. A ce niveau, les nodules tumoraux étaient de plus grande taille (en moyenne 8 mm) et relativement sphéroïdes. On peut donc penser que les lésions provoquées par le cathéter au sein de la muqueuse bronchique pourraient augmenter l implantation pulmonaire des cellules cancéreuses. L analyse anatomo-pathologique a montré que les tumeurs pulmonaires étaient des carcinomes indifférenciés et les foyers trachéaux des carcinomes épidermoïdes bien différenciés (Figure 34). Ces résultats indiquent une variabilité dans la différentiation des cellules tumorales selon leur site d implantation (poumon profond ou trachée). Ce phénomène a déjà été rapporté par l équipe de Manzotti et al. en 1993 qui a montré que le microenvironnement dans lequel sont implantées les cellules était un facteur important dans la croissance et la progression des tumeurs in vivo. 121

127 Résultats II II.2- Homogénéisation des lots de souris en fonction de la taille des tumeurs. La tomodensitométrie thoracique est une technique d imagerie clinique qui permet de visualiser de manière non invasive la présence de foyers tumoraux d une taille supérieure à 1 mm. Cet outil, désormais disponible chez le petit animal avec des appareils spécifiques, est particulièrement intéressant pour homogénéiser les lots d animaux avant l administration d un traitement lorsque la taille des tumeurs développées chez l animal est hétérogène, comme c est le cas dans notre modèle animal. Une exploration des tumeurs pulmonaires par tomodensitométrie a donc été réalisée chez des souris 4 et 6 semaines après l implantation intrabronchique de cellules A431. La comparaison des données histologiques et d imagerie a permis de démontrer que seules les tumeurs A431 pulmonaires de plus de 4 mm ou accolées à la plèvre pouvaient être détectées par tomodensitométrie (Figure 35). Or, la majorité des tumeurs pulmonaires sont souvent plus petites. Elles n ont pas pu être détectées par la tomodensitométrie thoracique alors qu elles pouvaient être visualisées par simple observation macroscopique sur les poumons fixés après le sacrifice des animaux (6 semaines postimplantation). On peut penser que leur faible densité et leur forme aplatie limite leur détection par scanner. Pour la suite des expérimentations, l inclusion des souris dans les différents groupes a donc été réalisée en aveugle, ce qui n était certes pas optimal mais tout à fait envisageable compte tenu du rendement tumoral obtenu dans le modèle (presque 100%). Afin de s assurer d un bon développement tumoral les traitements ont été commencés 7 à 8 semaines post-implantation. Figure 35 : Tomodensitométrie thoracique d une souris BALB/c Nude porteuse de tumeur broncho-pulmonaire de cellules A431. La tumeur cerclée de rouge mesure environ 4 mm. 122

128 A B C 50µm Figure 36 : Tomodensitométrie thoracique (avant et après traitement au cetuximab) et analyse histologique post-mortem des poumons d une souris porteuse de tumeur broncho-pulmonaire avant le traitement. Après l induction tumorale avec 2, de cellules A431 en présence de 10 mm d EDTA, des souris positives au scanner ont été traitées avec 1mg de cetuximab deux fois par semaine par voie intrapéritonéale pendant 3 semaines. La figure montre l imagerie scanner avant traitement (A) et après traitement (B) ; ainsi que l analyse histologique des poumons d une souris après traitement (C).

129 Résultats II II.3- Sensibilité des tumeurs au cetuximab. Pour valider le modèle animal, il était nécessaire de vérifier la sensibilité des tumeurs A431 implantées en intrabronchique vis-à-vis du cetuximab. Pour cela, un petit nombre de souris a été traité soit avec du cetuximab (n= 2), soit avec du PBS 1X (n= 3) en administration intrapéritonéale selon la procédure classiquement décrite dans la littérature (Matar K et al., 2004). Comme le montre la figure 36, une disparition complète des tumeurs a été observée au scanner chez les souris traitées par le cetuximab. Cette expérimentation a été réalisée au même moment que celle pour tester l intérêt du scanner thoracique pour homogénéiser les lots d animaux, c est pourquoi les résultats présentés font appel à ce type d imagerie. L examen anatomopathologique a confirmé l absence de tumeur pulmonaire après traitement par le cetuximab, ce qui indique que les cellules A431 restent sensibles au cetuximab après implantation dans les poumons chez l animal. En conclusion : une administration intrabronchique de cellules A431 en présence d EDTA chez la souris BALB/c Nude permet l obtention, dans une grande majorité des cas, de tumeurs pulmonaires profondes de type indifférencié. Par ailleurs, la disparition des tumeurs pulmonaires après traitement des souris par injection intrapéritonéale de cetuximab démontre la sensibilité du modèle vis-à-vis de l anticorps. Même si l homogénéisation des lots par tomodensitométrie thoracique n a pas été possible, le bon rendement tumoral rend ce modèle animal de tumeur broncho-pulmonaire satisfaisant pour la suite des expérimentations. Le modèle animal a ensuite été utilisé pour étudier : - la biodistribution et la pharmacocinétique du cetuximab administré par aérosol, - l efficacité anti-tumorale du cetuximab administré par aérosol. Le cetuximab ne présente pas de cross-réactivité avec l EGFR murin et, chez la souris, interagira seulement avec l EGFR présent à la surface des cellules tumorales d origine humaine. Le cetuximab pourra utiliser le système de transport/recyclage qu offre le récepteur FcRn aux IgGs car le récepteur murin possède une forte affinité pour le domaine Fc des IgGs humaines (cf. revue bibliographique, chapitre IV). 124

130 Résultats II III- Biodistribution du cetuximab administré par aérosol. Le but de cette étude était d évaluer la distribution du cetuximab chez l animal et sa fixation tumorale après administration par différentes voies. Pour cela, la biodistribution en temps réel du cetuximab administré par voie pulmonaire a été comparée à celle de l anticorps injecté par voie i.v. (voie actuellement utilisée chez l homme) par imagerie de fluorescence proche IR dans le modèle animal établi. L imagerie optique de fluorescence dans le proche infrarouge permet de suivre le devenir dans l organisme d une molécule conjuguée à un fluorophore. Même si la résolution est parfois approximative et les reconstructions 3D très compliquées à mettre en œuvre, cette technique d imagerie a une excellente sensibilité, son utilisation est relativement simple et son coût reste raisonnable. Pour réaliser cette étude, le cetuximab a donc été marqué au préalable avec un fluorophore émettant dans le proche infrarouge, le Xénofluor750 TM. III.1- Validation du marquage du cetuximab avec le Xénofluor750 TM. Le marquage du cetuximab avec le Xénofluor750 TM se fait par la formation de liaisons amides entre l ester de succinimidyl présent sur le fluorophore et les groupements amines libres de l anticorps. Les différents marquages réalisés ont permis d obtenir des solutions de cetuximab-xénofluor750 TM à des concentrations comprises entre de 1,2 et 1,4 mg/ml. Par ailleurs, l efficacité du couplage du cetuximab au Xénofluor750 TM a été évaluée grâce aux formules fournies par le fabricant (voir matériels et méthodes). Le nombre de molécules de Xénofluor750 TM par molécule de cetuximab était compris entre 4 et 5,5 ce qui correspond, d après les recommandations du fournisseur, à un marquage optimal pour une utilisation en imagerie infrarouge in vivo. Afin de vérifier que le couplage du Xénofluor750 TM ne modifiait pas la reconnaissance de l EGFR par le cetuximab, une analyse de l affinité du cetuximab-xénofluor750 TM pour le récepteur a été réalisée par une étude de cytométrie en flux en utilisant les cellules A431. Comme le montre la figure 37, les courbes d inhibition de fluorescence obtenues pour l anticorps natif ou couplé au Xénofluor750 TM sont quasiment similaires. De plus, les valeurs d IC 50 correspondant à la concentration nécessaire pour inhiber 50% de la fixation du cetuximab natif ou marqué au Xénofluor750 TM sur les cellules A431, sont très proches 125

131 Résultats II indiquant que le couplage avec le fluorophore ne modifie pas l affinité du cetuximab pour l EGFR. Inhibition de la fluorescence (%) ,1 0, [Cetuximab (µg/ml)] Cetuximab non marqué Figure 37 : Etude de l affinité du cetuximab-xenofluor750 TM et du cetuximab natif pour l EGFR par cytométrie en flux avec des cellules A431. Les cellules A431 ont été incubées avec du cetuximab non marqué ou du cetuximab- Xenofluor750 TM à différentes concentrations. Après rinçage, les cellules sont mises en présence d 1µg/mL de cetuximab couplé au FITC. L inhibition de la fluorescence associée aux cellules est mesurée à l aide d un cytomètre en flux EPICS XL. Triangles : cetuximab non marqué; Losanges : cetuximab-xenofluor750 TM. L IC50 a été déterminée graphiquement. Cetuximab- Xenofluor750 TM IC 50 (ng/ml) Parallèlement, nous nous sommes assurés que le cetuximab-xénofluor750 TM gardait la capacité à fixer les cellules A431 in vivo. Pour cela, du cetuximab marqué a été administré par i.v. chez une souris porteuse d une tumeur sous-cutanée de cellules A431 et une imagerie infrarouge a été effectuée 20h après l administration. Comme le montre la figure 38, un marquage important est retrouvé au niveau du nodule tumoral, indiquant qu au moins une partie du cetuximab- Xénofluor750 TM se fixe aux cellules A431 in vivo. 126

132 Résultats II Figure 38 : Fixation du cetuximab-xenofluor750 TM sur une tumeur de cellules A431 implantées en sous-cutanée chez la souris BALB/c Nude. Six semaines après une injection sous-cutanée de cellules A431 (2, cellules + 4 mg/ml de Matrigel), une souris a reçu 72,5 µg de cetuximab-xenofluor750 TM par administration intraveineuse (i.v.). Une imagerie infrarouge a été effectuée après 20 heures. III.2- Etude de la biodistribution du cetuximab par imagerie infrarouge. Cette étude a été conduite sur 10 animaux, sept présentaient une tumeur pulmonaire et deux une tumeur au niveau de la trachée. III.2a Administration par voie intraveineuse. Après l administration de cetuximab par voie i.v., un signal de fluorescence a été retrouvé au niveau du foie, organe important de la détoxification et du catabolisme des médicaments, rapidement après l injection (Figure 39-A). Le signal était maximal dans les premières 24h après l administration, puis décroissait progressivement, et pouvait être observé jusqu à 72h après l injection. Il a précédemment été démontré que le cetuximab était massivement pris en charge par le foie après une administration intraveineuse et qu il pouvait y être détecté jusqu à quatre jours après l injection (Barrett et al., 2007 ; Cai et al., 2007). Les cellules endothéliales vasculaires et les hépatocytes, cellules majoritaires du foie, internalisent, à leur pôle apical, les protéines circulantes de façon passive. Les immunoglobulines sont protégées par le récepteur FcRn de la dégradation par les protéases intracellulaires (Telleman et al., 2000). Les immunoglobulines fixées sur le FcRn sont ensuite relarguées, au pôle apical, dans la circulation sanguine expliquant leur longue demi-vie. Une faible partie est excrétée dans les intestins via la bile. Cependant, lorsque la quantité de cetuximab qui parvient dans l organe est importante, les récepteurs FcRn sont vraisemblablement saturés, et le cetuximab peut être dégradé par des endoprotéases lysosomales. 127

133 Résultats II 20min 1h 8h 24h 48h 72h A- B- C- Figure 39 : Biodistribution du cetuximab-xenofluor750 TM administré par différentes voies chez la souris BALB/c Nude porteuse de tumeur broncho-pulmonaire. Sept semaines après l induction intrabronchique des tumeurs A431, les souris ont reçu 72,5 µg de cetuximab-xenofluor750 TM administrés par voie i.v. (A), inhalée (B) ou i.p. (C). La distribution du cetuximab dans l organisme a été analysée par imagerie infrarouge à t20min, t1h, t8h, t24h, t48h, et t72h (gauche) et ex vivo au niveau pulmonaire (droite). 128

134 Résultats II Au niveau de la vessie, un signal de fluorescence a également été détectée rapidement après l injection. Le signal persistait pendant les premières heures de l analyse, puis décroissait rapidement. Ce signal est probablement dû à une fraction de Xénofluor750 TM libre passant passivement la barrière glomérulaire des reins. En effet, lors de la purification du cetuximab-xénofluor750 TM par chromatographie d exclusion, une contamination de la préparation par du Xénofluor750 TM libre ne peut être exclue. Enfin, aucun signal n a pu être détecté dans le poumon tout au long de l analyse. Néanmoins, les analyses réalisées sur les poumons ex vivo montrent la présence d une petite quantité de fluorescence au niveau pulmonaire. L examen histologique a permis de déterminer que le signal de fluorescence était localisé au niveau du foyer tumoral. Ces données démontrent que le cetuximab administré par voie i.v. se fixe spécifiquement et en faible quantité sur les tumeurs pulmonaires A431. Ceci est confirmé par les résultats de l immunoblot présenté figure 40. En effet, la présence de cetuximab-xénofluor750 TM dans les poumons de souris ayant reçu l anticorps par voie intraveineuse ne peut être observée car l anticorps est sans doute en quantité trop faible pour être détectée par cette technique. III.2b Administration par voie inhalée. Quand le cetuximab-xénofluor750 TM a été administré par voie pulmonaire, un faible marquage hépatique a été observé dans les heures suivant l administration et celui-ci a décru lentement environ 8 heures après l inhalation (Figure 39-B). Cette captation hépatique pourrait être consécutive au passage systémique de l anticorps au niveau : (1) des voies respiratoires supérieures richement vascularisées (Sakagami, 2006) du cetuximab présent dans la gueule de l animal après le geste, (2) du poumon profond via le récepteur FcRn ou encore (3) du tractus digestif après ingestion de l anticorps présent dans la gueule de l animal. Pour évaluer cette dernière hypothèse, un gavage avec 50 ou 100 µg de cetuximab- Xénofluor750 TM a été réalisé sur quelques animaux et une imagerie de fluorescence infrarouge réalisée à différents temps post-administration. Ces analyses ont démontré que le cetuximab-xénofluor750 TM administré par gavage restait localisé au niveau de l estomac pendant plusieurs heures. Après son catabolisme, il était éliminé progressivement de l organisme par une excrétion urinaire. Par contre, aucun marquage hépatique n a été détecté (analyses non présentées). Ceci exclut que le marquage hépatique observé après l administration du cetuximab par voie pulmonaire soit consécutif à l absorption de l anticorps par le tractus gastro-intestinal. 129

135 Résultats II Comme après une injection, de la fluorescence a été observée au niveau de la vessie immédiatement après l inhalation. Ce signal pourrait, dans ce cas également, être lié au passage systémique du Xénofluor750 TM libre diffusant passivement à travers la barrière alvéolocapillaire puis à son excrétion rénale. Cependant, contrairement à la voie systémique, ce marquage vésical a persisté tout au long de l expérience. Ceci suggère un passage systémique puis une filtration par le rein de fragments d anticorps issus d une protéolyse dans le poumon où siègent de nombreuses protéases. En effet, dans leur intégrité, les IgGs qui ont un haut poids moléculaire, ne sont pas ou peu métabolisées par le rein (Lobo et al., 2004). Pour tester la présence de fragments de protéolyse de cetuximab-xénofluor750 TM dans le poumon, une analyse de l anticorps par Western-Blot a été réalisée à partir des lysats protéiques des poumons de souris. Comme le montre la figure 40, le cetuximab a été observé seulement sous sa forme native dans le poumon des souris ayant reçu l anticorps par voie pulmonaire ce qui indique que s il y a une protéolyse de l anticorps dans cet organe, elle est limitée kda 50 kda 25 kda Figure 40 : Immunodétection du cetuximab dans des extraits protéiques pulmonaires de souris ayant reçu l anticorps par différentes voies. Les extraits protéiques ont été déposés sur gel de polyacrylamide 8% et séparés par électrophorèse. Après électro-transfert des protéines sur membrane PVDF, le cetuximab a été détecté par un anticorps anti-igg humaines couplé à l HRP. 1, 2 et 3 : dépôts protéiques extraits des poumons de souris ayant reçu du cetuximab par voie inhalée ; 4, 5 et 6 : dépôts protéiques extraits des poumons de souris ayant reçu du cetuximab par voie i.v. ; 7 : cetuximab non réduit; 8 : cetuximab réduit. Enfin un marquage intense a été immédiatement observé au niveau des poumons et de la trachée et le signal de fluorescence pulmonaire a persisté jusqu à 72 heures après l administration. Ce résultat et celui de l immunodétection (Figure 40) indique que le 130

136 Résultats II cetuximab est présent en quantité importante et durablement dans le poumon. L imagerie ex vivo des poumons a montré que le signal de fluorescence était diffus dans l ensemble de l organe. Ce fort bruit de fond pulmonaire pourrait masquer une fixation spécifique de l anticorps au niveau du nodule cancéreux qui est souvent de petite taille. Néanmoins, sur des tumeurs de diamètre supérieur à 2 mm le nodule peut être visualisé par imagerie infrarouge ex vivo. La figure 41 montre par ailleurs que le signal de fluorescence est plus important autour de la tumeur que sur la tumeur elle-même. S203 S2035 S2035 S203 Figure 1: Images des poumons des souris ayant reçu le cetuximab par aérosol Figure 41 : Imagerie infrarouge ex vivo des poumons d une souris BALB/c Nude porteuse de tumeur broncho-pulmonaire 48 heures après avoir reçu du cetuximab- Xenofluor750 TM par voie aérosol. La souris présentait une tumeur bien visible (2mm Ø) sur la face postérieure du poumon gauche (elle est indiquée par une flèche blanche). L image est présentée à deux niveaux de seuillage différents. III.2c Administration par voie intrapéritonéale. La biodistribution du cetuximab après une administration intrapéritonéale (mode d injection classiquement utilisé chez la souris) a également été étudiée chez deux animaux. Dans ce cas, un signal a été retrouvé immédiatement après l injection sur le pourtour des intestins (suggérant une captation du cetuximab par le péritoine) et au niveau du rectum et/ou de la vessie (Figure 39-C). À partir de 8h, la fluorescence intestinale décroissait progressivement. Au niveau hépatique, un marquage témoignant du passage systémique du cetuximab est apparu après quelques heures puis a faibli lentement à partir de 8 heures. Comme après une administration par i.v., aucune fluorescence n a été observée au niveau des poumons. L analyse histologique post-mortem et l imagerie ex vivo des poumons ont cependant montré un signal localisé au niveau de la tumeur. Ces résultats démontrent que 131

137 Résultats II seule une faible quantité de l anticorps irait dans les poumons et se fixerait sur la tumeur après une administration intrapéritonéale. En conclusion : après avoir validé le couplage du cetuximab avec le Xénofluor750 TM, l anticorps marqué a été utilisé avec succès pour étudier sa biodistribution in vivo dans le modèle animal, par imagerie de fluorescence dans le proche infrarouge après administration par différentes voies. Les résultats de cette étude indiquent que le cetuximab administré par voie i.v. est rapidement capté par le foie où il est recyclé mais aussi catabolisé. Une faible quantité de l anticorps arriverait au niveau pulmonaire mais serait capable de se fixer à la tumeur. Après une administration par voie inhalée, le cetuximab s accumulerait et persisterait majoritairement sous forme native dans les poumons alors qu une faible quantité passerait dans la circulation générale. 132

138 A- B- Concentration sérique moyenne de cetuximab-xénofluor750 TM (µg/ml) 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0, Temps (h) 12,00 Concentration sérique moyenne de cetuximab-xénofluor750 TM (µg/ml) 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0, Temps (h) Figure 42 : Concentrations sériques moyennes et biodistribution par imagerie optique proche infrarouge de cetuximab-xénofluor750 TM durant les 336 heures suivant l administration par différentes voies chez la souris BALB/c Nude porteuse de tumeur pulmonaires A431. A: administration par voie pulmonaire, B : administration par voie intraveineuse.

139 IV- Pharmacocinétique du cetuximab administré par aérosol. Résultats II L effet thérapeutique d un médicament dépend de nombreux paramètres et, notamment, de la modalité d administration du traitement et des paramètres pharmacocinétiques qui décrivent le devenir de la molécule dans l organisme. Le but de l étude décrite ci-dessous était de déterminer et de comparer les paramètres pharmacocinétiques du cetuximab administré par aérosol et par voie i.v. dans le modèle murin de tumeur broncho-pulmonaire que nous avons établi afin de mieux comprendre l intérêt clinique de l administration du cetuximab et des anticorps anti-cancéreux en général par voie inhalée. Dans cette étude, les paramètres pharmacocinétiques du cetuximab ont été comparés après l administration d une dose unique de 72,5 µg d anticorps marqué au Xénofluor750 TM par voie intraveineuse (bolus dans la veine caudale) ou par voie pulmonaire (administration endotrachéale à l aide du Microsprayer TM ). Des prélèvements sanguins et des analyses par imagerie de fluorescence dans le proche infrarouge ont été effectués à différents temps jusqu à 336 heures (14 jours) après l injection. Les concentrations sériques de cetuximab- Xénofluor750 TM ont été déterminées par un dosage ELISA mis au point par l équipe 7 de l UMR CNRS 6239-GICC de Tours, «Pharmacologie des anticorps thérapeutiques et investigations cliniques» (Cézé et al., soumis en 2008) après avoir vérifié la possibilité de doser l anticorps marqué par cette méthode. L analyse pharmacocinétique a été réalisée par cette même équipe. Après sacrifice, neuf des treize animaux présentaient une tumeur pulmonaire et trois une tumeur trachéale. La figure 42 montre que les concentrations sériques moyennes de cetuximab observées après une administration par aérosol étaient inférieures à celles retrouvées après une administration par voie i.v. tout au long des 336 heures post-injection. De plus, les pics de concentration (i.v. : 9,694 µg/ml et aérosol : 0,328 µg/ml) et les aires sous la courbe ou ASC (i.v. : 609,39 µg.h/ml et aérosol : 55,19 µg.h/ml) étaient significativement inférieurs après une administration pulmonaire que ceux observés après une administration i.v. (Tableau 11). La fraction absorbée F, obtenue en faisant le rapport de l ASC de cetuximab-xénofluor750 TM mesurée après administration par voie pulmonaire sur celle obtenue après administration par voie i.v. (100% d absorption par définition), était relativement faible (9%) (Tableau 11). 134

140 Résultats II A- Cetuximab i.v. Cetuximab aérosol Pics de concentration (µg/ml) 9,694 (+/-1,184) 0,328 (+/-0,117) ASC (µg h -1 ml -1 ) 609,39 (+/-156,03) 55,19 (+/-29,48) MRT (h) 95,03 (+/-10,48) 111,53 (+/-37,60) B- Cetuximab aérosol F (%) 9 Tmax (h) 41,36 (+/- 12,02) t½ abs (h) 19,76 (+/- 7,88) MAT (h) 16,05 Tableau 11 : Comparaison des paramètres pharmacocinétiques du cetuximab- Xénofluor750 TM administré par aérosol et par voie intraveineuse chez la souris BALB/c Nude porteuse de tumeur A431 broncho-pulmonaire. Les données ont été obtenues par une analyse non compartimentale (A) et une analyse bicompartimentale avec absorption d ordre 1 (B). Elles sont exprimées en moyenne des valeurs obtenues pour les 6 souris du groupe aérosol et les 7 souris du groupe i.v.. Les écarttypes sont indiqués entre parenthèses. i.v.= bolus de 72,5 µg de cetuximab, aéro : aérosol de 72,5 µg de cetuximab administrés par Microsprayer TM. ASC : Aire sous la courbe, MRT : temps de résidence moyen, MAT : temps d absorption moyen, F : fraction absorbée exprimée en pourcentage de la dose aérosolisée, t½ abs : demi-vie d absorption, Tmax : temps correspondant à la concentration sérique maximale. 135

141 Résultats II Le temps d absorption moyen (mean absorption time ou MAT) du cetuximab- Xénofluor750 TM qui est le temps moyen nécessaire à une molécule de cetuximab- Xénofluor750 TM inhalée pour atteindre la circulation sanguine, a également été déterminé par le rapport du temps de résidence moyen (mean residence time ou MRT) du cetuximab- Xénofluor750 TM administré par aérosol sur le MRT du cetuximab-xénofluor750 TM administré par voie i.v. Un MAT de 16h environ a été estimé. La demi-vie d absorption du cetuximab a également été calculée par modélisation compartimentale en décrivant la cinétique d absorption grâce à une constante d absorption de 1 er ordre. Cette demi-vie d absorption correspondant au temps nécessaire pour que la moitié des molécules de cetuximab inhalées qui seront absorbées passent dans le sang, était de 20 heures environ. Ces deux paramètres nous renseignent sur le temps d absorption de l anticorps à travers le tissu pulmonaire vers la circulation générale et indiquent qu après une administration par aérosol, l anticorps passerait lentement dans la circulation sanguine. De plus, le Tmax ou temps pour lequel la concentration sérique de cetuximab- Xénofluor750 TM est maximale était d environ 40h après l administration de l anticorps par voie pulmonaire. Au delà de 40 heures, la vitesse d élimination de l anticorps est donc plus importante que sa vitesse d absorption pulmonaire. En conclusion : L ensemble de ces données de pharmacocinétique corrobore les données d imagerie infrarouge. Elles indiquent que le cetuximab administré par aérosol s accumule et persiste longtemps au niveau pulmonaire. Une faible fraction (9%) est absorbée et cette absorption est lente ce qui correspond peut-être au fonctionnement du récepteur FcRn. 136

142 Résultats II V- Efficacité du cetuximab administré par aérosol. Pour une même dose, la voie d administration d un médicament peut modifier son efficacité. Pour le traitement du cancer broncho-pulmonaire, une administration par aérosol présenterait l avantage de cibler directement l organe à traiter et de limiter la diffusion et donc la toxicité du médicament dans l organisme. Ainsi, pour un médicament à effet dosedépendant, une quantité importante de molécules actives atteindrait l organe à cibler, augmentant potentiellement son efficacité par rapport à la voie systémique où il est facteur de toxicité et sujet à l élimination. Dans cette étude, l efficacité thérapeutique du cetuximab administré par voie pulmonaire (à l aide du Microsprayer TM ) a été évaluée dans le modèle murin de tumeur broncho-pulmonaire sensible au cetuximab mis en place précédemment. Des tumeurs A431 pouvant être en général observées entre 6 et 8 semaines après l administration intrabronchique des cellules, le traitement des souris a été commencé 8 semaines après l induction tumorale. Les animaux ont été repartis en deux groupes et ont reçu soit 2 mg de cetuximab par voie inhalée une fois par semaine pendant 3 semaines, soit aucun traitement. Les poumons ont été prélevés après les 3 semaines de traitement, fixés et analysés par un anatomopathologiste pour détecter la présence de tumeurs. Compte tenu des problèmes de rendement que nous avons rencontré lors des inductions tumorales ces derniers mois, une première expérience a été effectuée sur un nombre restreint d animaux. 137

143 A- Tumeur Absence de tumeur Pas de traitement mg cetuximab par voie inhalée 2 2 Traitement BSouris non traitées Souris traitées au cetuximab 50µm 25µm 50µm 25µm Figure 43 : Effet du cetuximab administré par aérosol sur des tumeurs A431 implantées en intrabronchique chez la souris BALB/c Nude. A- Nombre de souris présentant des tumeurs ou non après sacrifice des animaux et analyse histologique par un anatomopathologiste. B- Histologie des tumeurs A431 sans traitement (gauche) ou après traitement avec 2 mg de cetuximab par aérosol une fois par semaine pendant 3 semaines (droite).

144 Résultats II La fréquence de formation de foyers tumoraux dans le groupe témoin non traité était de 3 animaux sur 4 (Figure 43), ce qui témoigne d une induction tumorale efficace mais non optimale. Dans ce groupe, toutes les tumeurs étaient de type indifférencié et de taille comprise entre 0,75 mm et 6 mm. Dans le groupe de souris ayant reçu du cetuximab par voie pulmonaire (n= 5), une souris est morte au cours de la première administration. Les autres souris ont toutes reçu au moins une dose de cetuximab. Deux d entre elles ne présentaient pas ou plus de tumeur après le traitement. Les deux autres animaux présentaient des tumeurs de 3 et 4 mm de type différencié et mature avec quelques zones nécrotiques. Notons par ailleurs, que l analyse histologique des tumeurs pulmonaires non traitées au cetuximab ou traitées par une dose unique sur une courte durée (maximum 72h) a révélé dans 100% des cas des carcinomes indifférenciés. Au contraire, chez les souris traitées par une dose unique de cetuximab et sacrifiées 14 jours après l administration (paragraphe IV), une différenciation et une maturation des tumeurs ont été détectées chez plusieurs animaux qu ils aient reçu l anticorps par voie i.v. ou par aérosol. La différenciation des cellules et l apparition de foyers nécrotiques (Figure 43) au sein des tumeurs pourraient donc indiquer une réponse partielle au traitement. Ce phénomène a déjà été décrit en 2000 par l équipe de Milas sur des tumeurs de cellules A431 implantées en sous-cutanées chez la souris BALB/c Nude (Milas et al., 2000). En conclusion : Malgré la petite taille de notre échantillon, ces résultats préliminaires sont encourageants car ils suggèrent une sensibilité des tumeurs pulmonaires au cetuximab administré par aérosol. 139

145 Discussion

146 Discussion II Afin d évaluer l intérêt d une aérosolthérapie avec des anticorps anti-tumoraux dans le traitement du cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules, nous avons réalisé une étude pré-clinique chez l animal avec le cetuximab. Pour sa réalisation, il a fallu établir différents paramètres. 1- Définir la méthode pour nébuliser le cetuximab chez l animal. Nous avons opté pour une administration endotrachéale avec un Microsprayer TM, méthode de nébulisation précédemment décrite dans la littérature (Patton et al., 2004, Bivas-Benita et al., 2005 ; Cryan et al., 2007). Cette méthode d aérosolisation est intéressante car elle est relativement facile d utilisation et permet de contrôler la quantité de médicament administrée au niveau des poumons. Nous avons démontré que la nébulisation avec le Microsprayer TM permettait de conserver les propriétés immunologiques et pharmacologiques de l anticorps in vitro et n entraînait pas d agrégation de la molécule. Puis, nous avons démontré que l administration endotrachéale permettait d obtenir un dépôt pulmonaire efficace de la solution d anticorps dans l arbre trachéo-bronchique chez la souris. Cette méthodologie est donc appropriée pour étudier l efficacité thérapeutique de l anticorps administré par voie pulmonaire. 2- Déterminer si l administration par voie pulmonaire entraîne une toxicité additionnelle du cetuximab par rapport à la voie systémique. Même si aucune toxicité importante de l anticorps n a été précédemment décrite chez les rongeurs par cette dernière voie ( cette étude était un pré-requis indispensable à toute évaluation d un effet thérapeutique in vivo de l anticorps administré par voie pulmonaire. Les résultats chez les souris BALB/c et BALB/c Nude ont permis de démontrer l absence d effet toxique de l anticorps quelle que soit la voie d administration. Toutefois, quelques décès sont survenus lors de la première administration et la cause reste peu claire. Des études dans des modèles animaux plus proches de l homme (primates non humains) seront donc nécessaires pour s assurer de la sureté d une administration par aérosol du cetuximab. 3- Mettre en place un modèle murin de tumeur broncho-pulmonaire sensible au cetuximab. Pour cela, nous avons choisi d établir un modèle ectopique de tumeur pulmonaire consistant en l administration intrabronchique de cellules non pulmonaires, les cellules A431 (carcinome épidermoide d origine épidermique) utilisées comme référence dans les études sur le cetuximab (Saleh et al., 1999 ; Matar et al., 2004). Plusieurs facteurs sont apparus importants pour obtenir la formation de foyers tumoraux pulmonaires : la quantité de cellules et l addition d un agent chélateur, l EDTA. Celui-ci faciliterait l implantation des cellules tumorales A431 dans le parenchyme pulmonaire en déstabilisant les interactions cellules- 141

147 Discussion II cellules (Kang et al., 2006). Les nodules cancéreux pulmonaires formés étaient profonds, de type indifférenciés (100% des cas) mais hétérogènes en taille. L implantation profonde des cellules cancéreuses dans le parenchyme pulmonaire est intéressante car modélise bien l implantation des nodules tumoraux des carcinomes bronchiolo-alvéolaires qui sont une cible attrayante pour un traitement par aérosolthérapie. L absence d outils d imagerie accessibles et efficaces pour répartir les souris dans les différents lots selon la taille du foyer tumoral, avant tout traitement, n est pas apparu comme un obstacle majeur car le rendement tumoral du modèle était très bon. Malgré un effort pour standardiser au maximum les expériences d implantation, nous avons connu, ces derniers mois, une variabilité importante dans le rendement tumoral en fonction des expériences ce qui remet en cause, aujourd hui, la fiabilité du modèle. Les modèles animaux étant en perpétuelle évolution, récemment un nouveau modèle orthotopique de tumeur pulmonaire sensible au cetuximab a été développé. Les cellules H292 utilisées pour l implantation sont issues de lignées cellulaires de carcinome mucoépidermoïde pulmonaire humain (Steiner et al., 2007). Il serait donc intéressant d évaluer in vivo la réponse au cetuximab de cette lignée pulmonaire après une administration par aérosol de l anticorps. Malgré ses limites, le modèle animal a été exploité pour comparer la biodistribution et la pharmacocinétique du cetuximab administré par voie pulmonaire et par voie systémique, voie classiquement utilisée chez l homme pour les anticorps (Mascelli et al., 2007). L objectif était de mettre en évidence des différences de comportement de l anticorps in vivo (biodisponibilité, accumulation au niveau des poumons, etc...) en fonction de la modalité d administration. La biodistribution et la pharmacocinétique des IgGs par voie extravasculaire sont peu décrites, en particulier pour la voie inhalée et, dépendent de nombreux paramètres rendant l analyse très compliquée (Lobo et al., 2004 ; Sakagami, 2006). Tout d abord, il faut prendre en compte la fixation à l antigène cible. En effet, la fixation du cetuximab à l EGFR dépend d un mécanisme spécifique et saturable par lequel le complexe EGFR-cetuximab est internalisé et recyclé ou dégradé. Cette endocytose médiée par le récepteur contribue dans une proportion non négligeable à la clairance totale de l anticorps (Dirks et al, 2008). Ensuite, il faut évaluer le rôle du récepteur FcRn. Ce récepteur est responsable du maintien de la concentration sérique des IgGs. Il lie les IgGs dans les compartiments endosomaux des cellules endothéliales, les protégeant ainsi de la dégradation lysosomale et les recyclant dans le lumen vasculaire (Ober et al., 2004). Il a également un rôle dans la biodistribution des IgGs 142

148 Discussion II en facilitant leur passage vers le sang et au travers des épithelia (Ghetie et al., 2002). Le FcRn, exprimé au niveau de l épithélium pulmonaire, a été décrit comme intervenant spécifiquement dans la pharmacocinétique de molécules inhalées couplées au domaine Fc des IgGs (Bitonti et al., 2006). Exprimé au niveau des macrophages alvéolaires, il permettrait une persistance des anticorps dans les poumons. Il interviendrait donc dans l augmentation de la demi-vie des anticorps thérapeutiques et leur biodisponibilité. Dans notre modèle, compte tenu de l absence de cross-réactivité du cetuximab avec l EGFR murin, l anticorps interagit seulement avec l EGFR présent à la surface des cellules tumorales A431 d origine humaine implantées en intrabronchique. De plus, le récepteur FcRn murin ayant une forte affinité pour le domaine Fc des IgGs humaines, le cetuximab qui est un anticorps chimérique bénéficie du système de transport/recyclage qu offre le récepteur FcRn aux IgGs. Dans notre étude, nous avons démontré que, par voie sanguine, le cetuximab était capté de façon importante au niveau du foie où il sera transformé et éliminé. Ces résultats sont en accord avec ceux précédemment obtenus par micropet avec du cetuximab marqué au cuivre-64 ou à l indium-111 et injecté à des souris porteuses de tumeurs sous cutanées (Barrett et al., 2007 ; Cai et al., 2007). Une faible quantité de l anticorps arrivait au niveau des poumons mais semblait se fixer de façon spécifique au niveau de la tumeur. Peu de cetuximab atteignant l organe cible, il est vraisemblable que la dose à injecter sera plus importante et entraînera des effets secondaires conséquents. Au contraire, par voie pulmonaire nous avons démontré que le cetuximab était retrouvé en quantité importante au niveau des poumons et qu il s accumulait de façon durable. Cette longue persistance du cetuximab au niveau des poumons peut être liée au système de recyclage/protection qu offre le récepteur FcRn aux anticorps thérapeutiques. Ce récepteur est largement exprimé au niveau pulmonaire chez les rongeurs (macrophages alvéolaires, tissu alvéolaire et épithélium bronchique) (Kim et al., 2004 ; Sakagami et al., 2006). La plupart du temps, une fixation spécifique de la tumeur n a pu être mise en évidence par imagerie infrarouge à cause d un fort bruit de fond au niveau pulmonaire. La petite taille des tumeurs ne facilite sans doute pas une visualisation d un marquage à ce niveau. Néanmoins, lorsque le nodule est plus gros, il peut être visualisé par imagerie infrarouge, démontrant que le cetuximab se fixe sur sa cible tumorale. Le signal de fluorescence observé était plus fort en périphérie de la tumeur que sur le nodule tumoral lui-même. Ceci soulève plusieurs hypothèses : (1) la saturation de l EGFR exprimé par les cellules A431 ou/et (2) une mauvaise distribution intra-tumorale associée à la faible expression du récepteur FcRn par les 143

149 Discussion II cellules A431 (nombre de copies déterminé par Q-PCR = 4 pour 100 ng d ARNtotal rétrotranscrit). On peut donc se demander si FcRn pourrait avoir un impact à la fois dans la pharmacocinétique des anticorps thérapeutiques et dans leur biodistribution intratumorale. Nous avons ensuite voulu déterminer la forme sous laquelle était retrouvé le cetuximab dans les poumons. Une dégradation de la molécule est possible car des protéases sont sécrétées au niveau pulmonaire par les cellules inflammatoires, les cellules épithéliales... Le récepteur FcRn étant par ailleurs saturable, pour une quantité importante d anticorps injectée, les molécules de cetuximab non liées au récepteur FcRn ne pourront échapper aux voies de catabolisme et seront dégradées par les protéases lysosomales (Ghetie et al., 1997). Les résultats d imagerie infrarouge suggèrent une dégradation de l anticorps car un marquage est retrouvé tout au long de l expérience au niveau de la vessie. Un immunoblot sur les lysats protéiques des poumons de souris indique cependant qu elle est limitée. Enfin, nous avons mis en évidence que l anticorps présentait une faible biodisponibilité et une absorption limitée quand il était administré par aérosol suggérant que cette voie serait appropriée pour restreindre les effets secondaires systémiques. Même si les études de pharmacocinétique chez l animal sont indispensables avant toute administration chez un patient, l extrapolation à l homme doit être envisagée avec précaution. L absence d antigène cible chez le rongeur est un paramètre important à prendre en compte et devra être considérée dans l analyse. En effet, chez l homme, les anticorps monoclonaux présentent souvent une pharmacocinétique non linéaire due en partie à une élimination de l anticorps via l interaction avec l antigène. De plus, le cetuximab, comme de nombreux autres anticorps, n est que partiellement humanisé et peut donc entraîner une immunogénécité chez l homme (Loisel et al., 2006). Cette immunogénécité peut entraîner une réponse anti-anticorps, lors d administrations répétées, pouvant altérer la pharmacocinétique de la molécule en modifiant la clairance ou réduisant l efficacité de la molécule (anticorps neutralisants) (Tabrizi et al., 2006). Par ailleurs, les sites d expression du récepteur FcRn varient d une espèce à l autre et son rôle dans le maintien de la demi-vie des anticorps serait très dépendant de l espèce (Gurbaxani, 2006). Chez le primate au niveau pulmonaire, le récepteur FcRn est exprimé principalement au niveau des voies aériennes supérieures et son expression serait plus limitée dans la partie basse de l arbre respiratoire (Spiekerman et al., 2002 ; Roopenian et al., 2007). Au contraire, chez le rongeur, il est exprimé au niveau de 144

150 Discussion II l épithélium bronchique mais aussi du tissu alvéolaire (Sakagami et al., 2006). Enfin, la technique d aérosolisation que nous avons utilisée limite le rôle de la clairance mucociliaire dans l élimination des particules inhalées, dont l importance varie d ailleurs de façon significative entre les espèces (Cryan et al., 2007). Une administration de cetuximab par aérosol chez le babouin, primate possédant une morphologie pulmonaire très proche de celle de l homme (Phalen et al., 2008), est planifiée pour la fin de l année 2008 pour évaluer au mieux ces différents paramètres. En conclusion, l anticorps est bien toléré par voie pulmonaire, persiste longtemps sous forme native au niveau de son site d action et diffuse peu dans la circulation sanguine. Ces résultats semblent favorables pour une meilleure efficacité de l anticorps administré par voie inhalée en comparaison à la voie sanguine tout en limitant les effets systémiques indésirables de la molécule. Une étude préliminaire de l efficacité du cetuximab administré par voie pulmonaire a été réalisée avec le modèle animal établi. Les résultats suggèrent une sensibilité des tumeurs pulmonaires au traitement mais des travaux complémentaires sont nécessaires pour les confirmer. La réponse partielle pourrait s expliquer par le modèle choisi. En effet, nous avons choisi de traiter avec le cetuximab aérosolisé des tumeurs bien établies (tumeurs de 8 semaines), ce qui apparaissait cliniquement plus pertinent. Or, le traitement avec le cetuximab chez la souris se fait habituellement, par injection intrapéritonéale, juste après l induction tumorale (Masui et al., 1984 ; Fan et al., 1993) ou dans les deux semaines suivantes (Goldstein et al., 1995 ; Viloria-Petit et al., 2001 ; Matar et al., 2004). Des études ont démontré que l anticorps semblait plus efficace lorsque le traitement par le cetuximab était administré immédiatement après l inoculation des cellules ou peu de temps après (Masui et al., 1984 ; Fan et al., 1993). Dans notre étude, la différence de réponse observée entre les souris traitées par voie i.p. (partie II paragraphe II.3) et celles ayant reçu le cetuximab par voie pulmonaire à la même dose (partie II paragraphe V) va en ce sens. En effet, lors des étapes de validation du modèle animal, nous avons pu constater chez les deux animaux traités par voie i.p. une régression totale de la tumeur dès 4 semaines après l inoculation des cellules. Il serait donc maintenant intéressant de comparer l efficacité du cetuximab administré par aérosol ou par i.p. sur des tumeurs établies ou encore de tester l effet de l anticorps aérosolisé juste après l inoculation des cellules tumorales. 145

151 Discussion II La réponse partielle que nous avons observée pourrait s expliquer par le fait que les protéines de haut poids moléculaires peuvent être piégées dans le mucus bronchique ou dans le fluide alvéolaire et être opsonisées et dégradées (Patton, 2004). L équipe de Bitonti a d ailleurs montré que plus le poids moléculaire de protéines inhalées couplées au domaine Fc des IgGs était élevé (supérieur à 100 kda), plus leur biodisponibilité semblait diminuée suggérant un transfert transépithélial et/ou transendothélial limité (Bitonti et al., 2006 ; Dumont et al., 2007). Pour le moment, nous ne pouvons pas exclure un effet limité du cetuximab par voie pulmonaire mais nous ne pouvons pas non plus présager d une réponse similaire chez l homme. En effet, chez les souris BALB/c Nude qui sont immunodéficientes, seul le mode d action Fab dépendant de l anticorps intervient, limitant la réponse anti-tumorale. Chez l homme, le cetuximab entraîne également une réponse thérapeutique ADCC dépendante. Cette voie implique le recrutement de cellules effectrices du système immunitaire via leurs récepteurs de surface au domaine Fc des immunoglobulines (FcγR) (Tabrizi et al., 2006). 146

152 PARTIE III Expression du récepteur FcRn dans le cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules

153 Le récepteur FcRn, hétérodimère composé d une molécule apparentée au complexe majeur d histocompatibilité de classe I (chaîne α) et de la β2 microglobuline (β2m), est fortement exprimé au niveau des membranes des endosomes. Il a la capacité d interagir à ph acide avec le domaine Fc des IgGs (Junghans et al., 1997). Les IgGs endocytées peuvent se lier au récepteur FcRn, ce qui les protègent de la dégradation par les protéases des voies endocytiques (Ghetie et al., 1997) et permettra leur recyclage dans le plasma et les fluides interstitiaux. Le récepteur FcRn augmente donc la demi-vie sérique des IgGs et représente un mécanisme non négligeable dans la pharmacocinétique dans anticorps. En effet, en utilisant un modèle de souris déficientes dans l expression de FcRn, il a été démontré que les souris knock-out présentaient une clairance des IgGs dix fois supérieure à celle des animaux sauvages (Junghans et al., 1997). Par ailleurs, le récepteur FcRn facilite le passage transcellulaire des IgGs en autorisant leur transfert du compartiment sanguin vers les tissus et au travers des épithelia (Kim et al., 2007). Notamment au niveau pulmonaire, où il est exprimé au niveau des cellules épithéliales bronchiques, il permet le transport trans-épithélial d IgGs (Spiekerman et al., 2002 ; Sagakami et al., 2006). Il a également été décrit récemment comme jouant un rôle important dans la biodisponibilité de protéines de haut poids moléculaire conjuguées au domaine Fc des immunoglobulines administrées par voie pulmonaire (Bitonti et al., 2004 ; Low et al., 2005 ; Dumont et al., 2006). L équipe de Bitonti a démontré, chez le primate non humain, que le récepteur FcRn était impliqué dans l absorption de l erythropöétine couplée au domaine Fc des IgGs à travers l épithelium bronchique. Le récepteur FcRn facilite le passage de cette protéine de fusion du compartiment pulmonaire vers la circulation sanguine et limiterait sa dégradation par les macrophages résidents du poumon. Le récepteur FcRn pourrait donc avoir un rôle majeur dans la biodistribution, la pharmacocinétique et in fine la réponse thérapeutique d anticorps anticancéreux à visée pulmonaire administrés par inhalation. Compte tenu du rôle majeur que pourrait avoir le récepteur FcRn dans le devenir et l efficacité des anticorps administrés par voir pulmonaire et de l absence de données sur ce récepteur dans le cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules, nous avons entrepris d étudier son expression dans cette pathologie. Pour cela, l expression de la chaîne α du récepteur (FcRn α) et de la β2m ont été analysées par PCR en temps réel dans des tissus tumoraux et sains adjacents de patients atteints d un cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules. Puis, l expression protéique de FcRn α dans ces mêmes tissus a été étudiée par immunohistochimie. Afin de comprendre les mécanismes conduisant à la baisse d expression 148

154 de FcRn α dans les CBNPC, une première exploration épigénétique du gène FCGRT codant pour la chaîne FcRn α a été réalisée sur les mêmes tissus. 149

155 Matériels et Méthodes

156 Patient Code Type Diff Tumeur Extension Taille Tabac Sexe Stade Métastase patient histo tumeur primitive ganglionnaire tumeur (cm) (PA) P1 02T99 H Adéno Moy I T1 N0 M P2 02T126 H Adéno Peu I T2 N0 M P3 02T437 H Adéno Peu III T2 N2 M P4 02T630 H Adéno Moy I T2 N0 M0 6 0 P5 02T1039 H Adéno Peu III T4 N1 M P6 02T1864 H Adéno Peu III T4 N0 M P7 02T1897 H Adéno Peu I T2 N2 M0 4? P8 02T2202 H Adéno Peu I T2 N0 M P9 02T4394 H CE Moy III T2 N2 M P10 02T4444 H CE Moy III T4 N0 M P11 02T4500 H Adéno Moy II T3 N0 M P12 02T5406 H CE Moy II T3 N0 M0 5 0 P13 02T5591 H Adéno Moy II T2 N1 M P14 02T5716 H Adéno Bien I T2 N0 M P15 02T5827 F CE Moy I T2 N0 M0 8 0 P16 02T5872 H CE Bien II T3 N0 M P17 02T6046 F Autre Peu I T2 N0 M0 3 0 P18 02T6360 H CE Bien I T2 N0 M P19 02T6361 H Adéno Moy I T2 N0 M P20 02T6403 H Adéno Peu I T2 N0 M P21 02T6437 H Autre Peu IV?? M P22 02T6466 H Adéno Moy I T2 N0 M P23 02T6505 H Adéno Moy I T2 N0 M P24 02T6678 F Autre Peu III T2 N2 M P25 02T6740 H CE Moy I T2 N0 M P26 02T6769 H Adéno Peu III T4 N0 M P27 02T7051 H CE Bien III T2 N2 M P28 03T361 F Autre Moy III T2 N2 M P29 03T368 H Adéno Peu I T2 N0 M P30 03T426 H Adéno Moy I T2 N0 M0 4 0 P31 03T825 H CE Moy III T2 N2 M P32 03T842 H Adéno Peu III T4 N0 M P33 03T1005 H Adéno Bien II T1 N1 M P34 03T1337 H CE Moy IV T2 N0 M P35 03T1571 H CE Moy I T2 N0 M P36 03T4349 H CE Peu III T2 N2 M0 6+5? P37 03T4543 H Adéno Moy II T2 N1 M0 4 5 P38 03T4627 F Adéno Moy I T2 N0 M P39 03T4817 H Adéno Bien III T4 N2 M P40 03T5186 F CE Moy I T2 N0 M0 5 0 P41 03T5271 H Adéno Moy IV T2 N2 M P42 03T5893 F Adéno Moy I T2 N0 M0 5? P43 03T6784 H CE Bien I T2 N0 M0 9? P44 03T6806 H CE Bien I T2 N0 M P45 04T513 H Adéno Peu III T2 N2 M P46 04T1845 F Adéno Peu I T2 N0 M0 6 oui P47 04T2497 H CE Moy III T1 N2 M P48 04T2664 H Adéno Bien IV T4 N2 M1?? P49 04T2819 H Autre Bien III T4 N1 M P50 04T3315 H Adéno Bien I T1 N0 M0 2? P51 04T3740 H Adéno Peu I T2 N0 M P52 04T3819? Adéno Peu I T1 N0 M P53 04T4685 H Adéno Moy III T2 N2 M P54 04T4781 H Autre Peu I T2 N0 M P55 04T4904 H CE Bien I T2 N0 M P56 04T5940 F Autre? I T1 N0 M0 3 0 P57 04T7402 H Adéno Bien I T2 N0 M P58 04T6286 H Autre Peu IV T1 N1 M P59 04T7502 H Adéno Moy I T1 N0 M P60 04T7538 F Autre? I T1 N0 M P61 05T9 H CE Peu III T4 N0 M P62 05T67 H CE Moy I T2 N0 M P63 05T975 H Adéno Moy III T3 N0? Tableau 12 : Description des caractéristiques physiopathologiques de la cohorte de patients atteints de cancer broncho-pulmonaire. Les abbréviations sont les suivantes : Sexe : H = homme, F = femme ; Type histologique : Adéno = Adénocarcinome, CE = Carcinome épidermoïde ; Différenciation tumorale : Bien = tumeur bien différenciée, Moy = tumeur moyennement différenciée, Peu = tumeur peu différenciée ; Tabac (PA) : Consommation de tabac en paquets-années. Dans la colonne code patient, les deux premiers chiffres correspondent à l année de collecte du prélèvement. Les «?» indiquent des données manquantes.

157 Matériels et Méthodes III I- Matériel biologique. I.1- Prélèvements tissulaires. Les prélèvements de tissus broncho-pulmonaires ont été obtenus à partir de pièces opératoires de patients traités chirurgicalement pour un cancer primitif du poumon non à petites cellules sans radiothérapie ou chimiothérapie préalables (adénocarcinomes et carcinomes épidermoïdes essentiellement). Des échantillons de tissu tumoral et non tumoral (prélevé au moins à 3 cm du bord de la tumeur) ont été prélevés sur les pièces opératoires. Cette collecte a pu être organisée grâce aux chirurgiens thoraciques et médecins anatomopathologistes du CHU de Tours, à l hôpital Trousseau. Aucune opposition de prélèvements n a été exprimée de la part des patients. Les prélèvements pulmonaires ont été congelés dans de l azote dans un délai ne dépassant pas 30 minutes après l exérèse, puis conservés à -80 C. Notre étude inclut 63 patients opérés d un cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules entre 2002 et Pour chaque patient, les informations concernant le sexe, le statut tabagique, le diagnostic histo-pathologique, le degré de différenciation de la tumeur, le stade d extension tumorale ou encore la survie ont été collectés (Tableau 12). Le diagnostic histologique et le degré de différenciation de la tumeur ont été déterminés selon la classification relative aux tumeurs pulmonaires de l OMS (Brambilla et al., 2001). Le stade d extension du cancer pulmonaire a été défini en accord avec la classification TNM. Brièvement, la cohorte était composée de 53 hommes et de 10 femmes. 34 patients présentaient un adénocarcinome et 19 un carcinome épidermoïde. Ces deux types histologiques sont les plus fréquents chez les patients atteints de CBNPC. 40 cancers étaient bien ou moyennement différenciés, 21 peu différenciés, 42 ne présentaient pas d extension ganglionnaire régionale (N0 selon la classification ptnm) alors que 20 d entre eux étaient caractérisés par une extension ganglionnaire régionale (N1 et/ou N2), cinq patients présentaient des métastases (M1). Les tumeurs ont également été classées d après leur taille (22 étaient inférieures ou égales à 3 cm, 40 étaient supérieures à 3 cm). Par ailleurs, 49 individus présentaient des tumeurs primitives T1-T2 tandis que 13 d entre elles étaient classées T3-T4. Concernant les stades des cancers, 38 étaient de stade I ou II et 25 de stade III ou IV selon la classification ptnm. Sur ces 63 patients, au moins 48 d entre eux sont d anciens fumeurs. 152

158 Matériels et Méthodes III I.2- Lignées cellulaires. Les lignées cancéreuses pulmonaires H520, H460, RH2, A549, H23, H1838, H522, Calu 1 et les lignées immortalisées de cellules bronchiques épithéliales NL20, BEAS-2B et 16HBE14o- ont été obtenues auprès d ATCC et cultivées selon les recommandations du fournisseur. Les cellules ont été maintenues à 37 C dans une atmosphère humide avec 5% de CO 2 dans l air. La lignée immortalisée de cellules épithéliales de rein d origine canine MDCK-II et le clone 33 MDCK-II (stablement transfecté avec les séquences nucléotidiques codant pour FcRn α et β2m) ont été généreusement fournies par l équipe 6 «Immunogénomique et anticorps thérapeutiques», de l UMR CNRS 6239-GICC de Tours, dirigée par le Pr. Hervé Watier. Les MDCK-II parentales et le clone 33 ont été cultivés en milieu RPMI-Glutamax concentré en glucose et additionné de 10% de sérum de veau fœtal (Invitrogen), de pénicilline à 100 U/mL et de streptomycine à 100 µg/ml (Invitrogen). Le clone 33 a été maintenu en présence de 0,4 mg/ml d antibiotique G418. II- Analyse des transcrits de la chaîne α du récepteur FcRn et de la β2- microglobuline. II.1- Préparation des ARN. Les ARN totaux des lysats de lignées cellulaires ou des tissus broncho-pulmonaires ont été extraits en utilisant le kit «Rneasy Midi Kit» (Qiagen S.A., Courtaboeuf, France) selon les recommandations du fournisseur. Les ARN totaux de tissus broncho-pulmonaires ont été extraits par Chris Planque et Valentine Panel, doctorants de l équipe «Aérosol et Cancer Broncho-pulmonaire» de l unité INSERM U618. Les lysats de lignées cellulaires ont été préparés à partir de cellules cultivées en monocouche dans un flacon de culture de 75cm 2 et les lysats de tissus broncho-pulmonaires à partir de 130 à 250 mg des pièces chirurgicales broyées dans de l azote liquide. Les cellules ont été lysées à l aide de 4 ml de réactif RLT fourni dans le kit. Ce réactif contenant de l isothiocyante de guanidine et du β-mercaptoéthanol à 143 mm, permet la lyse des cellules et l inactivation rapide des RNAses cellulaires. Les broyats de tissus ont ensuite été homogénéisés avec un Ultraturax pendant 1 minute et centrifugés à 5000 g afin d éliminer les 153

159 Matériels et Méthodes III débris cellulaires. Les lysats cellulaires obtenus à partir des lignées ont été passés 5 fois au travers d une aiguille de 0,9 mm de diamètre reliée à une seringue. Puis, les lysats de lignées ou les surnageants de tissus contenant les ARN ont été additionnés d éthanol à 70% à raison d un volume d éthanol pour un volume de surnageant. Le mélange a ensuite été déposé sur une membrane de silice d une colonne filtrante fournie dans le kit. Cette étape avait pour but de fixer les acides nucléiques sur la colonne. Après un lavage de la colonne avec 2 ml de tampon «RW1», 160 µl d un mélange contenant 20 µl de DNase I (Qiagen) exempte de RNase et 140 µl de tampon d activité «RDD» ont été déposés sur la membrane et la colonne a été incubée pendant 45 minutes à température ambiante. Cette étape a été suivie de plusieurs lavages, tout d abord avec 2 ml de tampon «RW1» puis deux fois avec 2,5 ml de tampon «RPE» (contenant de l éthanol). Entre chaque lavage, une centrifugation a été effectuée pendant 5 min à 4000 g, à température ambiante. Enfin, les ARN totaux ont été élués avec 50 µl d eau stérile sans nucléases (Ambion, Courtaboeuf, France), et récupérés à la suite d une centrifugation de 3 min à 5000 g. La quantité d ARN totaux extraits a été mesurée par spectrophotométrie (BioPhotometer, Eppendorf, Le Pecq, France) en réalisant une lecture à 260 nm, et la pureté des ARN totaux a été évaluée à l aide du rapport des valeurs mesurées aux longueurs d ondes 260 et 280 nm. Les ARN ont été conservés à -80 C. II.2- Transcription inverse. Les ARN totaux purifiés à partir des tissus broncho-pulmonaires ont été rétrotranscrits en ADNc à l aide de la PowerScript Reverse Transcriptase (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, USA) en suivant les instructions du fournisseur. La réaction a été effectuée à 42 C pendant 1 heure dans un volume final de 20 µl. Le milieu réactionnel était composé de 1 à 2 µg d ARN totaux, 5 µm d oligonucléotides décamériques aspécifiques (Random decamers RETRscript, Ambion, USA), de dntp à la concentration de 1 mm chacun (Clontech, Saint Germain en Laye, France), de 20 U d inhibiteur de RNAse (Protector RNase Inhibitor, Roche Diagnostics, Meylan, France), du tampon de réaction une fois concentré et d une unité de PowerScript RT. 154

160 Figure 44 : Principe de la PCR en temps réel utilisant le SYBR Green. A- Lorsque l ADN est dénaturé, le SYBR Green émet peu de fluorescence; B- A la température d hybridation des amorces nucléotidiques, quelques molécules de SYBR Green se fixent aux hybrides doubles brins et émettent une faible fluorescence; C- Durant la phase de polymérisation, le nombre de molécules de SYBR Green s intercalant augmente, ce qui se traduit par une augmentation de l émission de fluorescence. La fluorescence émise est mesurée à la fin de cette étape. D- Un nouveau cycle commence, l ADN est dénaturé, les molécules de fluorophore libéré et l émission de fluorescence est faible.

161 Matériels et Méthodes III A la fin de la réaction, l enzyme a été dénaturée à 70 C pendant 15 minutes et les ADNc ont été stockés à -20 C jusqu à leur utilisation. Les ARN totaux purifiés à partir des lignées cellulaires ont été rétro-transcrits en ADNc à l aide de l AMV Reverse Transcriptase (Roche Diagnostics). Pour cela, 1 µg d ARN total a été incubé avec un mélange de dntp à la concentration de 1 mm chacun, 2,5 pmol/µl d oligo (dt) 20 (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) et du tampon de réaction concentré une fois (50 mm Tris-HCl, 8 mm MgCl 2, 20 mm KCl, 1 mm dithiothreithol ph 8.5) pendant 5 min à 65 C. 6 unités d inhibiteur de RNAse et 5 unités d enzyme AMV ont ensuite été ajoutées et la transcription reverse effectuée à 42 C pendant 1h. Une étape de dénaturation de l enzyme a été effectuée 5 min à 95 C et les ADNc stockés à -20 C. II.3- Réactions de PCR quantitatives en temps réel. II.3 a- Principe. La PCR quantitative en temps réel repose sur le même principe qu une PCR classique (étapes successives de dénaturation, d hybridation et d élongation) à la différence qu elle permet la quantification en temps réel de la quantité de produits d amplification néoformés grâce à un marqueur fluorescent. Les réactions de PCR quantitative en temps réel dans cette étude ont été effectuées en présence du fluorophore intercalant «SYBR Green» (Roche Diagnostics) dans un thermocycleur icycler iq Détection Système (Biorad, Marnes la Coquette, France). Le SYBR Green s intercale de façon non spécifique dans l ADN double brin en émettant un signal 1000 fois plus élevé que lorsqu il est non fixé (Figure 44). La fluorescence augmente à chaque cycle avec l accumulation des produits néoformés. Le cycle de la réaction d amplification à partir duquel la fluorescence devient supérieure au bruit de fond est appelé «Ct» ou «Threshold cycle». Une relation linéaire existe entre le logarithme du nombre de copies du gène et le Ct, il est donc possible grâce au Ct de déterminer le taux d ARN présent initialement dans l échantillon. 156

162 Eco RI* FcRnα ATG Eco RI pcr 2.1-TOPO 3,9kb β2m Xho I * Nhe I ATG Figure 45 : Représentation schématique des constructions plasmidiques pcr2.1-fcrn α et pgem-t Easy - β2m, d après M. Ohresser. Le sens d insertion des séquences codant pour FcRn α et β2m sont indiquées par les flèches.

163 Matériels et Méthodes III II.3 b- Mode opératoire. Toutes les amplifications ont été effectuées dans un volume réactionnel de 25µL à l aide d amorces oligonucléotidiques spécifiques des différents gènes testés. Ces amorces ont été choisies sur 2 exons différents ce qui permet de vérifier l absence d amplification génomique. Les séquences de ces amorces synthétisées par MWG-Biotech AG sont décrites dans le tableau 13. Chaque réaction incluait une courbe d étalonnage basée sur des dilutions en cascade d ADN plasmidique étalon, les points de gamme étant répétés au minimum deux fois. Chaque échantillon d ADNc a également été quantifié en duplicata. Le milieu réactionnel comprenait 100 ng d ARN total rétro-transcrit (ou 0,5 ng pour la quantification du gène codant la sous-unité ribosomique 18S), 1 unité de FastStart Taq DNA Polymérase, du SYBR Green 0,2 fois concentré, du tampon de réaction une fois concentré (50 mm Tris-HCl ph 8.3, 10 mm KCl, 5 mm (NH4) 2 SO4), 2 mm de MgCl 2, des dntp à la concentration chacun de 0,2 mm et de 0,2 µm de chaque amorce oligonucléotidique sens et antisens (Tableau 13). Les conditions d amplication sont répertoriées dans le tableau 14. II.3 c- Etablissement des courbes d étalonnage. Pour établir les courbes étalons, nous disposions des plasmides pgem - T Easy et pcr 2.1 contenant respectivement les séquences des gènes codant pour la β2-microglobuline et la chaîne alpha du récepteur FcRn (généreusement fourni par l équipe 6 de l UMR CNRS 6239-GICC) (Figure 45). L ADN plasmidique extrait de chaque clone d intérêt a été dosé au spectrophotomètre à 260 nm et sa concentration a été convertie en nombre de copies par µl. Les droites d étalonnage ont alors été établies en utilisant des dilutions successives de chaque ADN plasmidique d intérêt. 158

164 Matériels et Méthodes III Amorces Séquences Gène Orientation FcRn_for CCC TGG CTT TTC CGT GCT T FcRn α sens FcRn_rev TGA CGA TTC CCA CCA CGA G antisens β2m_for GCG TAC TCC AAA GAT TCA G β2-microglobuline sens β2m_rev AAA CCC AGA CAC ATA GCA A antisens 18S_for CGC GGT TCT ATT TTG TTG GTT TT sous unité sens 18S_rev TTC GCT CTG GTC CGT CTT GC ribosomale 18S antisens Tableau 13 : Séquences des différentes amorces oligonucléotidiques spécifiques des gènes codant pour FcRn α, β2-microglobuline ou la sous unité ribosomale 18S utilisées dans les réactions de PCR conventionnelles et de PCR en temps réel. Les séquences de ces amorces sont données dans le sens 5 vers 3 Nombre de cycle(s) Etape Durée Température Gène(s) 1 cycle Dénaturation 3 min 95 c FcRn α, β2m et 18S Dénaturation 30 sec 95 c FcRn α, β2m et 18S 35 cycles Hybridation 30 sec 65 c 61 c 56 c 18S FcRn α β2m Elongation et 30 sec 72 c FcRn α, acquisition β2m, 18S fluorescence Tableau 14 : Conditions des réactions de PCR quantitatives en temps réel pour l amplification des gènes codant pour FcRn α, β2-microglobuline ou la sous unité ribosomale 18S. 159

165 Matériels et Méthodes III Parallèlement, des gammes d étalonnage ont été réalisées pour le gène codant la sousunité ribosomique 18S. Pour cela, de l ARN extrait de cellules A549 a été rétro-transcrit, la séquence du gène amplifiée par PCR. L amplification des ADNc a été effectuée en utilisant une ADN polymérase thermostable (FastStart DNA Polymérase, Roche Diagnostics). Cette enzyme est idéale pour des réactions d amplification «Hot Start», puisqu elle est activée uniquement à l étape initiale de dénaturation. Cela réduit ainsi la formation de produits non spécifiques qui pourraient avoir lieu à des températures plus basses. Les réactions ont été effectuées dans un volume de 50 µl contenant : 10 ng d ARN total-rétro-transcrit, 1 unité de FastStart Taq DNA Polymérase, du tampon de réaction une fois concentré (50 mm Tris-HCl ph 8.3, 10 mm KCl, 5 mm (NH4) 2 SO 4 ), 2 mm de MgCl 2, des dntp à la concentration de 0,2 mm chacun et de 0,3 µm des amorces oligonucléotidiques 18S sens et antisens (Tableau 13). Les réactions de PCR ont été réalisées dans le thermocycleur Master cycler Gradient (Eppendorf). Après dénaturation des ADNc pendant 5 minutes à 95 C, 35 cycles ont été programmés. Chaque cycle était composé de : une étape de dénaturation des brins matrices de 30 secondes à 95 C, une étape d hybridation de 30 secondes à 65 C et une dernière étape pour l élongation à 72 C pendant 1 minute et 10 sec. La réaction comportait une élongation finale de 10 minutes à 72 C. La concentration en ADN a ensuite été convertie en nombre de copies par µl et des dilutions en cascade ont été effectuées pour la gamme étalon. L expression des gènes codant pour la chaîne FcRn α et la β2m a été rapportée aux valeurs de quantification du gène codant la sous-unité ribosomique 18S, les niveaux de quantification des messagers ont donc été exprimés en unités arbitraires. II.3 d- Contrôles de la spécificité de l amplification. A la fin de chaque PCR quantitative en temps réel et afin de vérifier la spécificité de l amplification, une courbe de fusion a systématiquement été réalisée à partir d un cycle de 10 sec. à 80 C suivi de 30 cycles de 10 sec. en augmentant la température de 0,5 C à chaque cycle. 160

166 Matériels et Méthodes III III- Analyse de l expression protéique de la chaîne α du récepteur FcRn. Cette étude a été réalisée avec l aide de Professeur Serge Guyetant, anatomopathologiste au CHU Trousseau de Tours et membre de l U618. III.1- Préparation des échantillons. La technique a été réalisée sur des prélèvements initialement fixés dans le formol puis inclus en paraffine. Brièvement, les échantillons ont été fixés dans une solution aqueuse de formaldéhyde à 4% pendant 48h, déshydratés dans des concentrations croissantes d éthanol, puis placés dans des bains successifs de xylène puis de paraffine liquide. Les prélèvements ont ensuite été enrobés dans la paraffine liquide à 56 C coulée dans un moule. Après refroidissement, des coupes de 4 µm d épaisseur ont été réalisées au microtome et étalées sur des lames de verre silanisées (Dakocytomation, Trappes, France). Les coupes ont ensuite été séchées pendant 60 min à 56 C puis placées dans une étuve à 37 C pendant une nuit. Puis, elles ont été déparaffinées par du xylène, réhydratées avec des concentrations décroissantes d éthanol et soumises à un démasquage des sites antigéniques dans un tampon EDTA ph 7,8 (MS unmasker, Microm Microtech, Francheville, France) à 98 C pendant 40 minutes. Après retour à température ambiante, les lames ont été placées dans un tampon PBS-Tween ph 7,6 (Microm Microtech) en attente de l immunodétection. III.2- Localisation de l expression de la protéine FcRn α par immunohistochimie. L immunohistochimie a été réalisée avec un automate (Autosteiner, Microm Microtech) selon la méthode suivante : dans un premier temps, l activité peroxydasique endogène des cellules a été bloquée par de l eau oxygénée à 3% pendant 10 min. Après rinçage avec du PBS-Tween, les lames ont été incubées avec l anticorps primaire 1G3 anti- FcRn α dilué au 1/50 ème dans du tampon PBS-Tween pendant 60 minutes à température ambiante. 161

167 Matériels et Méthodes III Les coupes ont été rincées avec du PBS-Tween puis incubées avec l anticorps secondaire couplé à de la streptavidine et de la peroxidase (DakoCytomation Envision +, Dako, France) pendant 30 minutes à température ambiante. La révélation a été effectuée avec du DAB (diaminobenzydine) qui donne une coloration brune des sites marqués. Après la réaction, une contre coloration des noyaux a été réalisée avec de l Hématoxyline de Harris pendant 20 sec. Pour chaque manipulation, un témoin négatif externe a été effectué en l absence d anticorps primaire, ainsi qu un contrôle isotypique. Les témoins positifs utilisés pour déterminer la dilution optimale d anticorps primaire pour les immunodétections sur les tissus bronchiques ont été les cellules MDCK-II parentales et transfectées et du tissu bronchique sain et du colon sain. IV- Etude de la méthylation du gène FCGRT. La méthylation est l une des principales modifications épigénétiques de l ADN chez les mammifères. C est une addition covalente d un groupement méthyl (CH 3 ) à une position 5 d une cytosine dans un dinucléotide CpG. Ceux-ci peuvent former des «îlots CpG», c està-dire des regroupements de CpG dans une région donnée avec un pourcentage supérieur à 50% de GC. IV.1- Détermination des sites CpG. Une séquence de 19,9 kb (de la position à ) retrouvée dans le chromosome 19 (numéro GenBank NC_ ) et contenant la séquence complète du gène FCGRT a été sujette à une analyse à l aide du logiciel CpG plot ( afin de déterminer la position d éventuels îlots CpG dans cette zone. La taille minimale pour un îlot a été établie à 100 bp et le pourcentage minimum de GC à 50%. IV.2- Préparation des ADN génomiques. Les ADNg ont été extraits des cellules A549 et des tissus broncho-pulmonaires à l aide du kit «Dneasy Tissue kit» (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur. L extraction à partir des tissus a été réalisée par Claire Bléchet et Jérôme Rollin, doctorants au sein de l équipe «Aérosol et Cancer Broncho-pulmonaire» de l unité INSERM U

168 Matériels et Méthodes III Pour les échantillons des patients, 25 mg de tissu broyé dans un mortier en présence d azote liquide ont été additionnés de 180 µl de tampon de lyse «ATL» en présence de 60 mau de protéinase K. Les échantillons ont ensuite été incubés 1 à 3h à 56 C jusqu à la lyse complète des tissus. Pour obtenir une préparation exempte d ARN, 2 mg/ml de RNAse A a été ajoutée aux préparations. Puis, les échantillons ont été successivement incubés avec du tampon «AL» contenant de l hydrochloride de guanidine (pour la dénaturation des protéines) et de l éthanol à %. Ils ont ensuite été placés sur une colonne fournie dans le kit, et ont subi une succession de centrifugation (1 min à 6000g) et de lavage par les tampons «AW1» et «AW2». L ADNg a été finalement élué à l aide de 200µL de tampon d élution AE (10mM Tris HCl, 0.5 mm d EDTA ph9.0) et stocké à -20 C. IV.3- Traitement des ADNg au bisulfite de sodium. Le traitement des ADNg au bisulfite de sodium (NaHSO 3 ) est une procédure basée sur une méthode de désulfonation qui permet de convertir les cytosines (C) non méthylées en uracile (U). Les résidus C méthylés sont protégés de la conversion (Frommer, 1992) (Figure 46). De cette façon, l information épigénétique est transformée en une information de type polymorphisme de séquence (C ou T) qui est facilement accessible par des techniques telles que la PCR ou le séquençage. 163

169 Matériels et Méthodes III cytosine uracile Figure 46 : Principe de conversion d un résidu cytosine non méthylé en un résidu uracile après traitement au bisulfite de sodium, d après Clark et al., Le kit «MethylSEQr TM Bisulfite Conversion» (Applied Biosystems, Courtaboeuf, France) a été utilisé dans notre étude pour le traitement au bisulfite des ADNg. Brièvement, 300 ng d ADNg (dans un volume de 45 µl) ont été incubés avec 5 µl de tampon de dénaturation MethylSEQr TM et incubés 15 min à 37 C. Les échantillons ont été ensuite incubés avec 100 µl de réactif de conversion MethylSEQr TM à 50 C à l abri de la lumière pendant 15h. Après le traitement au bisulfite, l ADN a été purifié sur une colonne filtrante fournie dans le kit. Brièvement, les échantillons ont été transférés sur une colonne fournie dans le kit et centrifugés 20 min à 500 g. Cette étape a été suivie de plusieurs lavages : deux fois avec 350 µl d eau ultra-pure puis avec 350 µl d hydroxide de sodium à 0.1 M et à nouveau avec 350 µl d eau ultra-pure. Entre chaque lavage, une centrifugation a été effectuée pendant 20 min à 500 g, à température ambiante. L ADN a été élué à l aide de 50 µl d une solution à ph7,6 contenant 10mM de Tris HCl et 1 mm d EDTA. Les échantillons ont été conservés à 4 C jusqu à utilisation. 164

170 Matériels et Méthodes III IV.4- Methylated Specific PCR ou MSP. La Methylated Specific PCR ou MSP est une technique simple pour déterminer le statut de méthylation d îlots CpG. Dans cette méthode, deux couples d amorces sont choisis pour amplifier spécifiquement soit l ADN méthylé (amorces M), soit l ADN non méthylé (amorces U). La MSP a été réalisée avec le kit Epitect MSP (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur. Brièvement, 100 à 120 ng d ADNg préalablement traités au bisulfite ou, 10 ng d ADN témoin (ADNg entièrement méthylé ou déméthylé traités au bisulfite (Qiagen)) ont été utilisés comme matrice pour une amplification par PCR en présence de 2X d Epitect Master Mix et 0,4 µm de chaque amorce (Tableau 15). Le programme d amplification était le suivant : une étape de dénaturation initiale (95 C, 10 min) puis 40 cycles chacun composé de : une étape de dénaturation des brins matrices de 15 secondes à 94 C, une étape de 30 secondes à la température d hybridation des amorces (Tableau 14), une étape d élongation à 72 C pendant 30 secondes et une étape d élongation finale à 72 C pendant 10 minutes. Les produits de PCR ont ensuite été séparés sur un gel d agarose (MetaPhor) à 3% en tampon TBE 1X contenant du bromure d éthidium (BET) à 0,5µg/mL. Produit (pb) ATTTTGAATAGAAGAAAAGTTTCGG ATAACCTCGATCTCTTAACCTCGTA 54,3 C 109 Îlot CpG Amorces Séquence Température Îlot 1 méthylé Îlot 1 non méthylé Îlot 2 méthylé Îlot 2 non méthylé Îlot 3 méthylé Îlot 3 non méthylé Îlot 4 méthylé Îlot 4 non méthylé FcRn 1M For FcRn 1M Rev FcRn 1U For FcRn 1U Rev FcRn 2M For FcRn 2M Rev FcRn 2U For FcRn 2U Rev FcRn 3M For FcRn 3M Rev FcRn 3U For FcRn 3U Rev FcRn 4M For FcRn 4M Rev FcRn 4U For FcRn 4U Rev ATTTTGAATAGAAGAAAAGTTTTGG ATAACCTCAATCTCTTAACCTCATA 52,2 C 109 TGGGATTATAGGTTTATTATTACGT TCTTTAATATCCTTCTACGAACCGA 54,3 C 184 TGGGATTATAGGTTTATTATTATGT CTCTTTAATATCCTTCTACAAACCAAA 54,3 C 185 GAGGGTATTGTTGTTAGTTTGGATC AAAACACGTAACTCCTCCCG 53 C-61 C 124 GAGGGTATTGTTGTTAGTTTGGATT AAAAAACACATAACTCCTCCCAAC 53 C-61 C 126 GTAGGTAGGGGCGAAGTTAGC AAAAAAAACAAACACAAAAAACGAC 54,3 C 140 TTAGGTAGGTAGGGGTGAAGTTAGT AAAAAAAACAAACACAAAAAACAAC 54,3 C 144 Tableau 15 : Séquences et températures d hybridation des différentes amorces oligonucléotidiques spécifiques des îlots CpG de la séquence FCGRT utilisées dans les réactions de PCR conventionnelles. Les séquences de ces amorces sont données dans le sens 5 vers 3 165

171 Matériels et Méthodes III V- Analyse statistiques. V.1- Analyses non paramétriques. Les différences de mesures d expression des différents gènes entre les tissus tumoraux et non tumoraux adjacents ont été évaluées avec un test de Wilcoxon pour échantillons appariés en utilisant le logiciel StatXact 8. La comparaison de la proportion de patients présentant une augmentation ou une diminution d expression génique dans les tumeurs en fonction des paramètres biologiques et cliniques des patients a été analysée par le test non paramétrique de Chi2 (Chi2 de Pearson). V.2- Analyse de la survie globale des patients. L analyse de survie a été réalisée en collectant les informations relatives à l état de santé des patients en janvier La relation entre l expression des gènes et le devenir des malades a été évaluée par la méthode classique de survie de Kaplan-Meier. Brièvement, l analyse de survie a été réalisée en se basant sur les valeurs d expression génique dans les tissus broncho-pulmonaires tumoraux et non tumoraux. Pour chaque gène, les patients ont été classés en deux groupes : un groupe correspondait aux individus présentant une expression génique inférieure à la valeur médiane et l autre groupe présentant une expression génique supérieure à la valeur médiane. Pour chaque groupe, une courbe de survie a été construite selon la méthode de Kaplan-Meier. 166

172 Résultats

173 Résultats III I- Analyse des transcrits de la chaîne α du récepteur FcRn et de la β2- microglobuline. Dans cette étude, la technique de PCR quantitative en temps réel a été utilisée pour analyser dans les échantillons de tissus tumoraux et sains adjacents à la tumeur provenant de patients atteints de cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules, les taux de transcrits correspondant aux gènes codant la chaîne α du récepteur FcRn (FcRn α) et la β2- microglobuline (β2m). La technique de PCR en temps réel choisie est basée sur l utilisation d un agent intercalant appelé SYBR Green qui, lié à l ADN, émet 1000 fois plus de fluorescence que sous forme libre. La quantification du produit de PCR est donc basée sur l'augmentation de fluorescence générée par le SYBR Green s'insérant dans la chaîne d'adn sous forme double brin. Le Ct (treshold cycle ou cycle seuil) correspond au nombre de cycles à partir duquel le signal de fluorescence dépasse le bruit de fond du détecteur de fluorescence. Une relation linéaire existant entre le logarithme du nombre de copies du gène et le Ct, il est possible de déterminer la quantité de matrice initialement présente dans l échantillon. Nous avons choisi d effectuer une quantification absolue en se basant sur l utilisation de courbes étalons établies avec des concentrations croissantes d ADN plasmidiques contenant les séquences codant les gènes d intérêt. Cette technique va nous permettre de déterminer précisément le nombre de copies des transcrits codant FcRn α et β2m présents dans les échantillons initiaux. I.1- Validation de la méthode. I.1 a- Normalisation des résultats. Des erreurs de quantification des ARN pouvant avoir lieu lors de l étape de rétrotranscription (variation de la quantité d ARN introduite dans la réaction ou dans le rendement de la rétro-transcription), les valeurs obtenues lors de la PCR en temps réel ont été normalisées. La normalisation se fait en rapportant la mesure d expression du gène d intérêt à celle d un gène de ménage exprimé de manière ubiquitaire dans les échantillons testés. Comme l expression de beaucoup de gènes de ménage classiquement utilisés pour la normalisation n est pas stable dans le CBNPC, nous avons choisi de rapporter l expression 168

174 Résultats III des gènes étudiés aux valeurs de quantification de l ARN ribosomique 18S dont l expression apparaît relativement stable dans différentes conditions pathologiques. I.1 b- Spécificité des dosages. Un dosage est spécifique si la PCR permet l amplification d une seule séquence correspondant au transcrit ciblé. La contamination des échantillons d ARN par de l ADN génomique est l une des causes possibles entraînant une perte de spécificité. Pour s affranchir de ce problème, les séquences des amorces ont été choisies sur deux exons différents afin de vérifier l absence d amplification génomique. En effet, les produits d amplification du gène pourront être distingués de ceux issus des transcrits car ils ont une taille plus élevée due à la présence de l intron entre les deux exons. Une autre méthode pour s assurer que seule la séquence d intérêt est amplifiée passe par la détermination des courbes de fusion des produits d amplification. Le principe est le suivant : après le dernier cycle de PCR, l ADN double brin est dénaturé par augmentation rapide de la température à 95 C puis reformé par baisse de la température jusqu à la température d hybridation. Puis, la température est à nouveau élevée jusqu à 95 C et la fluorescence lue en continu pendant l élévation de température. La température augmentant, l ADN double brin se dissocie et entraîne la libération du SYBR Green. Lorsque 50% de l ADN double brin est dissocié, la fluorescence chute alors brutalement. Chaque produit d'adn double brin synthétisé ayant une température de fusion (Tm) spécifique (température à partir de laquelle 50% de l'adn est sous forme double brin et 50% sous forme simple brin), la présence d un seul pic de fusion sur la courbe démontre l existence d une seule population de molécules amplifiées. La figure 47 illustre une courbe de fusion obtenue après amplification de FcRn α qui présente un seul pic de fusion démontrant une bonne spécificité du dosage. Des résultats similaires ont été obtenus lors de l amplification de la β2m et du 18S. 169

175 Résultats III Figure 47 : Courbe de fusion obtenue lors de la quantification de transcrits FcRn α par PCR en temps réel. I.1 c- Linéarités des dosages. La linéarité des dosages a été évaluée en déterminant les valeurs de Ct pour des quantités connue et croissantes d ADN étalon (ADN plasmidique contenant les séquences d intérêt). La figure 48 présente un exemple de courbes de fluorescence obtenues pour FcRn α. Une droite d étalonnage a ensuite été tracée à partir de ces données en exprimant les valeurs de Ct en fonction du logarithme du nombre de copies FcRn α (Figure 49). Avec les différents gènes et pour toutes les expériences, nous avons observé une relation linéaire entre le logarithme du nombre de copies de l ADN étalon et le cycle seuil, avec des coefficients de corrélation compris entre 0,991 et 0,

176 Résultats III 10 6 copies ADN plasmidique FcRn α 10 5 copies ADN plasmidique FcRn α 10 4 copies ADN plasmidique FcRn α 10 3 copies ADN plasmidique FcRn α 10 2 copies ADN plasmidique FcRn α 100 ng ADNc échantillon non tumoral 100 ng ADNc échantillon tumoral Figure 48 : Courbes étalons établies lors de la quantification de transcrits FcRn α par PCR en temps réel. Les courbes de fluorescence ont été obtenues avec des quantités connues d ADN plasmidique FcRn α variant entre 10 2 et 10 6 copies et pour les échantillons pulmonaires avec des quantités d ADNc correspondant à 100 ng d ARN rétro-transcrit. Coefficient de corrélation : ; Pente : ; Ordonnée à l origine : ; Y = X ; Efficacité de PCR : 98.2% Inconnus Standards Ct Logarithme du nombre de copies Figure 49 : Droite d étalonnage établie lors de la quantification de transcrits FcRn α par PCR en temps réel. Les différentes quantités d ADN plasmidiques FcRn α variant entre 10 2 et 10 6 copies sont indiquées par des ronds bleus (standards). Les quantifications des transcrits FcRn α présents dans les échantillons sont représentés par des carrés rouges (inconnus). Le coefficient de corrélation de la droite d étalonnage et l efficacité de la réaction de PCR figurent au dessus de la droite d étalonnage. 171

177 Résultats III I.1 d- Reproductibilité des dosages. Pour vérifier la reproductibilité de la méthode de dosage, les variations inter-essais ont été calculées pour chacun des gènes à partir des courbes étalons des différentes expériences. Le calcul des coefficients de variations (CV) correspond au rapport de l écart type des Ct sur la moyenne des Ct. Les tableaux 16 et 17 présentent les variations inter-essais de quantification des transcrits FcRn α, β2m et 18S déterminées sur 4 expériences différentes. Les coefficients de variation inter-essais moyens ne dépassent pas 5,5% indiquant une bonne reproductibilité de la technique de dosage. CV interessai Nombre de copies Cycle seuil Ecart type Réplicats Moyenne des Ct initiales (Ct) Ct (%) 1 13, ,91 1,00E+06 13,83 0,447 3, , , , ,67 1,00E+05 17,52 0,376 2, , ,37 1,00E+04 1,00E+03 1,00E , , , , , , , , , , , ,67 20,33 1,333 6,56 25,27 1,618 6,40 29,25 2,286 7,82 CV moyen 5,23 Tableau 16 : Contrôle de la reproductibilité inter-essai sur les valeurs standards de la gamme d étalonnage FcRn α. Les coefficients de variation inter-essai ont été calculés sur les variations des cycles seuils «Ct» des quantifications des différentes quantités d ADN plasmidiques FcRn α sur 4 expériences différentes de PCR en temps réel. 172

178 Résultats III Nombre de copies initiales Moyenne des Ct CV interessai Ecart type Ct (%) Gène 9,16 0,506 5,53 β2m 1,00E+08 10,18 0,713 7,01 18S 12,01 0,567 4,72 β2m 1,00E+07 13,5 0,553 4,09 18S 15,05 0,679 4,52 β2m 1,00E+06 17,34 0,553 3,19 18S 18,67 0,696 3,73 β2m 1,00E+05 20,52 0,94 4,56 18S 22,61 0,693 3,07 β2m 1,00E ,147 4,78 18S CV moyen 4,31 β2m 4,73 18S Tableau 17 : Reproductibilité inter-essai sur les standards des gammes d étalonnage β2m et 18S. Les coefficients de variation inter-essai ont été calculés sur les variations des cycles seuils «Ct» des différentes quantités d ADN plasmidique β2m ou 18S sur 4 expériences différentes. β2m : β2-microglobuline; 18S : sous-unité ribosomale 18S. 173

179 A B Expression du gène FcRn α FcRn α NT 34 FcRn α T Expression du gène β2-microglobuline β2m NT β2m T Figure 50 : Quantification des transcrits FcRn α (A) et β2-microglobuline (B) dans les tissus pulmonaires non tumoraux (NT) et tumoraux (T). Les médianes sont exprimées par des barres horizontales. Les valeurs de p ont été calculées à l aide d un test de Wilcoxon pour échantillons appariés. p=0.0002

180 Résultats III I.2- Analyse quantitative de l expression de FcRn α et de la β2- microglobuline. Les caractéristiques d expression des gènes ont été établies par la technique de PCR en temps réel décrite dans le chapitre précédent. Cette étude a porté sur les tissus bronchopulmonaires tumoraux et non tumoraux des 63 patients de la cohorte et sur 11 lignées de cellules pulmonaires cancéreuses ou immortalisées disponibles au laboratoire. I.2 a- Analyse comparative des expressions dans les tissus tumoraux et non tumoraux. I.2a α- Analyse statistique des différences d expression. Dans un premier temps, les résultats obtenus par PCR en temps en réel ont été comparés pour FcRn α et β2m dans les échantillons tumoraux et non tumoraux. La figure 50 montre que les médianes d expression de la β2m dans les tissus tumoraux (21363 copies pour 100 ng d ARN total rétro-transcrit) et non tumoraux (41051 copies pour 100 ng d ARN total rétro-transcrit) ne sont pas significativement différentes. Ce résultat est en accord avec les données de la littérature où il est décrit qu une variation d expression du gène codant la β2m est rare dans les cancers broncho-pulmonaires (Chen et al., 1996). Au contraire, les médianes d expression de FcRn α apparaissent significativement supérieures dans les tissus sains adjacents à la tumeur (97 copies pour 100 ng d ARN total rétro-transcrit) en comparaison aux tissus tumoraux (34 copies pour 100 ng d ARN total rétro-transcrit). 175

181 Variables Nombre de Patients FcRn α NT FcRn α T FcRn α NT > FcRn α T* Patients % Patients % p Type histologique Adénocarcinome Carcinome épidermoide Autres types CBNPC Différenciation de la tumeur Peu différenciée Bien/moyennement différenciée Taille de la tumeur 3 cm > 3 cm Stade I - II III IV Extension ganglionnaire régionale N0 N1 - N Tumeur primitive T1 - T2 T3 - T Métastase non oui Tableau 18 : Relation entre l expression du gène codant FcRn α dans les tissus bronchopulmonaires non tumoraux (NT) et tumoraux (T) et différentes variables physiopathologiques. * Une différence d expression de trois fois des transcrits codant FcRn α entre la zone non tumorale et la zone tumorale a été considérée comme significative.

182 Résultats III I.2a β- Analyse des différences d expression en fonction des paramètres physiopathologiques. Dans un deuxième temps, nous avons souhaité déterminer si les variations d expression entre les tissus cancéreux et non cancéreux du gène codant pour FcRn α pouvaient être corrélés avec les différents paramètres clinico-pathologiques. Cette étude a été mise en place sur les 57 patients de la cohorte analysée dont tous les paramètres étaient connus. Une différence d expression des transcrits codant FcRn α supérieure ou égale à 3 fois entre les tissus tumoraux et non tumoraux a été considérée comme significative et les patients regroupés selon ce critère. Le tableau 18 présente la répartition des patients en fonction du niveau d expression de FcRn α et des différents paramètres physiopathologiques. L analyse statistique réalisée avec le test de Chi2 de Pearson ne révèle pas de différence significative de répartition selon les niveaux d expression FcRn α et chacun des critères physiopathologiques (Tableau 18). I.2a γ - Analyse de la survie globale des patients Malgré une cohorte de taille relativement faible, une analyse de la survie globale a été réalisée sur l ensemble de la population des 63 patients opérés d un cancer bronchopulmonaire non à petites cellules entre 2002 et Les informations relatives à leur état de santé ont été collectées en janvier 2008 ; à cette date, 34 patients étaient vivants et 29 décédés. La méthode d analyse de survie Kaplan-Meier a été utilisée pour étudier la survie des patients en fonction de l expression du gène codant pour FcRn α dans les tissus tumoraux ou non tumoraux. Pour cela, la population a été divisée en deux : une première partie regroupant les patients ayant un taux d expression FcRn α supérieur à la médiane et l autre ayant un taux d expression inférieur à la médiane. Les courbes de survie (Figure 51) ne montrent pas de différences statistiquement significatives entre la probabilité de survie des patients et la valeur d expression de FcRn α qu elle soit inférieure ou supérieure à la médiane dans les tissus tumoraux ou non tumoraux, même si la petite taille de l échantillon ne nous permet pas de conclure définitivement. 177

183 Résultats III A Probabilité de survie FcRn α NT > médiane FcRn α NT < médiane Mois B Probabilité de survie Mois FcRn α T > médiane FcRn α T < médiane Figure 51 : Comparaison des courbes de survie des patients présentant un cancer broncho-pulmonaire et une expression de FcRn α dans les tissus non tumoraux (A) et tumoraux (B) inférieure ou supérieure à la médiane, selon la méthode de Kaplan-Meier. I.2b- Analyse comparative des expressions dans les lignées cellulaires. Le niveau d expression de FcRn α a également été évalué dans une dizaine de lignées pulmonaires dont nous disposions au laboratoire. Une importante différence d expression de FcRn α est apparue entre les différentes lignées, le nombre de copies s échelonnant de 23 copies (H520) à 4867 copies pour 100 ng d ARNtotal rétro-transcrit (H522) pour les lignées cancéreuses et de 270 copies (NL20) à 6749 copies pour 100 ng d ARNtotal rétro-transcrit (16HBE14o-) pour les lignées immortalisées de cellules bronchiques épithéliales (Tableau 19). Aucune différence significative d expression de FcRn α n a été observée entre les lignées cancéreuses et les lignées normales immortalisées. 178

184 Résultats III A Lignées Copies FcRn α B Lignées Copies FcRn α H520 H460 RH2 A NL20 BEAS-2B 16HBE14o H H Calu H Tableau 19 : Quantification des transcrits de FcRn α dans les lignées cancéreuses pulmonaires (A) et les lignées de cellules épithéliales bronchiques immortalisées (B) par PCR en temps réel. Les valeurs sont exprimées en unités arbitraires (nombre de copies pour 100 ng d ARNtotal rétro-transcrit). En conclusion : l expression du transcrit codant la chaine α du récepteur FcRn est significativement plus faible dans le tissu tumoral que dans le tissu sain adjacent à la tumeur de patients atteints de CBNPC. Par contre, aucune différence d expression n a été retrouvée entre les lignées cancéreuses pulmonaires et les lignées normales immortalisées. II- Analyse de l expression protéique de la chaîne α du récepteur FcRn dans les tissus tumoraux et non tumoraux. Dans cette seconde étude, nous avons recherché la présence de la protéine FcRn α dans les tissus broncho-pulmonaires par une technique d immunohistochimie. Dans un premier temps, la spécificité de l anticorps utilisé a été évaluée à l aide d une lignée cellulaire surexprimant la chaîne α du récepteur humain (MDCK II clone 33). Une fois l anticorps validé, l expression de FcRn α a été étudiée par immunohistochimie sur les échantillons de tissus broncho-pulmonaires tumoraux et non tumoraux des patients et l intensité du marquage analysée pour les différents échantillons. Cette étude a été réalisée avec l aide de Professeur Serge Guyetant, anatomo-pathologiste au CHU Trousseau de Tours et membre de l U

185 Résultats III II.1- Validation de la méthode. Pour cette étude, un anticorps monoclonal anti-fcrn α a été utilisé (anticorps 1G3). Cet anticorps a été généreusement fourni par le laboratoire LFB qui a purifié l anticorps à partir de la culture d un hybridome commercialisé par l ATCC. L anticorps est dirigé contre la protéine FcRn α de rat et pourrait présenter une cross-réactivité pour la protéine FcRn α humaine. Afin de s en assurer, sa spécificité pour la protéine FcRn α humaine a été analysée en utilisant les cellules MDCK II d origine canine transfectées avec la séquence du gène codant FcRn α humain (clone 33) et les cellules MDCK II parentales qui n expriment pas FcRn α (témoin négatif). Une étude par PCR en temps réel a révélé que le clone 33 présentait une surexpression du transcrit FcRn α humain de plus de fois par rapport aux cellules parentales. Une étude de transcytose réalisée au sein de l équipe 6 de l UMR CNRS GICC par le Dr. Marc Ohresser a, par ailleurs, permis de démontrer la fonctionnalité du récepteur dans ce clone. Ces résultats attestent de la surexpression du FcRn α humain à la fois au niveau transcriptionnel et protéique dans les cellules du clone 33. La spécificité de l anticorps anti- FcRn α a été évaluée sur le clone 33 et les cellules MDCK II parentales avec une technique identique à celle utilisée pour les tissus pulmonaires. Les résultats sont présentés figure 52 et montrent qu un marquage important est retrouvé au niveau du clone 33 et non des cellules parentales. L anticorps dirigé contre FcRn α de rat cross-réagit donc avec la protéine humaine. Figure 52 : Immunodétection de la protéine FcRn α dans les cellules MDCKII (gauche) et MDCKII clone 33 (droite). Les cellules ont été incubées avec l anticorps monoclonal 1G3 anti-fcrn α (1/50ème) et la révélation faite selon la méthode standard streptavidine-biotine et peroxydase. 180

186 B C D E Figure 53 : Immunodétection de FcRn α sur des tissus broncho-pulmonaires normaux. A, C, E : tissus marqués avec l anticorps 1G3 (1/50ème) ; B et D : contrôle isotypique.

187 Résultats III Dans un deuxième temps, l anticorps 1G3 a été utilisé pour analyser l expression de FcRn α sur des tissus humains de poumon normal (Figure 53). En accord avec ce qui est décrit dans la littérature pour l homme dans une étude avec un anticorps polyclonal dirigé contre un peptide de FcRn α (Spiekerman et al., 2002), un marquage spécifique a été retrouvé au niveau des cellules épithéliales bronchiques (bronchioles et bronches proximales) et des macrophages alvéolaires. Un marquage a également été observé dans le tissu alvéolaire au niveau des pneumocytes de type II et aux niveaux des glandes séro-muqueuses. Ces différentes mises au point indiquent que l anticorps 1G3 est adapté pour analyser l expression protéique de la chaîne α du récepteur FcRn sur des échantillons de tissus pulmonaires. II.2- Expression dans les tissus tumoraux et non tumoraux. L anticorps 1G3 validé a été utilisé pour évaluer l expression de FcRn α dans les échantillons appariés de tissu pulmonaire tumoral et sain adjacent à la tumeur. La figure 54 illustre les immunohistochimies réalisées sur les échantillons de patients présentant soit un carcinome épidermoïde, soit un adénocarcinome. Comme précédemment pour le tissu normal, un immuno-marquage a été retrouvé au niveau des cellules épithéliales et des macrophages alvéolaires au niveau du tissu non tumoral (A, C, E, G et I). Dans le tissu tumoral, un marquage diffus a été observé au niveau des cellules cancéreuses. Le plus souvent ce marquage est nettement plus faible en intensité dans les cellules tumorales que dans les cellules épithéliales de la zone non tumorale, ce qui est en accord avec les résultats de PCR quantitative. 182

188 Résultats III A B C D E F G H I J Figure 54 : Immunohistochimie de FcRn α dans des tissus pulmonaires non tumoraux (A, C, E, G et I) et tumoraux de type carcinome épidermoide (B, D et F) ou adénocarcinome (H et J). Les tissus ont été incubés avec l anticorps monoclonal 1G3 anti- FcRn α (1/50ème) et la révélation faite selon la méthode standard streptavidine-biotine et peroxydase. 183

189 Résultats III Pour évaluer si la différence d expression de FcRn α entre le tissu tumoral et le tissu non tumoral pouvait varier selon le type histologique, le niveau d expression de FcRn α a été étudié sur un tissu micro-arrays (TMA) regroupant 47 échantillons tumoraux de patients de la cohorte étudiée. L intensité de marquage a été évaluée, de façon semi-quantitative, par un anatomo-pathologiste en utilisant une échelle de 0 à 3 (0 = pas de marquage, 1 = marquage faible, 2 = marquage modéré, 3 = marquage intense). Cette méthode a permis de mettre en évidence une expression faible à modérée et parfois hétérogène de FcRn α dans les différents tissus tumoraux (Figure 55). A B C Figure 55 : Immunohistochimie sur tissu micro-arrays de tumeur broncho-pulmonaire. A : tissu marqué avec l anticorps 1G3 (1/50ème) ; B : contrôle positif; C : contrôle isotypique. L expression de FcRn α ne semblait pas varier en fonction du type histologique, ce qui est en accord avec les résultats obtenus pour l expression du transcrit codant FcRn α. Par contre, aucune corrélation, n a été observée entre les intensités de marquage obtenues sur les TMA et le niveau d expression du transcrit FcRn α obtenu par Q-PCR. En conclusion : l ensemble de ces résultats indique, en accord avec les données de RT-PCR quantitative, que l expression de FcRn α est faible dans le tissu tumoral et inférieure à celle observée dans le tissu non tumoral. Il existerait donc une diminution de l expression du récepteur FcRn dans le CBNPC. 184

190 Résultats III III- Etude de la méthylation du gène FCGRT. Dans les cellules normales, les événements épigénétiques ont un rôle très important dans le contrôle de l activité génique. Dans de nombreux cancers, des altérations épigénétiques sont responsables de la perte ou de l activation de la transcription de certains gènes. Ainsi, dans de nombreux cancers, l expression de différents gènes est éteinte suite à une hyperméthylation de novo au niveau de la séquence promotrice. Les résultats précédents ayant mis en évidence une diminution de l expression du gène codant FcRn α dans les tissus tumoraux de patients atteints de CBNPC, nous avons souhaité étudier le profil de méthylation du gène FCGRT codant FcRn α. FCGRT. III.1- Détermination de la présence d ilots CpG dans la séquence génique Le gène FCGRT n a pas encore, à notre connaissance, fait l objet d études épigénétiques. Nous avons donc évalué la présence d îlots CpG dans la séquence génique FCGRT à l aide du logiciel CpG plot ( La taille minimale pour un îlot a été établie à 100 bp et le pourcentage minimum de GC à 50%. Un total de 11 îlots a été détecté par le logiciel. Leur localisation est répertoriée sur la figure 56 : 19.9 kb Figure 56 : Représentation graphique de la séquence génomique de 19.9 kb du gène FCGRT (GenBank Number NC_ ). Les rectangles hachurés verts représentent les 6 exons, l exon alternatif est hachuré en gris. Les rectangles vides représentent la localisation des 11 îlots CpG identifiés. 185

191 Résultats III III.2- Méthylation des ilots CpG. Pour étudier le profil de méthylation de la séquence génique FCGRT, nous avons utilisé la méthode de la MSP (Methylated Specific PCR). Dans un premier temps, les ADNg ont été traités au bisulfite de sodium (NaHSO 3 ), technique qui permet la conversion des cytosines non méthylées présentes dans l échantillon en résidus uraciles, les cytosines méthylées étant protégées de la conversion (Frommer, 1992). La méthylation des îlots CpG de la séquence FCGRT a ensuite été évaluée par une étape d amplification par PCR avec des couples d amorces spécifiques aux séquences méthylées (amorces M) et spécifiques aux séquences non méthylées (amorces U). Cette technique MSP permet la détection de petits nombres d allèles méthylés dans un îlot CpG à partir de faibles quantités d ADN. Elle est facile et relativement rapide à mettre en œuvre et permet d avoir un profil global de la méthylation pour un îlot donné (Herman et al., 1996). Les îlots 1, 2, 3 et 4 ont été retenus pour cette analyse. Ces zones paraissaient plus pertinentes pour étudier la méthylation du gène car elles sont situées dans la région 5 du gène et couvrent en partie la région promotrice. Des amorces contenant au moins un site CpG ont été conçues pour amplifier ces régions nucléotidiques en fonction de leur statut de méthylation. Dans un premier temps, la MSP a été mise au point pour les différents couples d amorces. Les ADNg contrôles méthylé (Cm) et déméthylé (Cu) traités au bisulfite de sodium ont permis de mettre au point les conditions d amplification pour chaque couple d amorces. L ADNg entièrement méthylé extrait de cellules Jurkat et l ADNg extrait de cellules A549 (lignée de cellules cancéreuses pulmonaires exprimant modérément le transcrit codant FcRn α) ont été utilisés pour contrôler à la fois l efficacité du traitement au bisulfite et l amplification. La figure 57 illustre les produits de PCR obtenus avec les amorces spécifiques amplifiant les îlots 1, 2 et 4 ; l amplification avec les amorces spécifiques de l îlot 3 n ayant pas fonctionnée. Les ADNg contrôles méthylés ont été amplifiés seulement avec les amorces M et inversement pour les ADNg contrôles non méthylés. Un seul produit de PCR, à la taille attendue, a été obtenu avec chacun des couples d amorces. Ceci démontre une bonne spécificité de l amplification. Un produit de PCR a été retrouvé avec les deux couples d amorces pour l ADNg extrait des cellules A549. Cette hétérogénéité du statut de méthylation d un site CpG a déjà été reporté dans la littérature (Hubé et al., 2003) et pourrait être attribuée à une différence d état des cellules lors de la culture ou au fait que la lignée 186

192 Résultats III A549 ne soit pas isogénique. L amplification semblait cependant nettement plus marquée avec les amorces M. amorces M amorces U M M A- 109 pb 109 pb B- 184 pb 185 pb C- 140 pb 146 pb Figure 57 : Mise au point de la MSP avec des amorces spécifiques des îlots CpG 1, 2 et 4 détectés dans la séquence FCGRT. A : amplification avec les amorces spécifiques de l îlot 1 ; B : de l îlot 2 et C : de l îlot 4. 1 : ADNg de cellules Jurkat entièrement méthylé ; 2 : ADNg de cellules A549 ; 3 : Cm = contrôle méthylé et 4 : Cu = contrôle déméthylé ; 5 : eau. M : marqueur de masse moléculaire. Une fois la MSP mise au point, 20 échantillons d ADNg traités au bisulfite de sodium (extraits de tissus tumoraux et non tumoraux adjacents à la tumeur de 10 patients atteints de CBNPC) ont été utilisés comme matrice pour amplifier les séquences spécifiques des îlots 1, 2 et 4 (situés en région 5 non codante) (Figure 58). 187

193 Résultats III Ilot 1 Ilot 2 Ilot 4 P20 P20 P20 1U 1M 2U 2M 4U 4M M S T S T M S T S T M S T S T P31 1U 1M P31 2U 2M 4U P31 4M M S T S T M S T S T M S T S T Figure 58 : Analyse de la méthylation des îlots CpG 1, 2 et 4 du gène FCGRT chez des patients atteints de CBNPC par la méthode de la MSP. M : marqueur de masse moléculaire; S : Tissu sain adjacent à la tumeur ; T : tissu tumoral. Px : numéro des patients atteints de CBNPC. Les profils d amplification obtenus pour les patients P20 et P31, présentant respectivement un adénocarcinome et un carcinome épidermoïde, sont représentatifs de l ensemble des ADNg testés. La figure 58 illustre les résultats obtenus avec deux des patients de la cohorte et sont représentatifs de l ensemble des échantillons. Un produit de PCR a été observé après amplification avec les amorces M pour les îlots CpG 1 et 2 dans les échantillons sains et tumoraux. Au contraire, aucun ou un faible produit d amplification a été obtenu avec les amorces M de l îlot 4. Ceci indique que l ADNg extrait de la zone tumorale est méthylé au niveau des îlots 1 et 2 du gène FCGRT (situés en région 5 non codante) et pas ou peu au niveau de l îlot 4. Des bandes ont aussi été obtenues par l amplification avec les amorces U des îlots 1 et 2 témoignant d une hétérogénéité de la méthylation de l ADNg dans la zone tumorale. Cette hétérogénéité pourrait venir d une différence du profil de méthylation des différentes cellules tumorales et donc potentiellement d une variation de l expression génique, ou bien de la présence au sein de la zone tumorale de types cellulaires différents exprimant ou non le gène FCGRT. Ces deux hypothèses sont en accord avec les résultats 188

194 Résultats III d immunohistochimie obtenus précédemment. La différence d intensité des bandes observée entre les amorces M et U pourrait suggérer une hyperméthylation de l ADNg au niveau des îlots 1 et 2 de la zone tumorale, mais aussi une différence d efficacité de la PCR avec chacun des deux couples d amorces. La présence de produits de PCR avec les amorces M et U obtenus à partir de l ADNg de la zone non tumorale suggère les mêmes hypothèses. En conclusion : Ces résultats indiquent que le gène FCGRT, codant la protéine FcRn α, est méthylé au niveau des îlots CpG 1 et 2 (situés dans la région promotrice du gène) chez des patients atteints de CBNPC, ce qui pourrait contribuer à la régulation de son expression. 189

195 Discussion

196 Discussion III Le récepteur FcRn est un hétérodimère qui intervient spécifiquement dans la protection et le recyclage des IgGs. En effet, il les protège des voies cataboliques lysosomales et leur confère ainsi une longue demi-vie dans les fluides (Ghetie et al., 2002 ; Ward et al., 2003). Il participe également au transport transcellulaire des IgGs leur permettant de passer d un compartiment à un autre (Roopenian et al., 2007). Ce serait notamment le cas dans le poumon où il est exprimé à la fois par les macrophages alvéolaires et les cellules épithéliales bronchiques (Spiekerman et al., 2002). Au niveau pulmonaire, il a été démontré qu il facilite le passage vers le compartiment sanguin et augmente la demi-vie de macromolécules couplées au domaine Fc des IgGs (Bitonti et al., 2004 ; Low et al., 2005 ; Dumont et al., 2006). Compte tenu de son implication potentielle dans la biodistribution et le devenir des anticorps thérapeutiques administrés par voie pulmonaire, un des objectifs de ma thèse a été d étudier l expression de ce récepteur dans le cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules (CBNPC). Nous avons démontré que le récepteur FcRn était faiblement exprimé dans les tissus tumoraux de patients atteints de CBNPC et que son expression était moins importante dans le tissu tumoral que dans le tissu sain adjacent à la tumeur. Cette diminution d expression entre le tissu «sain» et le tissu tumoral pourrait avoir des conséquences dans la distribution des anticorps thérapeutiques au sein des tumeurs pulmonaires. Pour vérifier cette hypothèse, nous nous étions proposés de développer des modèles animaux de tumeurs sous-cutanées exprimant différents niveaux de FcRn α (chaine lourde du récepteur) et d analyser la fixation tumorale et la distribution intra-tumorale (par autoradiographie) d un anticorps couplé à l Iode 125. Malheureusement, les difficultés techniques rencontrées pour établir des lignées cancéreuses pulmonaires sur-exprimant ou non FcRn α ne nous ont pas permis d avancer dans l étude. La diminution d expression du récepteur FcRn dans le CBNPC soulève aussi des questions quant à l implication du récepteur dans le contrôle de la tumorigénèse. Outre ses fonctions vis-à-vis des IgGs, le récepteur FcRn permet la protection et le transport transcellulaire de l albumine (Anderson et al., 2006). La diminution de l expression de FcRn α pourrait donc avoir un impact à la fois sur l homéostasie des IgGs (naturelles) mais aussi de l albumine, dans le tissu pulmonaire chez des patients atteints de CBNPC, et limiter ses fonctions tampons et antioxydantes (Birn et al., 2006). 191

197 Discussion III L ADNg d une tumeur est globalement hypométhylé mais présente des zones spécifiques d hyperméthylation au niveau des séquences promotrices de gènes impliqués dans le contrôle du développement tumoral. Cette hyperméthylation contribue à l extinction de ces gènes (Sawan et al., 2008 ; Vaissière et al., 2008). Afin de déterminer si des modifications épigénétiques du gène FCGRT (codant FcRn α) pouvaient être associées à la diminution d expression de la protéine FcRn α dans les tumeurs pulmonaires, une première exploration du statut de méthylation du promoteur du gène a été réalisée. Nos résultats montrent pour la première fois, que le promoteur du gène peut subir des modifications épigénétiques au niveau des îlots CpG 1 et 2, localisés dans la région 5 du gène FCGRT. En l état actuel de nos travaux, il n est pas possible de déterminer si l hyperméthylation de l ADNg observée dans la zone tumorale est associée à un contrôle de l expression de FCGRT. Pour répondre à cette question, deux possibilités s offrent à nous : comparer par la technique de MSP, le niveau de méthylation d ADNg extraits de cellules tumorales isolées de prélèvements tissulaires par microdissection laser et celui d ADNg extraits de cellules bronchiques «saines». Ou bien étudier de façon précise la fréquence et le statut de méthylation de chacun des sites des îlots 1 et 2 par séquençage, après traitement au bisulfite de sodium des ADNg extraits des zones tumorales et non tumorales des échantillons. Il serait également intéressant de réaliser ce travail sur les îlots CpG qui n ont pas encore été étudiés. Une étude du statut de méthylation de FCGRT sur des ADNg extraits des lignées cancéreuses pulmonaires disponibles au laboratoire (exprimant FcRn α à des niveaux très différents) est actuellement en cours. 192

198 Discussion générale et Perspectives

199 Discussion générale et perspectives Le cancer broncho-pulmonaire constitue un problème de santé publique majeur dans les pays industrialisés car il représente la première cause de cancer chez l homme et son incidence ne cesse d augmenter. Les progrès des traitements systémiques restent lents et des avancées sont nécessaires pour optimiser les thérapies, telles que le développement de nouvelles molécules thérapeutiques ou de nouvelles modalités d administration. L objectif du premier volet de ma thèse était d évaluer l intérêt de l aérosolthérapie d anticorps anti-tumoraux, molécules récentes sur le marché montrant des résultats très satisfaisants en cancérologie, et offrant des potentialités pour le traitement du cancer bronchopulmonaire non à petites cellules (CBNPC). Pour la première fois, nous avons démontré, à travers l exemple du cetuximab, que les anticorps thérapeutiques anti-cancéreux pouvaient résister aux contraintes physiques imposées par la nébulisation, tout en soulignant l importance du choix du mécanisme d aérosolisation. De plus, nous avons montré que l aérosolthérapie permettait une longue persistance au niveau pulmonaire et un faible passage systémique de l anticorps. Ceci pourrait permettre d augmenter la concentration du médicament au niveau de son site d action et de limiter les effets secondaires systémiques importants retrouvés chez l homme avec ce type de traitement. Par ailleurs, notre modèle animal de tumeur broncho-pulmonaire a permis de mettre en évidence, par une analyse de fluorescence dans le proche infrarouge, que l anticorps administré par aérosol pouvait se fixer sur sa cible tumorale. L analyse de la localisation du cetuximab par immunohistochimie avec un anticorps anti-igg humaine, sur les prélèvements tissulaires des souris porteuses de tumeur broncho-pulmonaire ayant reçu l anticorps par voie pulmonaire, pourrait compléter ces résultats. Nos résultats préliminaires suggèrent également une sensibilité des tumeurs pulmonaires à l aérosolthérapie d anticorps ; des travaux sont actuellement en cours pour les valider. L ensemble de nos résultats indique donc que la voie inhalée serait une alternative intéressante à l administration systémique pour les anticorps monoclonaux recombinants dans le traitement du CBNPC. Néanmoins, notre étude préclinique chez la souris devra être complétée par des études chez un modèle de primate non humain avant d envisager une évaluation clinique chez l homme de cette nouvelle modalité d administration. Cette étude permettra d évaluer la biodistribution et la pharmacocinétique du cetuximab nébulisé dans un modèle plus proche de l homme, de déterminer l efficacité du dépôt pulmonaire avec des nébuliseurs utilisables chez l homme, la toxicité associée à cette modalité d administration et la dose maximale tolérée. 194

200 Discussion générale et perspectives La pharmacocinétique des IgGs est un champ d investigation majeur dans la compréhension et l amélioration de l efficacité des anticorps anti-cancéreux. De nombreuses études ont montré que le récepteur FcRn était un récepteur clé dans la biodistribution et l élimination des anticorps. En effet, ce récepteur exprimé notamment au niveau des cellules endothéliales et des cellules épithéliales (poumon...), a la capacité d augmenter la demi-vie sérique des IgGs en les protégeant de la dégradation par les protéases des voies endocytiques (Ghetie et al., 1997) et en permettant leur recyclage vers le compartiment extracellulaire. Il facilite également le passage transcellulaire des IgGs en autorisant leur transfert du compartiment sanguin vers les tissus et au travers des épithelia (Kim et al., 2007). Compte tenu de son impact dans le devenir des IgGs et de son expression au niveau du tractus pulmonaire (par les cellules épithéliales et les macrophages alvéolaires), nous avons entrepris dans le second volet de ma thèse d étudier l expression du récepteur FcRn, dans le cancer broncho-pulmonaire, afin d estimer son rôle dans la biodistribution et la pharmacocinétique des IgGs thérapeutiques administrées par voie pulmonaire. Nous avons démontré que l expression du récepteur FcRn était altérée dans le CBNPC. Notre étude a également mis en avant la possibilité d altérations épigénétiques du gène FCGRT, codant la chaîne lourde du récepteur, qui pourraient participer à la diminution d expression du récepteur dans le cancer broncho-pulmonaire. D un point de vue fonctionnel, une diminution de l expression du récepteur FcRn au niveau tumoral pourrait avoir des conséquences sur la pharmacocinétique et possiblement sur la distribution intra-tumorale des anticorps thérapeutiques administrés dans le traitement de tumeurs solides. In fine, le statut de l expression du récepteur FcRn au niveau des tumeurs broncho-pulmonaires pourrait être un facteur prédictif de la réponse à un traitement par un anticorps anti-cancéreux. Des études complémentaires sont nécessaires pour évaluer ces hypothèses. 195

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217 Annexe

218 Annexe AeronebPro PARI LC+ SYST AM LS290 Annexe 1 : Fonctionnements des appareils de nébulisation, selon Dautzenberg et al., De haut en bas : nébuliseurs à membrane vibrante (1), pneumatique (2) et ultrasonique (3). 213

219 Travaux Personnels

220 POSTERS et RESUMES 1. Maillet A, Congy-Jolivet N, Hureaux J, Vecellio L, Watier H, Diot P, Courty Y, Thibault G, Gagnadoux F, Urban T, Lemarié E et Heuzé-Vourc h N. Effet thérapeutique du cetuximab administré par aérosol dans un modèle animal de tumeurs broncho-pulmonaires. Importance du récepteur FcRn dans la réponse thérapeutique à cet anticorps. Présentation du projet de thèse, Nice, France. Rev Mal Respir 2006 ; 23 : Maillet A, Congy-Jolivet N, Hureaux J, Vecellio L, Watier H, Diot P, Courty Y, Thibault G, Gagnadoux F, Urban T, Lemarié E et Heuzé-Vourc h N. Effet de l aérosolisation du cetuximab sur sa reconnaissance antigénique, son efficacité antitumorale in vitro et sa toxicité intrinsèque chez l animal. Journée de Recherche Respiratoire, Tours, France. Rev Mal Respir 2006 ; 23(1) : Maillet A, Congy-Jolivet N, Hureaux J, Vecellio L, Watier H, Diot P, Courty Y, Thibault G, Gagnadoux F, Urban T, Lemarié E et Heuzé-Vourc h N. Effet de l aérosolisation du cetuximab sur sa reconnaissance antigénique, son efficacité antitumorale in vitro et sa toxicité intrinsèque chez l animal. 19 ème colloque Biotechno-Centre (9-10 novembre 2006), Seillac, France. 4. Maillet A, Congy-Jolivet N, Leguellec S, Vecellio L, Hamard S, Watier H, Diot P, Thibault G, Courty Y, Lemarié E and Heuzé-Vourc h N. Nebulization of anticancer antibodies: example of cetuximab. The 16 th International Congress of Society for Aerosols in Medicine, Tours, France. J Aero Med ; 20 : Maillet A, Congy-Jolivet N, Hureaux J, Vecellio L, Valo I, Lerondel S, Watier H, Diot P, Thibault G, Lepape A, Anthonioz P, Lemarié E and Heuzé-Vourc h N. 215

221 Antitumour antibodies delivered through airways in lung cancer. Effect of nebulization and development of an animal model sensitive to cetuximab. 12 th world conference on lung cancer, Séoul, South Korea. J Thor Onc 2007 ; 2(8) : Maillet A, L. Guilleminault, S. Pesnel, G. Paintaud, N. Congy-Jolivet, G. Thibault, S. Lerondel, E. Lemarié, N. Heuzé-Vourc h. Aerosoltherapy in lung cancer. EACR European Asoociation for Cancer Research (4-8 juillet 2008), Lyon, France. 7. Maillet A, L. Guilleminault, S. Pesnel, G. Paintaud, N. Congy-Jolivet, G. Thibault, S. Lerondel, E. Lemarié, N. Heuzé-Vourc h. Aerosoltherapy in lung cancer. Journée de Recherche Respiratoire (10-11 octobre 2008), Grenoble, France 216

222 PUBLICATIONS SCIENTIFIQUES Publications originales dans des revues à comité de lecture 1. Maillet A, Congy-Jolivet N, Le Guellec S, Vecellio L, Hamard S, Courty Y, Courtois A, Gauthier F, Diot P, Thibault G, Lemarié E and Heuzé-Vourc h N. Aerodynamical, Immunological and Pharmacological Properties of the Anticancer Antibody Cetuximab Following Nebulization. Pharmaceutical Research,( 2007) 25 : Publications dans des revues de vulgarisation 1. Heuzé-Vourc h N, Maillet A, Lemarié E, Diot P and Vecellio L. Insuline et chimiothérapie inhalée : le point de vue des chercheurs et des pneumologues. Réseaux Respiratoires (2008) 27 : Heuzé-Vourc h N, Maillet A, Lemarié E, Diot P and Vecellio L. Chimiothérapie inhalée et cancer du poumon : le point de vue des chercheurs et des pneumologues. Réseaux Cancer (2008) 34 :

223 COMMUNICATIONS ORALES 1. Maillet A, Congy-Jolivet N, Hureaux J, Vecellio L, Watier H, Diot P, Courty Y, Thibault G, Gagnadoux F, Urban T, Lemarié E et Heuzé-Vourc h N. Aérosolisation et marquage isotopique du cetuximab pour étudier son efficacité thérapeutique et sa biodistribution dans un modèle animal de tumeurs broncho-pulmonaires. Cancéropôle Grand Ouest Axe vectorisation tumorale (13 mars 2007), Angers, France. 2. Maillet A, Congy-Jolivet N, Leguellec S, Vecellio L, Hamard S, Watier H, Diot P, Thibault G, Courty Y, Lemarié E and Heuzé-Vourc h N.Nebulization of anticancer antibodies: example of cetuximab - The 16 th International Congress of Society for Aerosols in Medicine (18 juin 2007), Tours, France. 3. Guilleminault L, Maillet A, Pesnel S, Paintaud G, Congy-Jolivet N, Thibault G, Lerondel S, Lemarié E, Heuzé-Vourc h N. Aerosoltherapy in lung cancer. ERS - European Respiratory Society Annual Congress (6 octobre 2008), Berlin, Allemagne. 218

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230 Agnès MAILLET EFFET THÉRAPEUTIQUE DU CETUXIMAB ADMINISTRÉ PAR AÉROSOL DANS UN MODÈLE ANIMAL DE TUMEUR BRONCHO- PULMONAIRE Importance du récepteur FcRn dans la réponse antitumorale à cet anticorps Résumé Le but de cette étude a été d analyser l intérêt de l aérosolthérapie d anticorps monoclonaux (AcM) dans le traitement du cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules (CBNPC) en utilisant le cetuximab, un AcM anti-egfr. L expression du récepteur FcRn, essentiel dans la pharmacocinétique et la biodistribution des IgGs thérapeutiques a été étudiée dans le CBNPC. Nos résultats montrent que l AcM peut résister aux contraintes physiques de la nébulisation. Les données de biodistribution et pharmacocinétique, obtenues dans un modèle animal, indiquent que l Ac administré par aérosol, s accumule de façon prolongée au niveau pulmonaire. De plus, les tumeurs chez la souris paraissent sensibles à l aérosolthérapie avec l AcM. Par ailleurs, le récepteur FcRn est moins exprimé au niveau transcriptionnel et protéique dans le tissu tumoral que dans le tissu sain adjacent à la tumeur dans le CBNPC. Cette altération de l expression pourrait être due à l hyperméthylation du promoteur de ce gène. Mots-clés : cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules, aérosolthérapie, anticorps thérapeutiques, récepteur FcRn Résumé en anglais The project aims at determining whether aerosoltherapy is well suited for monoclonal antibodies (Mab), in Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC). In addition, exploration of the expression of FcRn, an IgG receptor contributing to increased half-life and biodistribution of Mab, has been studied in NSCLC. Using cetuximab, an anti-egfr Mab, we showed that Mab resist the physical constraints of nebulization. Biodistribution and pharmacokinetic analyses, using a murine model, revealed that cetuximab is highly and durably accumulated within the lungs and slowly and weakly released into the bloodstream following airways delivery. Moreover, animal tumors seem sensitive to cetuximab aerosoltherapy. Expression analysis of FcRn at both the transcript and protein levels showed that the receptor is downregulated in NSCLC. FcRn alteration of expression in the tumor might be due to hypermethylation of the gene promoter as often found in cancer. Keywords : non small cell lung cancer, aerosoltherapy, therapeutic antibody, FcRn receptor