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1 Département de biologie Page 1 sur 6 TP de Biologie Moléculaire : BIO 36 Marion Benoîst, Keith Dudley, Dominique Charmot Introduction Lors de ce TP vous allez cloner des molécules d ADN. L objectif est de vous faire découvrir les principales étapes d une expérience de clonage puis d analyser vos résultats. Vous devez porter une blouse blanche et aussi mettre des gants de type chirurgical. Ce que vous allez faire n est pas dangereux, mais la blouse et les gants vous assurerons une protection lorsque vous manipulerez les réactifs chimiques et les bactéries. En outre, vous éviterez de contaminer les réactifs par les molécules présentes sur vos doigts. Nous allons vous montrer comment exécuter les différentes étapes de l'expérience. L exercice que vous allez trouver sans doute le plus difficile est celui de pipeter (= prélever un volume déterminé d un liquide) avec les «pipetman» (dispositif permettant de faire ces prélèvements avec une grande précision). Il faut regarder, avec l aide d un enseignant, comment utiliser ces pipettes. Vous allez travailler avec de très petits volumes, mesurés en microlitres (abréviation : µl): 1µl est un millionième de litre. Les principales étapes de l expérience que vous allez faire sont les suivantes : 1. Digestion de l ADN par les enzymes de restriction EcoRI et HindIII. À la fin de la digestion, vous avez produit plusieurs fragments d ADN de tailles différentes. 2. Digestion d un plasmide (pbluescript) avec EcoRI et HindIII. Vous allez cloner les fragments de l étape 1 dans ce plasmide. 3. Inactivation des enzymes de restriction. 4. Ligation des fragments produits dans l étape 1 dans le plasmide traité dans l étape 2, en utilisant une ligase (une «colle moléculaire») 5. Analyse par électrophorèse sur gel d'agarose des fragments d ADN produits pendant les digestions 1 et 2. (logiquement, cette étape devrait être réalisée avant l étape de ligation ; vous la faites pendant la ligation pour une question de temps). 6. Introduction des molécules recombinantes produites pendant l étape 4 dans les bactéries par transformation chimique. 7. Étalement des bactéries sur les boîtes de Pétri : la substance qui est au fond de la boîte de Pétri est une sorte de gel : de l agar (extrait d algues) dans lequel on a inclut de l ampicilline et un réactif chimique appelé X-gal.

2 Département de biologie Page 2 sur 6 Étapes 1 et 2 : les digestions par les enzymes de restriction Sur votre paillasse (= plan de travail), vous allez trouver dans un portoir les tubes suivants qui contiennent: De l ADN du bactériophage lambda (1µg/µl) [1 µg= 1 millième de gramme] De l ADN du plasmide pbluescript (1µg/µl) De l eau stérile Du tampon de digestion (10X [10 fois concentré] ; donc il devra être dilué 10 fois) De l enzyme de restriction EcoRI (5unités/µl) De l enzyme de restriction HindIII (5unités/µl) Digestion de l ADN lambda Préparer un tube Eppendorf (de contenance 1,5ml) en mettant dans l'ordre indiqué : 1µl ADN lambda (tube 1 du portoir des réactifs) 2µl tampon 15µl d'eau 1µl Eco R1 1µl Hind III Soit un volume final de 20 µl Les enzymes sont dans un tampon avec du glycérol ; donc quand vous les ajoutez aux réactifs déjà présents dans le tube, le glycérol, plus dense, tombe au fond sans se mélanger. Il faut homogénéiser avec précaution les réactifs avec le pipetman ou par tapotage. Mettez le tube à 37 C (dans le bain-marie) pendant 30 minutes Digestion du plasmide La digestion du plasmide se fait de la même manière. Préparer un second tube Eppendorf (de contenance 1,5ml) en mettant dans l'ordre indiqué : 1µl du tube contenant le plasmide pbluescript (tube 2 du portoir des réactifs) 2µl tampon 15µl d'eau 1µl Eco R1 1µl Hind III Soit un volume final de 20 µl Les enzymes sont dans un tampon avec du glycérol ; donc quand vous les ajoutez aux réactifs déjà présents dans le tube, le glycérol, plus dense, tombe au fond sans se mélanger. Il faut homogénéiser avec précaution les réactifs avec le pipetman ou par tapotage. Mettez le tube à 37 C (dans le bain-marie préchauffé à cette température) pendant 30 minutes

3 Département de biologie Page 3 sur 6 Commentaire : 1 unité d enzyme peut digérer 1µg d ADN en une heure. Vous allez utiliser 5 unités d enzyme (contenues dans un microlitre d enzyme) pendant 30 minutes ce qui est plus que suffisant pour digérer 1µg de plasmide. On utilise habituellement plus d enzyme que nécessaire (= on dit que l on travaille en excès d enzyme). Étape 3 : l inactivation des enzymes de restriction à la fin des digestions À la fin de la digestion, il faut chauffer les deux tubes à 70 C (en les transférant dans un bain-marie chauffé à cette température) pendant 10 minutes, pour inactiver les enzymes. Les enzymes sont des protéines et à 70 C leurs structures secondaires et tertiaires sont fortement modifiées, et de ce fait, elles ne sont plus actives. Étape 4 : la ligation Il faut d abord centrifuger brièvement les deux tubes car pendant l inactivation il se produit un peu d évaporation : des gouttelettes se sont formées sur la paroi et le capuchon des tubes. Donc, vous centrifugez les deux tubes pendant 10 secondes dans la microfuge (une petite centrifugeuse de paillasse). Les gouttelettes retombent au fond du tube. ATTENTION à la manière de disposer les tubes dans la centrifugeuse!!! Ils doivent être dans des supports diamétralement opposés! Mettre ensuite les tubes dans de la glace pilée, dans une boîte de polystyrène, pendant que vous préparez les tubes de l étape suivante. Vous allez faire maintenant 3 ligations, chacune dans un tube Eppendorf différent : 1. une fraction du plasmide plus 2µl de l ADN lambda 2. une fraction du plasmide plus 4µl de l ADN lambda 3. une fraction du plasmide seul (= sans ajouter de l ADN de lambda) Les ligations se font dans un volume final de 10µl. Vous avez dans le portoir les tubes contenant : du tampon de ligation (5X [concentré 5 fois] ; donc il devra être dilué 5 fois) de l enzyme ligase (concentration de l enzyme dans le tube : 1unité/µl) Ligation des molécules : Dans chacun des 3 tubes Eppendorf (contenance :1,5ml), vous ajoutez dans l'ordre indiqué: 2 µl de plasmide 2 µl de tampon de ligation 5X Ligation 1 : on ajoute 2 µl l ADN lambda plus 3 µl d eau Ligation 2 : on ajoute 4 µl l ADN lambda plus 1 µl d eau Ligation 3 : on ajoute 5 µl d eau Et enfin1 µl de ligase

4 Département de biologie Page 4 sur 6 Ne jetez surtout pas les tubes dans lesquels vous avez fait les digestions!!! Laissezles dans la boîte à glace. Vous allez en avoir encore besoin!! Tableau récapitulatif : Ordre dans lequel on ajoute les réactifs Laissez les 3 tubes dans le portoir sur la paillasse : 60 minutes à température ambiante Étape 5 : analyse par électrophorèse des fragments à l issue de la digestion des étapes 1 et 2 Normalement après avoir effectué la digestion de l ADN, il faut vérifier que les enzymes ont bien fonctionné, avant de procéder aux étapes suivantes. Nous sommes obligés ici de faire les ligations avant de savoir si les digestions sont bonnes (= complètes), car le temps imparti à ce TP d initiation à la biologie moléculaire est court. Vous allez faire migrer sur un gel d agarose 1% (=1g d agarose pour 100ml de tampon) les fragments d ADN que vous avez produits pendant les digestions. Vous allez faire migrer en parallèle des marqueurs de taille, ce qui va vous permettre de déterminer la taille des fragments obtenus à l issue de la digestion, et vous assurer de la conformité des résultats de la digestion par rapport à vos attentes lorsque vous avez établi le protocole. Préparation des échantillons pour le gel : Dans des tubes Eppendorf (contenance 1,5ml) mettre dans l ordre indiqué : Tube A Tube B Tube C µl de la digestion de lambda 2 µl de tampon «bleu de charge» 4 µl d eau stérile 2µl de la digestion du plasmide 2 µl de tampon «bleu de charge» 6 µl d eau 2 µl des marqueurs de taille 2 µl de tampon «bleu de charge» 6 µl d eau Donc, volume final : 10 µl Charger les gels. Tube 1 Tube 2 Tube 3 2 µl de plasmide 2 µl de tampon de ligation 5X 2 µl l ADN lambda 2 µl de plasmide 2 µl de tampon de ligation 5X 4 µl l ADN lambda 2 µl de plasmide 2 µl de tampon de ligation 5X 4 3 µl d eau 1 µl d eau 5 µl d eau 5 1 µl de ligase 1 µl de ligase 1 µl de ligase

5 Département de biologie Page 5 sur 6 Commentaire : Le tampon «bleu de charge» contient du glycérol pour rendre le mélange plus dense que le tampon de migration (nom du tampon de migration : TAE 1X). Du coup, on peut charger les échantillons dans les puits du gel, et l'adn tombe au fond du puits. Le colorant bleu dans le tampon de charge se comporte dans la migration comme une molécule dont la taille est 50 nucléotides. La position du bleu va donc être celle du front de migration (= donc les fragments d ADN, si leur taille est supérieure à 50 nucléotides, seront en arrière de la zone bleue dans le gel) Nous allons vous montrer comment charger le gel, avec quel volume, comment faire la migration, pendant combien de temps. ATTENTION : - il faut réfléchir au sens de la migration pour placer correctement le gel dans la cuve d électrophorèse. L ADN porte une forte charge négative. - Il faudra aussi surveiller la migration en regardant régulièrement où se trouve le colorant bleu (= le front de migration, voir plus haut). Étape 6 : la transformation des bactéries par les produits de la ligation Il faut maintenant transformer les bactéries, c'est-à-dire introduire dans les bactéries les molécules que vous avez produites pendant la ligation. Vous avez des bactéries "chimio-compétentes" : cela signifie que ces bactéries ont été traitées avec un tampon spécifique pour les rendre plus perméables aux molécules d ADN. Pour la transformation, dans des tubes mettre stérilement (c est-à-dire près du bec Bunsen): 50 µl de bactéries compétentes Tube 1 5 µl de la ligation du tube 1 50 µl de bactéries compétentes Tube 2 5 µl de la ligation du tube 2 50 µl de bactéries compétentes Tube 3 5 µl de la ligation du tube 3 Mettez les tubes dans la glace pilée, pendant 10 minutes. Transférez les tubes très rapidement dans un bain marie préchauffé à 42 C pendant 2 minutes. Transférez les tubes encore une fois dans la glace 5 minutes. Ajoutez 300 µl de milieu L-broth. [broth = bouillon] (Le L-broth contient un mélange de molécules nutritives [les sucres, les acides aminés] pour les bactéries.) Mettre les tubes dans un bain-marie à 37 C pendant 30 minutes.

6 Département de biologie Page 6 sur 6 Étape 7 : étalement des bactéries transformées sur des boîtes de Pétri contenant du milieu de culture Centrifugez les trois tubes de transformations pendant 1 minute dans le microfuge à vitesse maximale (centrifugeuse de paillasse). N oubliez pas d équilibrer!!!! Vous allez obtenir un culot de bactérie. Vous aspirez délicatement le surnagent à l aide de la pipette, vous jetez le surnageant, et vous ajoutez 75 µl de L-broth pour re-suspendre les bactéries (= faire que les bactéries ne soient plus tassées dans le culot, mais réparties de manière homogène dans le milieu de culture), à l aide la pipette, sans faire de bulles : il faut manipuler avec précautions! Vous allez maintenant étaler stérilement les bactéries sur les boîtes de Pétri, avec des billes de verres (qui ont été stérilisées auparavant). Chaque tube de transformation sera étalé sur une boîte de Pétri. Nous allons vous montrer comment faire l étalement avec des billes de verre. IMPORTANT : o N'oubliez pas de marquer vos boites avec vos noms et le n de la ligation. o A votre avis, vous identifiez vos trois boîtes de Pétri en écrivant sur le fond de la boîte ou sur le couvercle? ETAPE ULTIME : vous RANGEZ votre plan de travail avant de partir!!!!!! Les boîtes de Pétri sont mises à 37 C toute la nuit dans un incubateur réglé à cette température. La présence d un antibiotique (ici l'ampicilline) dans l agar va empêcher les bactéries sans plasmide (= non transformées) de pousser. Le lendemain, on devrait avoir des colonies sur les boîtes : une colonie est un clone de bactéries (= toutes les bactéries d un clone descendent d une seule cellule bactérienne initiale) qui contiennent toutes le même plasmide. Ces colonies sont visibles à l œil nu. Les colonies bleues sont non-recombinantes, les blanches sont recombinantes. Les enseignants se chargeront de sortir vos boîtes, de les mettre dans une chambre froide à 4 C pour stopper la croissance bactérienne tout en préservant leur viabilité. Mercredi, de 14 à 16h, nous observerons les boîtes, puis nous commenterons et interpréterons ensemble vos résultats. BONNES MANIPULATIONS!!!!!