aute Ecole Lucia de Brouckère : Institut Meurice Pollution des rivières par les hormones synthétiques présentes dans la pilule contraceptive. Travail de chimie organique environnementale Nicolas Uyttebroeck 2010-2011
Contenu Pourquoi s intéresser aux hormones?... 2 Description des molécules... 2 Estradiol (E2) :... 13 Ethinylestradiol (EE2) :... 13 Estrone (E1) :... 14 Estriol (E3) :... 14 Les effets recherchés.... 3 Les effets dans la nature... 3 a) Sur les truites arc-en-ciel.... 3 b) Effets de EE2 sur les poissons zèbres... 4 c) Sur les rats... 5 Méthodes analytiques... 6 Méthodes d épuration... 8 a) Traitement à l ozone... 8 b) Traitement chimique... 9 c) Traitements biologiques... 10 Conclusion... 10 Bibliographie... 11 1
Pourquoi s intéresser aux hormones? Bon nombre de molécules issues de l industrie ont un effet sur le système endocrinien. On peut se demander pourquoi on s intéresse tant aux hormones. C est parce que les hormones ont un faible seuil d effet et une haute efficacité. Une concentration de l ordre de 0.1 à 0.5 ng/l peut engendrer des effets néfastes sur la santé des organismes aquatiques. De plus certaines études ont montré leur capacité d accumulation dans les sédiments. Les hormones naturelles ou synthétiques ne sont pas métabolisées par le corps humain et atteignent les stations d épuration par les excréments. Une faible partie est retenue, de l ordre de 10%, et le reste est déversé dans les eaux de surface. La faune de nos rivières n est pas la seule à être atteinte par cette pollution. En effet, lors de la production d eau potable à partir de nos rivières, tous les composés chimiques et pharmaceutiques ne sont pas supprimés et se retrouvent donc dans notre alimentation. Certains scientifiques pensent aujourd hui que le fait de boire cette eau contaminée peut mener à des problèmes de fertilité et de cancers. Description des molécules L éthinylestradiol est l œstrogène actif par voie orale le plus utilisé dans le monde. On le retrouve dans toutes sortes de pilules contraceptives. Il a été découvert par ans erloff Inhoffen et Walter ohlweg en 1938. L éthinylestradiol (EE2) est un composé polycyclique qui fait partie des œstrogènes stéroïdiens ainsi que l estrone(e1), l estradiol (E2) et l estriol (E3) voir annexe1. L ethinylestradiol est un dérivé de synthèse de l estradiol. L estradiol est lui-même un dérivé du métabolisme du cholestérol (via la testostérone). Malgré que l EE2 soit le plus utilisé en tant que contraceptif oral et par conséquent le plus étudié, ce n est pas le seul perturbateur endocrinien que nous retrouvons dans nos rivières. En effet, les pesticides et autres polluants chimiques ont aussi un rôle accru dans la mutation de notre faune. L Union Européenne considère qu il y a 553 substances chimiques et 9 stéroïdes naturels et synthétiques qui sont susceptibles de provoquer des perturbations du système hormonal de l homme et des animaux. Cette étude n abordera pas cette partie de sujet pour se contenter exclusivement des hormones et en particulier l EE2. 2
Les effets recherchés Le mode d'action des pilules va dépendre des hormones qu'elles contiennent. La pilule contraceptive classique a un mode d'action qui se déroule sur 3 niveaux : 1. Blocage de l'ovulation par la diminution de la sécrétion des hormones venues de l hypophyse (la FS, hormones folliculo-stimulante, et la L, hormones lutéinisante). Il n y a donc pas de maturité du follicule au niveau de l ovaire qui a pour effet d inhiber l ovulation. 2. Diminution de la sécrétion de la glaire du col de l'utérus (glaire cervicale) ce qui rend le franchissement du col impossible pour les spermatozoïdes. 3. Inhibition du développement de la muqueuse utérine (endomètre) ce qui la rend trop mince pour pouvoir recevoir un ovule fécondé. En revanche pour la pilule micro ou macro dosée, leur mode d'action consiste essentiellement à modifier la glaire du col de l'utérus. Les effets dans la nature a) Sur les truites arc-en-ciel [9] L estradiol endogène induit la production de vitellogène dans le foie des poissons. Cette protéine précurseur des vitellines atteint les ovocytes des ovaires par la circulation sanguine et seules les poissons femelles en possèdent. Depuis les années 90, on s aperçoit que l on en retrouve aussi chez les poissons mâles. Ceci a pour effet de provoquer chez eux des gonades mixtes (des testicules contenant aussi des ovules). C est ce qu on appelle le phénomène de féminisation ou intersexe. Dans la première image ci-dessous, nous voyons une coupe de testicules de poisson dans laquelle on retrouve des ovocytes. La deuxième image correspond à une coupe de testicules (entouré en rouge) sur laquelle s est greffé un ovaire. Ce poisson est donc devenu hermaphrodite. Figure 1: Testicules de poissons en coupe comportant des ovocytes. [9] 3
Figure 2: Coupe de la fusion des deux sexes [9] Test réalisé en suisse [9] : Des chercheurs ont étudié 3 échantillons de poissons : un échantillon a été mis dans l eau après une station d épuration, un autre au laboratoire et le dernier dans une rivière (le Ron). Ces test ont montré que le taux de vitellogènine diminuait de manière générale mais pas lorsque ces poissons se trouvaient à la sortie de la station d épuration. Ce qui prouve qu il y a des substances présentent dans les sorties d eaux d épuration qui ont des effets endocriniens. b) Effets de EE2 sur les poissons zèbres [2] Une étude a mesuré l impact sur les embryons de poissons zèbres à une exposition de EE2 durant 3 mois après fertilisation. L étude s est focalisée sur la taille, le poids, la composition en calcium et phosphore et sur l augmentation des anomalies morphologiques. Les concentrations administrées au poisson allaient de 0 à 25ng/L. Au-delà de cette concentration, on remarque que les poissons souffrent plus d œdème péricardique et de malformations épinières. Pour les poissons qui ont subi une exposition de 10 à 25ng/L pendant 3 mois, on remarque une diminution significative de la taille par rapport au groupe test. Mais on ne retrouve aucune différence significative dans les autres groupes au premier et deuxième mois et pour les concentrations plus faible en EE2. Le poids des poissons est en corrélation directe avec la taille, on peut donc faire la même conclusion en ce qui concerne le poids des poissons. Dans le graphique ci-joint, on peut remarquer l évolution de la taille et du poids durant les trois mois d expositions et ce pour les différentes concentrations. Lorsque le poisson subit un stress par un composé toxique, il aura tendance à moins produire de Ca et de P. L étude montre que la concentration en phosphore et en calcium est Figure 3 Evolution du poids et de la taille en fonction de la concentration en EE2 et en focntion du temps 4
significativement plus basse pour les poissons exposés à une concentration de 25ng/L de EE2 par rapport au groupe témoin. En ce qui concerne les autres groupes de concentrations plus basses que 25ng/L en EE2, les concentrations en P et Ca ne sont pas significativement différente du groupe témoin. On peut donc penser que la concentration en EE2 de 25ng/L est perçue par l organisme du poisson comme toxique. L étude s est ensuite penchée sur le pourcentage de malformations au sein des différents groupes. Les groupes de concentration de 0 ; 0,1 ; 1 ; et 10 ng/l en EE2, ne souffrent pas de malformations alors que pour le groupe à 25ng/L, on remarque que 17% des poissons souffrent d œdème péricardique et 51% souffrent de malformations au niveau de la colonne vertébrale. Par ailleurs, l étude s est intéressée au taux de vitellogénine (VTG). La VTG est une lipoglycophosphoprotèine majoritaire de l œuf qui serait une source de nutriments pour l embryon. Chez les vertébrés, elle est synthétisée dans le foie de la femelle sous l effet de l oestradiol. Pour le groupe test et celui à 0,1 ng/l, on ne remarque pas d augmentation de la VTG ce qui contraste totalement avec le taux relevé pour les autres groupes. Tous les poissons passent au début de leur vie par une phase hermaphrodite qui dure environ 42 jours. Pendant ce temps les poissons possèdent les deux organes sexuels en même temps. On a remarqué dans cette étude que l exposition au EE2, durant 3 mois après la naissance, inhibe la différentiation sexuelle et, à ce moment de leur vie, leur gonades n est pas différentiable. Après 5 mois dans une eau non polluée, on ne retrouve pas de différence dans la proportion mâle/femelles. Par contre, nous remarquons une diminution de frai et du nombre d œufs. c) Sur les rats [4] Les rats mâles ont été exposés à l EE2 dans leur eau d alimentation avec une concentration allant de 1-1000ng/L (1ppm à 1ppb) durant 3 semaines après leur période de sevrage (22 jours après la naissance). Les doses administrées sont de 0, 1, 10, 100 et 1000 ng/ml. A la fin de cette expérience, on ne garde que le premier et dernier groupe pour mesurer les tailles et poids jusqu au jour 97 après la naissance. Pour finir, on teste la fertilité. Les résultats du test montrent immédiatement une diminution de la consommation d eau potable pour les deux groupes exposés à de plus grande concentration en EE2. Pour ces deux groupes il y a une diminution de 21 et 42 % respectivement pour les concentrations de 100 et 1000 ng/ml d EE2. En ce qui concerne la masse, le groupe de 1000 ng/ml ne possède que 62% du poids du groupe de contrôle. Après avoir subi les 3 semaines de test sous EE2 jusqu au jour 100 après la naissance, on remarque toujours que ce groupe possède une masse inférieure de 27% au groupe de contrôle. Lors du test de fertilité, on ne décèle pas de trouble de la fertilité chez les rats exposés. Par contre, les portées peu nombreuses ont augmenté lors d une exposition à long terme. Nous ne pouvons pas faire les mêmes conclusions pour l homme car nous assimilons plus que les rats. De plus, cette étude ne se penche que sur l activité de l EE2 et pas sur l ensemble des perturbateurs endocriniens que nous ingérons. 5
Méthodes analytiques [3] Des méthodes analytiques classiques existent mais aussi des méthodes biologiques pour déterminer quel est l effet réel des substances. Nous allons voir d un peu plus près quelques-unes d entre-elles. L PLC/MS ou la PLC MS/MS sont deux méthodes qui nous permettent de connaître la composition en œstrogènes stéroïdiens. On peut également utiliser la chromatographie liquide (MS/MS) ainsi que l ionisation par électrospray (ESI) suivi par une LC/MS/MS. L avantage de l utilisation de la LC/MS/MS est sa capacité à analyser les œstrogènes sans dérivation et sans le besoin d hydrolyser les formes conjuguées qui sont des étapes limitantes dans la détermination de chaque espèce. L extraction des hormones stéroïdiennes à partir d eau usée se fait la plupart du temps par une extraction en phase solide (SPE). L échantillonnage se fait en off-line pour éviter certains effets de matrice qui ne sont pas supprimables en mode on-line. Cet effet de matrice cause la suppression de l ionisation de l interface dans la chromatographie liquide et dans l ionisation par l électrospray, bien que l élution sélective puisse être appliquée pour diminuer un tel effet de matrice. De toute manière, l analyse on-line n est pas permise lors de combinaisons de multiples étapes de nettoyage. Le standard interne pour l analyse quantitative est un dérivé deutéré des 4 hormones stéroïdiennes. La limite de détection doit se trouver sous le ppb car nous voyons qu il y a un effet des hormones à partir d une concentration de l ordre de quelques ppb. L analyse débute par une filtration sur papier pour permettre de faire directement une extraction en phase solide (SPE). La cartouche de SPE est composée de chaines en C18 sur lesquelles se fixent les molécules. Elles sont ensuite éluées par du méthanol suivi du dichlorométhane. La solution passe au rotavap de manière à la concentrer pour atteindre un volume de 1 ml et est ensuite totalement évaporée sous vapeur sèche à l aide d un courant d azote. La vapeur est reconcentrée par un mélange de dichlorométhane et de méthanol et est passée sur une colonne d exclusion stérique. L éluant se compose d un mélange de dichlorométhane/méthanol. Les fractions obtenues sont séchées par rotavap. On continue par une deuxième séparation sur une colonne échangeuse d ions qui permettra de séparer E3 et E1 de E1, E2 et EE2. Les deux fractions seront ensuite injectées dans des vials pour être analysée en LC/MS/MS. Le schéma de l analyse se trouve ci-dessous. 6
Figure 4: schéma de l'analyse chromatographique Les chercheurs ont obtenu le chromatogramme suivant : Figure 5: Chromatogramme des différentes hormones 7
En parallèle, des tests biologiques permettent de mesurer l activité hormonale de l échantillon étudié, utilisent un système de cellules de levures auxquelles ont été intégrés un récepteur à œstrogènes humains ainsi qu un gène rapporteur. Si l échantillon d eau contient des hormones environnementales, celles-ci se fixent au récepteur, activent le gène rapporteur et peuvent ensuite être mises en évidence par une réaction biochimique colorée. L intensité de la coloration traduit l activité estrogène de l échantillon qui est exprimée en équivalent estradiol []. Méthodes d épuration Afin d éviter une propagation de ce polluant, il faudrait que celui-ci soit retenu par les stations d épuration des eaux usées. Malheureusement, le traitement actuel des eaux ne permet pas une élimination ou une dégradation correcte des molécules d œstrogène. Plusieurs études ont tenté de déterminer les méthodes possibles. Nous verrons dans ce chapitre quelques exemples de méthode de dégradation. a) Traitement à l ozone [8] Comme nous le savons depuis longtemps, l ozone est un oxydant puissant. Il est utilisé très fréquemment et a pour effet la décoloration, l élimination du goût, la dégradation de composés organiques et la désinfection. Le produit de l ozonation peut à terme être transformé en CO 2 et 2 O dans des conditions spéciales tout en restant inoffensif pour l environnement en éliminant aisément l excès d ozone et d oxygène. Plusieurs solutions d EE2 ont subi un bullage d ozone et ont été mélangées à l aide d un barreau magnétique. Deux expériences ont été menées, l une faisant varier la concentration en EE2 et l autre en faisant varier la concentration en ozone. Dans le tableau ci-joint, nous voyons les effets de la concentration en EE2 avec une concentration en ozone constante. Nous nous apercevons que plus la concentration initiale en EE2 est grande, moins la dégradation est efficace. Au bout de 5 min, l efficacité est seulement de 12.0% pour une concentration de 67.6µmolL -1 d ozone. Figure 6 : Evolution de la concentration EE2 on fonction du temps suivant différentes concentrations initiales en EE2 La deuxième expérience faisant varier la concentration en ozone montre que celle-ci est importante, plus la dégradation est efficace. L article évoque un rendement de 84.6% pour une concentration en ozone de 11.6µmol min -1 au bout de 10 minutes. L expérience dans sa totalité a été renouvelée sur une gamme de p allant de 4.0 à 8.0. L ozone peut oxyder suivant deux différents chemins réactionnels : soit en oxydant directement les Figure 7: Evolution de la concentration en EE2 en fonction du p de la solution molécules organiques dans la solution aqueuse, soit en formant des oxydants secondaires (principalement des radicaux hydroxyles) qui agissent ensuite sur les molécules. Le radical O est 8
plus puissant mais moins sélectif que l ozone. La valeur du p aura donc un impact sur le processus réactionnel et sur la formation de radicaux hydroxyles qui est favorisée à p élevé. Le graphique, en bas de la page précédente, montre bien la meilleure activité de l ozone lorsqu on augmente le p. Le chemin réactionnel proposé dans l article est le suivant : b) Traitement chimique [6] Figure 8 : Voie de dégradation de l'ee2 L étude, décrivant ce genre de procédé, compare un réacteur composé de charbons actifs à un autre réacteur composé lui de MnO 2. L oxyde de manganèse est un substrat oxydant en phase solide et a une surface oxydante réagissant avec les molécules organique xenobiotique. Il est d ailleurs utilisé pour la dégradation de substances telles que les substances humiques, l atrazine, les hydroxylamines, l ascorbate ou les différents types de catechols. L EE2 sera oxydé par le MnO 2. Cette oxydation produit des dérivés organiques venant de l EE2 et du Mn 2+. Le Mn(II) Figure 9: Schéma de dégradation chimique 9
précipite autour des cellules où il est accumulé en couches minces ou grains. Il est alors biodisponible pour les organismes de type bacille. Les produits de dégradation de l EE2 sont ainsi assimilés par les micro-organismes. De plus le manganèse a des propriétés d adsorption des métaux. Le schéma de la dégradation de l ethynilestradiol est montré sur la figure n 9. Cette étude conclut que le charbon actif a une excellent adsorption mais que celui-ci fini par saturer. Il faudrait donc le remplacer souvent ce qui ne serait pas rentable. Le MnO 2 permet quant à lui une élimination de 81,7% de l activité d œstrogènes et possède un cycle d auto-régénération et donc détruit l EE2. c) Traitements biologiques [7] On peut envisager deux méthodes de purification biologique. La première via des boues activées qui sont fixées sur des membranes d un bioréacteur et la deuxième via un traitement abiotique, c est-àdire via un écosystème clos. Pour le premier traitement via des boues activées, les études montrent qu au bout de 10 minutes, il y a une diminution de la concentration en EE2 de 80%. Cette diminution est uniquement due à l adsorption sur les boues. Une diminution constante de la concentration en EE2 a été observée. Pour une bonne activitée des boues, il faut que celles-ci soient acclimatées par une ou deux périodes de stress. L enzyme responsable de la catalyse de la réaction est de type AMO (ammonia monooxygenase). Elle est aussi capable de co-oxyder beaucoup d autres molécules organiques. Malheureusement, ce genre de traitement a de faible rendement. Mise à part l adsorption par les boues, le taux de dégradation n est que de 7%. Le deuxième traitement se fait via un traitement abiotique qui éliminerait en partie les 4 hormones de l eau. Le substrat utilisé est la nourriture de lapin qui est similaire à certaines compositions de sols. Dans ce cas, nous trouvons égalementi une grande partie d adsorption des hormones sur le substrat et l élimination beaucoup plus faible que lorsque les boues sont acclimatées. Le mécanisme de dégradation n est pas connu pour le moment. Ce type de traitement est encore au stade d étude [5]. Conclusion La non-métabolisation dans l organisme des molécules d hormones, prisent par les femmes en tant que contraceptifs, provoque dans nos rivières une pollution sans précédent. Grâce aux nouvelles techniques d analyses sophistiquées, nous arrivons dorénavant à doser d infimes concentrations de ces molécules dans les eaux de rejet. Il faut les détecter au niveau du ppb car les perturbateurs endocriniens ont cette caractéristique qu il ne faut pas de grande quantité pour qu ils aient un impact. Les poissons sont pour le moment les victimes de notre pollution mais les scientifiques d aujourd hui ne garantissent pas qu une contamination soit impossible via notre réseau de distribution d eau potable ou via notre alimentation. On ne peut corréler à l heure actuelle la diminution de la qualité des spermatozoïdes et l augmentation des cancers des testicules chez l homme avec la présence d hormones environnementales. 10
Pour le moment, les centres d épurations des eaux usées utilisent des traitements biologiques et chimiques mais ceux-ci atteignent rapidement leur limite d efficacité. Des solutions sont à l étude mais il faut être conscient du fait que les centres d épurations des eaux ne sont pas encore prêts à retenir cette pollution. La pilule n est pas l unique source d hormones [11]. Nous en consommons aussi lorsque nous faisons une thérapie de substitution hormonale, lors de traitement contre le cancer. Les animaux en consomment aussi par leur médicament vétérinaire et on en retrouve aussi près de plantation de soja et des usines de biodiesel. De plus, nous savons que les hormones présentent dans la pilule ne sont pas les seuls perturbateurs endocriniens dans nos rivières [10]. 11
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Annexe 1 : Fiche des hormones : Estradiol (E2) : Nom IUPAC : (8R,9S,13S,14S,17S)-13-methyl-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-decahydro-6cyclopenta[a]phenanthrene-3,17-diol N CAS : 50-28-2 Masse moléculaire : 272.38 O O Ethinylestradiol (EE2) : Nom IUPAC : (8R,9S,13S,14S,17S)-17-ethynyl-13-methyl-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-decahydro-6cyclopenta[a]phenanthrene-3,17-diol N CAS: 57-63-6 Masse moléculaire: 296.4 O O 13
Estrone (E1) : Nom IUPAC : (8R,9S,13S,14S)-3-hydroxy-13-methyl-7,8,9,11,12,13,15,16-octahydro-6cyclopenta[a]phenanthren-17(14)-one N CAS: 53-17-7 Masse moléculaire: 270.37 O O Estriol (E3) : Nom IUPAC (8R,9S,13S,14S,16R,17R)-13-methyl-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-decahydro-6cyclopenta[a]phenanthrene-3,16,17-triol N CAS: 50-27-1 Masse moléculaire: 288.38 O O O 14
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