TRAVAUX PRATIQUES DE MASTER BIOINFORMATIQUE BIOLOGIE STRUCTURALE & GENOMIQUE 1ere année 8-26 octobre 2007 1 : Production d'une protéine recombinante dans E. Coli (p.2) (Assou el Batarri) Lundi 8 octobre (heure à préciser) 2 : Physicochimie et Analyse structurale d'une protéase à serine. (p. 5) (Jean-Pierre Duneau) A partir du jeudi 11 octobre à 14H00 3 : Cristallogenèse (6h) (p. 14) Date suivant les trinômes précisée lors du TP 4 : RMN (4h) (Corinne Kreuzer) Spectromètre RMN de l'ibsm Date suivant les trinômes précisée lors du TP Vous trouverez sur la page : http://biologie.univ-mrs.fr/see-plan.php?personid=70&crsid=50 Un plan de travail optimisé pour chaque trinôme, incluant les passages devant le spectrofluorimètre, le TP de cristallogénèse et le planning RMN dès qu'il sera disponible.
TP n 1 Production de protéines recombinantes dans E. Coli (A. El-Battari) Les vecteurs d'expression procaryotes pgex sont porteurs du gène qui code pour le fragment C-terminal de la Glutathion-S-Transférase (GST) du Shistosoma japonicum.de ce fait, ils permettent l'expression d'une protéine donnée P sous la forme d'une protéine de fusion GST-P. Ces vecteurs portent en outre le represseur Lac q et le gène de résistance à l'ampicilline Amp r. Le Gène de la GST est sous le contrôle du promoteur trp-lac (tac), inductible par l'isopropyl-ß-dthiogalactopyranoside (IPTG). L'ADNc codant pour une protéine donnée P, peut être inséré dans le site de multiclonage (MCS) en aval et en phase avec le gène de la GST. La synthèse de la protéine de fusion GST-P est induite par l'iptg, après transformation de E. Coli et sélection de bactéries sur milieux sélectifs. La protéine de fusion ainsi synthétisée peut ensuite être purifiée par chromatographie d'affinité sur une colonne de glutathion-sépharose. La protéine P peut également être clivée de la GST par la thrombine ou par le facteur X grâce à des sites de coupure qui ont été introduits entre la GST et la protéine P. Dans le cadre de ce TP la protéine P sera soit la protéine autofluorescente verte «Enhanced Green Fluorescent Protein» (EGFP) ou la protéine rouge «Discosoma Red Fluorescent Protein» (DsRed2) dont les gènes ont été isolés respectivement à partir de la méduse Aequorea victoria ou du corail Discosoma sp. Vous disposerez des bactéries porteuses de plasmide pgex-egfp ou pgex-dsred pour induire l expression des protéines de fusion GST-EGFP et/ou GST-DsRed, respectivement. L expression de ces deux protéines pourra être suivie par microscopie à fluorescence tout au long de la période d induction. Lorsque le niveau d expression est jugé satisfaisant, les bactéries seront lysées et les protéines purifiées par chromatographie d affinité sur gel de Gluthationséphrose. La purification sera suivie par spectrofluorimétrie et électrophorèse en gel SDS avant d aborder leurs propriétés physicochimiques, notamment spectrométriques.
Jour J1: Culture bactérienne et induction La culture bactérienne d une nuit est diluée 1:10 avec du LB frais puis incubée à 37 C, sous agitation, jusqu à atteindre un densité optique DO 600 d environ 0,5. L'expression de la protéine de fusion est alors induite par l'addition de l'isopropylthio-β-d-galactopyranoside (IPTG) à la concentration finale de 1mM et l incubation sous agitation est poursuivie pendant 5 h à 30 C. Prévoir un control non induit.tout au long de cette période, l apparition de la fluorescence peut être appréciée en examinant les bactéries sous microscope à fluorescence. A PREPARER PENDANT LA DUREE DE L INCUBATION: -Tampon de lyse= Tris-HCl 50 mm ph 8, DTT 5 mm et 5 mm EDTA et les inhibiteurs de protéases 1x (solution fournie 1000x). - Centrifugeuse Beckmann (réfrigérée) et tubes de centrifugation A la fin de l incubation, les cellules induites et contrôles sont sédimentées par centrifugation à 5000 t/mn pendant 10 minutes à 4 C, resuspendues dans le tampon de lyse et soumises à trois impulsions de sonication de 10 sec chacune, espacées de 30 sec, dans la glace. Après centrifugation à 15000g pendant 15 min à 4 C, les surnageants sont récupérés et leur fluorescence mesurée par spectrofluorimétrie à 473 nm (EGFP) ou 558 nm (DsRed). Les culots corps d inclusion) sont resuspendus dans le même volume de tampon de lyse et mesurés par spectrofluorimétrie. Solubilisation des corps d inclusion Les corps d inclusion sont lavés 2 fois par centrifugation puis resuspendus dans le tampon de lyse (ne contenant pas de Triton X100) additionné de laurylsarcosine 1,5% (C ion finale) et incubés sous agitation pendant 15 min à T ambiante. Afin de renaturer la protéine de fusion extraite des corps d inclusion, on ajoute le détergeant 3-[3-cholamidopropyl-dimethylammonio]-1- propane sulfonate (CHAPS, fourni) à la C ion finale de 4%. Le mélange est incubé 15 min sous agitation avant d être mélangé 1:4 (v/v) au gel Glutathionsépharose, préalablement équilibré dans le tampon de lyse contenant 1% CHAPS (tampon chromato). Les tubes contenant les mélanges sont incubés sous rotation pendant la nuit en chambre froide. Remarque (optionnel): Une partie de l extrait lauryl-sarcosine peut être dialysée toute la nuit en chambre froide contre le tampon Tris-HCl 50 mm ph 8, 5 mm EDTA, contenant 1,5% CHAPS. La fixation sur glutathion-sépharose sera testée durant J2 Jour J2 Les billes de gel sont sédimentées par centrifugation à 1000 t/min et les surnageants épargnés dans la glace. Après 5 lavages avec le tampon chromato, la protéine de fusion est éluée par une solution de 15 mm de glutathion réduit dans le tampon chromato et incubées pendant 30 min sous rotation en chambre froide.séparer les billes de l éluat par centrifugation à 1000t/min. Sauvegarder l éluat. Extraire 5 fois par lavage et centrifugation avec le tampon d élution et mesurer la fluorescence au fur et à mesure de
l élution. Répéter l opération jusqu à disparition de la fluorescence. Remarque: Avant l étape de l élution, il est possible d observer au microscope les billes «enrobées» de fluorescence. Il est possible également de suivre l élution de la protéine fluorescente au microscope. Jour J3 Analyse des protéines par gel SDS-PAGE Suivre les instructions du tableau ci-dessous pour réaliser un gel de polyacrylamide à 10%. Remarque : Il est possible de visualiser la GST-EGFP (50 kda environ, GST= 25 kda et EGFP= 28 kda) directement sur le gel SDS-PAGE à condition de ne pas «dénaturer» la protéine auparavant. Colorer les protéines au bleu de Coomassie et décolorer le gel pour visualiser les bandes protéiques. Annexe
TP n 2 : Physicochimie et Analyse structurale d'une protéase à serine. PREMIERE PARTIE : Etude de l'accessibilité du chromophore de l'eegfp et de son Trp par quenching. (cf Article I) Préparation : Acrylamide 30% (4,22 M) egfp purifiée 10 ml Tampon Tris-HCl 500 mm, ph 7,5, NaCl 1,5 M (Tampon x 10) Préparation de 1 solutions de egfp DO473=0,1 max / 50 mm Tris-HCl ph 7,5 qsp 6 ml Manipulation : Quenching par l'acrylamide : Spectres d'émission de fluorescence sur l'egfp : Excitation vers 365 nm et émission entre 400 et 600 nm Spectre d'émission de fluorescence sur le tryptophane de la protéine de fusion GST-GFP (2 ML dans une cuve de 3 ml) Excitation à 280-290 nm et émission entre 300 et 400 nm Spectres d'émission egfp et Trp (2 ML dans une cuve de 3 ml) Ajout de quantités croissantes d'acrylamide pour passer à 0; 0,5 ; 1; 1,5 et 2M Spectres d'émission egfp et Trp à chaque fois Analyses. Dans un tableur : Importer l'ensemble de vos spectres bruts Soustraire éventuellement la contribution des tampons Normaliser les spectres pour tenir compte des dilutions Représenter les courbes I /I=f[Q] (Q= quencher) Interprétez les résultats (Article I)
SECONDE PARTIE : Fixation covalente d'un marqueur fluorescent sur le centre actif de la chymotrypsine (cf Article II donné lors du TP) Préparation Pour le marquage: 10 ml de paranitrophényl-anthranilate (NPA), 4,8mM dans l'acétonitrile 200 ml de tampon phosphate 0,1M, ph 6,8 2 ml de ChTi à 5 mg/ml dans du tampon phosphate 0,1M, ph 6,8 500 ml de tampon phosphate 0,1M, ph 5,5 Pour le test d'activité : 100 ml de tampon Tris-HCl 50 mm, ph 7,5, NaCl 0,1 M 10 ml de BtpNA, 2 mm dans le DMSO Manipulation Ajouter, en 4 aliquotes espacés de 1H30, 0,1 ml total de solution de NPA aux 2 ml de solution de CHTi. Suivre parallèlement la perte d'activité (voir test suivant) Dialyser une nuit contre le tampon phosphate 0,1M, ph 5,5 Composition du test d'activité Chymotrypsine (dans une cuve jetable de spectrophotomètre): 1,8 ml de tampon Tris-HCl 50 mm, ph 7,5, NaCl 0,1 M 200 µl de solution de BtpNA 10 µl de mélange d'activation
TRIOSIEME PARTIE : Calcul d'une distance caractéristique par FRET et comparaison avec la structure cristallographique. (cf Article II) Manipulation : On donne : centrifuger (2 tubes ependhorf) le contenu du boudin de dialyse Mesurer à 242 nm la quantité de ChTi-Anthranoyl formée Calculer le rapport marqueur/protéine obtenu Par dilution, dans les cuves quartz du spectrofuorimetre (2 ou 3 ml) préparer les solutions suivante ChTi / tampon phosphate 0,1M, ph 6,8 DO280 estimé = 0,05 ChTi-Ant / tampon phosphate 0,1M, ph 6,8 DO280 estimé = 0,05 Effectuer un spectre d'emission de fluorescence (excitation à 290 nm) sur la protéine native et sur la protéine modifiée. Pour la ChTi ε M 280 = 5x10 4 M - 1 cm -1 Pour la ChTi-Ant ε M 342 = 4x10 3 M -1 cm -1 Graphes-Analyses : Travail personnel : récupérer sur la Protéine DataBase (PDB) les coordonnées de la chymotrypsine. Choisissez le jeu de coordonnée qui vous semble le plus opportun. A l'aide du logiciel Rasmol, (cf Annexes), réaliser une représentation de la ChTi qui mets en évidence le centre actif et les tryptophanes. A l'aide du même logiciel estimer les distances entre les tryptophanes et l'inhibiteur Anthranylate. Donnez la distance moyenne.
QUATRIEME PARTIE : Tamisage moléculaire : Estimation du volume hydrodynamique de la Chymotrypsine Préparation : Colonnes diamètre 1,5 cm x 50 cm Phase sephadex G100 Dextran bleu 2 mg/ml Carmin ou eosine 1L de tampon phosphate 0,1M, ph 6,8 ou 7,9 dégazé par ultrason Manipulation : Préparation du gel La poudre de sephadex G100 gonfle au contact du tampon d'hydratation 15 à 20 ml de gel gonflé sont formés à partir de 1 g de poudre Peser la quantité gel permettant de remplir les 2 colonnes fournie (30 et 15 cm de hauteur de gel) Dans un becher de 500 ml ajouter la poudre et 250 à 300 ml de Tampon phosphate Chauffer à 90 C pendant 5H en agitant toutes les 15 min (ne pas utiliser de barreau aimanté, ne pas brûler le gel, ajoutez de l'eau distillée si nécessaire) Laisser refroidir et sédimenter le gel dans le becher supprimer un partie de l'excès de surnageant de manière à ce que le volume du gel sédimenté représente les 2/3 du volume total. Agiter et aliquoter ce gel dans 2 tube Falcons de 50 ml, bouchés laissé sédimenter verticalement Montage de la colonne de 50 cm (30 cm de gel) Installer tuyaux et robinetterie sur la sortie de colonne Évaluer le volume de solution de gel nécessaire pour remplir la colonne (prévoir le volume supplémentaire lié à la sédimentation du gel) Penchez la colonne à 60-45 deg remplir en prenant garde de ne pas emprisonner de bulle d'air Laisser sédimenter pendant 60 minutes Établir un flux gravimétrique et estimer son débit (Flux max 6,4 ml/min ou 77 ml.cm2.h, pression max 160 cm de colonne d'eau) Tampon phosphate 0,1M, ph 6,8 ou 7,9 Équilibrer avec 1 volume de colonne. Flux à 1 ml/min ou gravimétrique dépot de 100µL de dextran bleu + rouge carmin sur le sommet du gel puis dépot de 1 ml de ChTi-Ant. (dés l'absorption du bleu) Elution tampon Phosphate Fractionnement : 1 ml mesure du volume mort (sortie du Dextran Bleu) Volume d'élution de la chymotrypsine Volume d'exclusion (sortie du colorant rouge)
Mesure de DO 280 et 342 nm Graphes et Analyses : Données : DO280 et 342 = f(vélution) Log (MM ou Vh) = f (Kav) Comparaison du Kav expérimental, avec les Kav des marqueurs de masse (Cf annexes). Comparaison avec la MM théorique conclusion quand au volume hydrodynamique, la forme de la protéine. Valeur du temps de corrélation rotationnel (cf page suivante) τc= 1/6Drot Pour une sphère : τc= V h η/kt (equation de Stoke Enstein) avec Vh : volume hydraté d'une protéine (MM/6,02x10 23 car le volume spécifique d'une protéine hydratée est de environ 1 cm 3 /g) k : 1,38 erg/deg η pour l'eau à 20 C : 0,01 poise T temperature absolue (Kelvin)
CINQUIEME PARTIE : évaluation du temps de corrélation rotationnel par la mesure de polarisation de fluorescence. (cf Article V) Manipulation : 1-Mesure de l'anisotropie de la ChTi Préparer un échantillon de ChTi-Ant à 3,75 x 10-5 M dans du tampon phosphate ph 6,8 En exitant à 360 nm et en suivant l'émission à 420 nm mesurer le facteur de correction g(λ)=f HV /F HH (compensation de la différence d'absorption des filtres en mode V et H) Réaliser les mesure F VV et F VH, noter la température, calculer l'anisotropie de la ChTI-Ant 2- Evaluation de l'anisotropie limite A 0 Préparer des solutions de ChTi-Ant à 3,75 x 10-5 M dans 80, 85, 90 et 95 % de Glycerol Préparer les solutions similaire contenant le tampon de dialyse dilué dans les même conditions Pour chaque échantillon mesurer F VV et F Vh, noter la température. En refroidissant l'échantillon et la cuve dans la glace essayez de réaliser une mesure à 0 C sur l'échantillon le plus concentré en Glycérol (prendre garde à la condensation). Graphes-Analyses : Données : Anisotropie 1/A = f(t/η) avec A l'anisotropie, T la température absolue et η la viscosité (cf annexe). Évaluer l'anisotropie limite (extrapolation de la droite à 0) Discutez vos résultats en regard de ceux publier dans les articles 1 et 2 A(λ) Temps de corrélation rotationnel τc= τ F A/(A 0 -A) Pour la valeur de τ F voir article n 3
Exemple d'optimisation des temps de chaque manipulation. (celle ci- ne prend pas en compte les contraintes spécifiques à l'utilisation du spectrofluorimétre et à l'organisation de l'emploi du temps) Cf : http://biologie.univ-mrs.fr/see-plan.php?personid=70&crsid=50 J1: Préparation des solutions (4 H) J2 : Partie 1 : mesure du quenching de fluorescence sur la GFP (2H) Partie 2 : réalisation du marquage (6H) Partie 4 : préparation du gel et montage de la colonnes, équilibre (5 H +2H) Partie 2 : dialyse (1 nuit) J3 : Partie 4 : tamisage moléculaire (à 4h00) Partie 3 : détermination du taux de marquage (1h30) Partie 3 : préparation des échantillons pour fluorescence FRET (1h00) Partie 3 : mesure des spectres de fluorescence FRET (2h00) J4 : Partie 5 : Préparation des échantillons pour la fluorescence (Anisotropie) (1H) Partie 5 : Mesure d'anisotropie (2 H) Analyse des données y compris partie 3 travail personnel Analyse des données, réalisation des graphes
ANNEXES
Les Articles : I - Comparative studies on the structure and stability of fluorescent proteins EGFP, zfp506, mrfp1, "dimer2", and DsRed1. Biochemistry 2004; 43, 14913-14923 II A fluorescent Probe at the active site of a-chymotripsin Haugland, RP & Stryer, L. (1967) in Conformation of Biopolymers, ed. Ramachandran, GM (Academic, New York), Vol. 1, pp. 321-333. III- Comparison of the dynamic structure of -chymotrypsin in aqueous α solution and in reversed micelles by fluorescent active-site probing European Journal of Biochemistry 1993; 211 : 47-55
TP n 3 : cristallogenèse. Le but du TP est de donner une formation sur les méthodes d obtention de cristaux de macromolécules dans le but de résoudre leurs structures par radio-cristallographie. Le TP de 6H est partagé en deux parties (4H et 2H.). Première partie (4H). -Rappel sur les principes de cristallogenèse. -Analyse de la pureté de l échantillon (gel SDS) -préparation de la stratégie de cristallographie (banque de donnée, bibliographie, screen, games ) -Préparation des tampons et des solutions. -Préparation des boites de cristallisation Deuxième partie (2H) -Analyse des résultats -test des solutions cryogéniques -Montages des cristaux -Diffraction - Démonstration et analyse d une structure cristallographique