Dosage de l ochratoxine A dans le vin par un clean up avec colonne d immunoaffinité et HPLC Di Pascoli Thomas M2 VRV 2011/2012 La vigne, plante d intérêt économique
Plan I. L Ochratoxine A (OTA) II. Méthodologie III. Résultats Méthode Avantages Vins IV. Conclusions et perspecnves V. Références
I. L Ochratoxine A (OTA) C 20 H 18 ClNO 6 MW = 403,82 g/mol CAS = 303-47- 9 Mycotoxine produite par Aspergillus ochraceus (1965) et Penicillium verrucosum dans diverses condinons Présente dans les céréales, fruits, café, lait, bière, etc Néphrotoxique, hépatotoxique, tératogénique et immunotoxique InternaNonal Agency for Research on Cancer (IARC) l a classée dans les substances potennellement cancérigène (2B) Demi- vie de 35j dans le sérum Les vins rouges sont souvent les plus contaminés La zone méditerranéenne qui est la plus contaminée 15% de toxine ingéré provient du vin 2μg/kg dans les vins (RèglementaNon (CE) No 123/2005 de la communicanon du 26 janvier 2005)
II. Méthodologie 10mL H2O + 1% PEG 8000 + 5% NaHCO 3 10mL de vin FiltraNon Extrait dilué Clean- up sur colonne d immunoaffinité OchraTest Lavage avec 5mL de NaCl 2,5% + NaHCO3 0,5% ÉluNon 2mL EtOH
II. Méthodologie ÉvaporaNon à 50 C sous Azote Reprise du culot dans 250μL de PM 100μL injecté en HPLC PM = 49% ACN + 49% H20 + 2 Ac. AcéNque D = 1mL/min 56 échannllons analysés: 38 rouges 9 blancs 8 rosés 1 «dessert» Mesure de l aire des pics Temps de rétennon Courbe d étalonnage réalisé avec un étalon d OTA
III. Résultats Méthode: à L ajout de PEG pour la dilunon permet de ne pas perdre l OTA lors du lavage de la première colonne à La masse des PEG n influe pas à Le ph doit être entre 5,5 et 8,5 pour un bon rendement à Limite de détecnon = 0,01ng/mL (S/B = 3:1) à La première colonne peut retenir au max 160ng d OTA Avantages: à Possibilité d évaluer 48 vins/jour/personne à Répétabilité de la méthode notamment avec les vins rouges à UNlisaNon de peu de solvants toxiques à Rendement d extracnons très forts par rapport à d autres méthodes décrites
III. Résultats Méthode: à L ajout de PEG pour la dilunon permet de ne pas perdre l OTA lors du lavage de la première colonne à La masse des PEG n influe pas à Le ph doit être entre 5,5 et 8,5 pour un bon rendement à Limite de détecnon = 0,01ng/mL (S/B = 3:1) à La première colonne peut retenir au max 160ng d OTA Avantages: à Possibilité d évaluer 48 vins/jour/personne à Répétabilité de la méthode notamment avec les vins rouges à UNlisaNon de peu de solvants toxiques à Rendement d extracnons très forts par rapport à d autres méthodes décrites
III. Résultats Les vins: à Les vins rouges sont les plus contaminés, puis viennent les rosés, et enfin les blancs
IV. Conclusions et perspecnves Réel risque pour la santé des consommateurs de vins rouge et rosé Nécessité de détecter les teneurs en OTA dans les vins HPLC = méthode rapide, reproducnble, sensible, sélecnve Développement et opnmisanon de la méthode pour : - Augmenter la limite de détecnon - Obtenir des rendements proches de la teneur réelle - Rendre l analyse encore plus rapide et simple - Diminuer le coût des analyses Développement de systèmes de filtranon des vins avant sounrage
IV. Conclusions et perspecnves 2002
IV. Conclusions et perspecnves 2009
IV. Conclusions et perspecnves 2009
IV. Conclusions et perspecnves 2011 QuanNficaNon par real- Nme PCR avec SYBR Green et Taqman
V. Références A. Viscon9, M. Pascale, G. Centonze (1999), DeterminaNon of ochratoxin A in wine by means of immunoaffinity column clean- up and high- performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A 864: 89 101. E. Anli, M. Bayra (2009), Ochratoxin A in Wines. Food Reviews Interna=onal 25 : 214 232. N. Belli, S. Marin, V. Sanchis, A.J. Ramos (2002), Review: Ochratoxin A (OTA) in Wines, Musts and Grape Juices: Occurrence, RegulaNons and Methods of Analysis. Food Science and Technology Interna=onal 8: 325-335. H. Schmidt, M. Bannier, R.F. Vogel, L. Niessen (2004), DetecNon and quannficanon of Aspergillus ochraceus in green coffee by PCR. LeAers in Applied Microbiology, 38, 464 469 A. Rhoua9, N. Paniel, Z. Meraihi, J.L. Marty (2011), Development of an oligosorbent for detecnon of ochratoxin A. Food Control 22: 1790-1796. A. Rodríguez, M. Rodríguez, M.I. Luque, A.F. Justesen, J.J. Córdoba (2011), QuanNficaNon of ochratoxin A- producing molds in food products by SYBR Green and TaqMan real- Nme PCR methods. Interna=onal Journal of Food Microbiology 149 : 226 235 Journal officiel de l union Européenne (2005) RÈGLEMENT (CE) No 123/2005 DE LA COMMISSION du 26 janvier 2005 modifiant le règlement (CE) no 466/2001 en ce qui concerne l'ochratoxine A [en ligne], consulté le 29/11/11. URL : hzp://www.ico.org/documents/ed1940f.pdf Wikipédia (2011) Ochratoxine A [en ligne], consulté le 29/11/11. URL : hzp://fr.wikipedia.org/wiki/ochratoxine_a Ins9tut français de la vigne et du vin (2010) L ochratoxine A ou OTA dans les vins [en ligne], consulté le 29/11/11. URL : hzp://www.vignevin- sudouest.com/publicanons/fiches- pranques/ochratoxinea- OTA.php#ancre12