Épreuve B (durée 3h) La membrane plasmique des globules rouges Les globules rouges ou hématies sont des cellules sanguines qui contiennent l hémoglobine, et par conséquent transportent l O 2 dans le sang. Ce sont des petites cellules (7,5µm de diamètre environ), en forme de disque biconcave (image ci-contre). On a identifié dans leur membrane des protéines qui leur donnent des propriétés particulières. A partir de l exploitation des documents et de vos connaissances, vous étudierez 3 propriétés de la membrane des hématies. Vous limiterez l exposé aux 3 thèmes indépendants abordés par les documents. -Une introduction et une conclusion générale sont attendues, -Un bilan illustré sera établi à la fin de chaque thème -Les documents peuvent être découpés et collés sur la copie, à condition d être exploités. THEME I : Les protéines structurales associées à la membrane des hématies Document 1: On réalise un cryodécapage d un échantillon d hématie, puis on observe au microscope électronique à balayage. D après Lodish, biologie moléculaire de la cellule, de Boeck. Face P ou hémimembrane cytoplasmique 1µm détail
Document 2: Document 2A: Alberts Molecular biology of the cell, Garland Science On extrait les protéines membranaires des globules rouges par un traitement avec un détergent qui déstabilise la bicouche lipidique. Puis on réalise une électrophorèse sur gel de polyacrylamide, en conditions dénaturantes, en présence de SDS (SDS PAGE). (A) Photographie du gel. La révélation se fait avec du bleu de Coomassie. (B) Indications de la position des principales protéines. Remarque: la migration de la glycophorine est fortement ralentie par ses groupements oligosaccharides. Document 2B: protéines membranaires et forme des globules rouges On a compilé des données sur: des maladies héréditaires dans lesquelles certaines protéines sont altérées, ou des données expérimentales dans laquelle on altère le fonctionnement d une des protéines. Résultats présentés dans le tableau ci-dessous. Remarque: dans la suite, on n étudiera pas le rôle de l actine ni de bande 4.1. Maladie Protéine altérée Micrographie des hématies Forme de la cellule Individu «sain» aucune Disque biconcave (diamètre 7µm) Individu atteint de sphérocytose spectrine Cellules sphériques et fragiles (diamètre 7µm) Individu atteint d elliptoctytose Bande 3 Cellules ellipsoïdales (grand axe 8µm) ankyrine glycophorine Cellules déformées Cellules en disque biconcave
Document 4 Document 4A: Localisation des protéines associées à la membrane du globule rouge: Ankyrine, bande3 et spectrine. Wilson & Hunt La cellule livre d exercices Flammarion NORMALES On utilise des hématies que l on traite d abord à la pronase, une enzyme de type protéase, qui ne peut pas traverser la membrane plasmique. Après 30 minutes d incubation, on lave afin d éliminer la pronase. Puis on extrait les protéines et on les sépare par une électrophorèse en conditions dénaturantes, en présence de SDS (SDS PAGE). L électrophorèse est révélée au bleu de Coomassie. On estime enfin l intensité des bandes par mesure de l absorbance grâce au spectrophotomètre. NE PAS TENIR COMPTE DE LA COURBE GRISEE. Document 4B Données structurales sur bande 3, la spectrine et l ankyrine Alberts Molecular biology of the cell, Garland Science La spectrine: protéine fibreuse, hydrophile, fine, flexible, longue de 100 nm (A) Schéma (B) Micrographie MET Bande 3: 930 acides aminés,12 domaines hydrophobes identifiés de plus de 20 acides aminés Ankyrine: protéine globulaire à cœur hydrophobe.
Document 5 Interactions ankyrine spectrine bande 3 Document 5A Wilson & Hunt La cellule livre d exercices Flammarion On incube des mélanges de protéines deux à deux avec un anticorps spécifique (anti-ankyrine par exemple). Les complexes anticorps protéines qui en résultent sont alors précipités et analysés. Résultats dans le tableau ci-dessus. Document 5A Document 5B Micrographie au Microscope électronique à transmission de la face cytoplasmique de la membrane d hématie Document 5B
THEME II : La protéine GLUT1 de transport du glucose Document 1: Etude structurale de la protéine GLUT1 Document 1A: On traite des membranes d hématie avec un détergent de façon à isoler les protéines, on extrait les protéines GLUT1. On réalise une électrophorèse en conditions dénaturantes sur un gel de polyacrylamide, en présence du détergent SDS et au mercaptoéthanol (qui rompt les ponts disulfure). Puis on révèle l électrophorèse par la méthode du Western blotting: un transfert sur papier de nitrocellulose est réalisée puis les protéines sont révélées grâce à des anticorps anti-glut1 marqués radioactivement. Enfin, on réalise une autoradiographie du gel, qui est présentée ci-contre. 55kDa Par ailleurs, une analyse en conditions non dénaturantes a montré que la protéine GLUT1 a une Masse Moléculaire d environ 220kDa. Document 1B: A partir de membrane d hématie, on extrait et on purifie les protéines GLUT1. Puis on établit le profil d hydrohobie de la protéine GLUT1 selon le principe suivant. Document 1B: profil d hydrophobie de GLUT1 d après Schechter Biophysique et biochimie de la mebrane Masson
Document 2: Orientation de la protéine GLUT1. Etape 1- On commence par obtenir des «fantômes» de globules rouges: on les fait éclater par choc osmotique, puis on referme la membrane: -Soit en conservant la face externe de la membrane tournée vers l extérieur: vésicules notées «normales». -Soit en retournant la membrane, ainsi la face interne de la membrane se retrouve vers l extérieur: vésicules notées «inversées» Doc 2A: protocole d obtention de vésicules de globules rouges Etape 2: on utilise un anticorps dirigé spécifiquement contre la portion 450-492 de la protéine GLUT1, c està-dire que l anticorps reconnaît l extrémité Cterminale de GLUT1. On note l anticorps Ac-450. On fixe sur cet anticorps un marqueur fluorecent afin de le repérer. On incube les vésicules, normales ou inversées avec l anticorps, Ac-450, puis on lave pour éliminer les anticorps non fixés. On mesure la fluorescence avec un microscope adapté, afin de localiser les anticorps fixés. Remarque: les Anticorps ne peuvent pas traverser les membranes. Les résultats sont dans le tableau ci-dessous. Vésicules normales Vésicules normales Vésicules inversées Vésicules inversées Anticorps ajouté Ac-450 aucun Ac-450 aucun Fluorescence observée non non oui non Document 3: On utilise des globules rouges intacts, on les place dans des solutions de concentration croissantes en D-glucose ou en L-Glucose. On mesure le flux entrant en Glucose (en mmol/s) dans les hématies. On porte aussi sur le graphe les résultats obtenus sur une membrane artificielle perméable au glucose (diffusion libre). Dans le sang, la concentration en glucose est de 0,9g/l soit 5mmol/l. Diffusion libre
THEME III - Reconnaissance cellulaire: Les antigènes des groupes sanguins Les hématies portent à leur surface des «antigènes» qui sont à l origine du caractère phénotypique des groupes sanguins A, B, AB ou O. On va chercher à préciser la nature moléculaire de ces antigènes et leurs propriétés. Document 1 Test de compatibilité entre groupes sanguins Demounem et al. Terminale S Nathan. On mélange : -des hématies prélevées sur des individus de chaque groupe -avec du sérum prélevés sur des individus de chaque groupe. Le sérum contient les anticorps produits par l individu. Par exemple un sérum d individu A contient des anticorps anti-b, capables de reconnaître les antigènes B. Expérimentalement, cette reconnaissance se manifeste par une agglutination des hématies. d individu A d individu B d individu O Agglutination: Pas d agglutination: Document 2 Analyse enzymatique des molécules constituant les antigènes des groupes sanguins On incube des globules rouges de chaque groupe sanguin avec un acide aminé radioactif (la leucine tritiée, notée Leu*). La Leu* est ainsi incorporée dans les protéines membranaires. On extrait et on purifie les glycoprotéines antigènes des groupes sanguins présentes dans les membranes des hématies. Document 2A - On réalise une électrophorèse en conditions non dénaturantes. Puis on révèle l électrophorèse par autoradiographie. On ne présente que les résultats obtenus avec des antigènes du groupe A. Colonne 1 - aucun traitement Colonne 2 On fait migrer un mélange Glycoprotéines extraites + Anticorps anti-a Colonne 3 On traite les glycoprotéines par une enzymes glucidase qui détruit les groupements oligosaccharides, puis on fait migrer un mélange Glycoprotéines + Anticorps anti-a Zone de dépôt 1 2 3
Document 3 Estimation de la taille des groupements oligosaccharides. Seiichi et al. Journal of biological chemistry, 1978 (modifié) On incube des hématies de chaque groupe sanguin avec un dérivé d ose radioactif, le N- acétylglucosamine, noté NAG*. Ce NAG est ainsi incorporé dans les glycoprotéines membranaires. On extrait et on purifie les glycoprotéines des groupes sanguins, puis on réalise un clivage enzymatique afin de récupérer la part glucidique (groupement oligosaccharide). Enfin, on fait migrer les groupements oligasaccharides sur un colonne de chromatographie «gel de filtration» qui permet de séparer les molécules selon leur taille. L éluant est ajouté en continu: le volume d élution correspond à la quantité d éluant ajouté. On récupère l éluant dans des tubes en bas de colonne, on mesure la radioactivité dans chacun de ces tubes. (voir figure ci-contre) Ou volume d éluant ajouté Faire un schéma Document 3A: résultats obtenus avec des hématies A et B Radioactivité mesurée (en cpm) 200 400 Échelle de référence de taille, en nombre d oses Volume d élution (ml) Document 3B: résultats obtenus avec des hématies de groupe O Radioactivité mesurée (en cpm) Échelle de référence de taille, en nombre d oses 200 400 Volume d élution (ml)
Document 4 Seiichi et al. Journal of biological chemistry, 1978 (modifié) Pour chaque échantillon, c est-à-dire pour chaque groupe sanguin: - Dans les tubes contenant les oligosaccharides, on réalise un traitement enzymatique qui rompt les liaisons glycosidiques entre chaque ose. -Puis on réalise une chromatographie sur couche mince. -La révélation se fait avec un colorant spécifique des oses. On quantifie l absorption lumineuse de chaque bande, plus la bande est marquée sur le gel, plus le pic d absorption est grand. Document 4A: analyse des oses présents dans les antigènes du groupe sanguin A 0,4 0,2 Document 4B: analyse des oses présents dans les antigènes du groupe sanguin B 0,4 0,2 Document 4C: analyse des oses présents dans les antigènes du groupe sanguin O 0,4 0,2 1: Glucose, 2: Galactose, 3: N-acétyl Glucosamine (NAG), 4: N- acétyl Galactosamine (NAGal), 5: Fucose
DS n 3 Epreuve B La membrane des globules rouges Correction Plan: /1,5 Soin orthographe: /1 I- Les protéines structurales associées à la membrane des hématies A- La membrane comporte deux constituants: protéines et lipides Face P ou hémimembrane cytoplasmique la fracture a eu lieu entre les 2 couches de la membrane, et a retiré l hémimembrane externe. (0,5) Cellule en coupe transversale (0,25) On observe des petits grains qui sont des protéines incluses dans la bicouche lipidiques. (0,5) Bilan: la membrane de l hématie est classiquement une bicouche de lipides dans laquelle s insèrent des protéines. (0,5) Document 2A: Ce document permet seulement d identifier les protéines qu on va étudier. La migration a lieu en conditions dénaturantes, les sous unités sont séparées, (0,5) On peut remarquer donc remarquer que: -La spectrine comporte 2 types de sous unités (α à 240kDa et β à 220kDa). (0,5) -L ankyrine (210kDa), bande 3 (1000kDa), la glycophorine (30kDa) comporte une seule sous unité ou un seul type de sous unités (0,5) B- Les protéines associées à la membrane impliquées dans le forme des hématies Document 2B: L altération de la spectrine modifie la forme de la cellule qui devient sphérique et fragile donc la spectrine est nécessaire pour maintenir la forme en disque biconcave des hématies. (0,5) Hyp: Elle doit probablement aussi rigidifier la membrane (0,5) - L alétration de bande 3 et de l ankyrine modifie aussi la forme de la cellule donc bande 3 comme l ankyrine sont nécessaires pour maintenir la forme en disque biconcave des hématies. Mais la perte de bande 3 ou de l ankyrine n influence pas la fragilité de l hématie. (0,5) - L altération de la glycophorine ne modifie pas la forme de la cellule donc la glycophorine n est pas nécessaire pour maintenir la forme en disque biconcave des hématies (0,5) C- Localisation et interactions des 3 protéines impliquées dans la forme de l hématies 1) Une étude enzymatique pour localiser les protéines Document 4 Doc 4A La pronase ne peut agir que sur la face extracellulaire de la membrane (0,5). (A) Témoin sans traitement enzymatique: on retrouve les 2 bandes des spectrinesβet α, de l ankyrine, et de bande 3, déjà vues dans le document 2. (0,25) (B) Avec traitement par la pronase: - Rés: les bandes de la spectrine et de l ankyrine restent inchangées donc elles n ont pas de domaines du côté extracellulaire. On peut faire l hypothèse que ce sont des protéines situées dans le cytosol ou dans l hémiembrane interne. (0,75) Le document 4B permet de préciser, la spectrine est une protéine fibreuse et hydrophile, elle doit être intégralement cytosolique. (0,5) L ankyrine a un cœur hydrophobe seulement qui ne lui permet pas d interagir avec les phospholipides membranaires, elle doit aussi être cytosolique. (0,5) - Rés: Avec traitement par la pronase, Bande 3 migre plus loin donc, à cause de ce traitement la protéine est plus courte, elle a été clivée par la pronase. (0,5) Par conséquent, on peut déduire que bande3 a un domaine du côté extracellulaire. On peut faire l hypothèse qu il s agit d une protéine transmembranaire. (0,5) Le doc 4B nous indique 12 domaines hydrophobes avec une longueur suffisante pour être transmembranaires, des hélices α probablement. (0,5) 2) Les interactions entre protéines structurent la membrane Document 5A Rés 1: Un mélange bande 3 spectrine traité par un anticorps anti-spectrine ne précipite que la spectrine, donc bande 3 n interagit pas directement avec la spectrine. (0,5) Rés 2: Un mélange bande 3 ankyrine traité par un anticorps anti-ankyrine précipite la spectrine et l ankyrine, donc bande 3 interagit directement avec l ankyrine. (0,5) Rés 3: Un mélange ankyrine spectrine traité par un anticorps anti-spectrine précipite la spectrine et
Ankyrine + bande 3 spectrine (0,75) Schéma bilan (1) Rmq: ici le modèle comporte aussi des protéines non étudiées dans ce devoir II- La protéine GLUT1 transporte le glucose A- L électrophorèse renseigne sur la taille et la structure de GLUT1 Document 1A: Protocole: l électrophorèse est réalisée en conditions dénaturantes, la protéine est dépliée, ses sous-unités (si il y en a) sont séparées. (0,75) Rés: on observe une seule bande à 55kDa Int: GLUT1 contient une seule sous unité de 55kDa ou plusieurs fois cette sous unité de 55kDa. (1) On nous indique que la masse moléculaire totale est de 220kDa, on peut en déduire que GLUT1 correspond à l association de 4 sous unités identiques de 55kDa chacune, c est un tétramère. (0,75) B- GLUT1 est une protéine transmembranaire 1) Les domaines transmembranaires: Doc 1B: Le profil d hydropathie indique 12 segments hydrophobes, bien que l échelle ne soit pas très précise, ces segments contiennent 20 ou plus acides aminés. (0,5) On peut en déduire que GLUT1 est probablement constituée de 12 hélices α hydrophobes, donc en position transmembranaires. (1) 2) Orientation de GLUT1 Document 2: Protocole: l anticorps Ac-450 ne peut accéder que à l hémimembrane tournée vers l extérieur, en effet, on nous indique qu il ne peut traverser la membrane. Par exemple, avec une vésicule inversée, l Anticorps peut accéder à la face interne de la membrane. (0,75) Si on observe une fluorescence, c est que l anticorps a pu se fixer sur GLUT1, et sur le site reconnu spécifiquement: l extrémité Ct. (0,5) Rés: sur des vésicules normales, l anticorps ne se fixe pas DONC l extrémité Ct n est pas situé sur la face externe de la membrane. (0,75) Rés: sur des vésicules inversées, l anticorps se fixe DONC l extrémité Ct est bien située sur la face interne de la membrane de l hématie. (0,75) C- La cinétique nous renseigne sur les modalités du transport de glucose Document 3: Résultats : on ne mesure pas un flux augmentant de façon linéaire comme dans la diffusion libre. Aux faibles C, le flux mesuré est supérieur au flux attendu par diffusion simple. Mais aux plus fortes C, la courbe atteint un plateau de saturation. De plus, on remarque, que le flux reste nul si on fournit expérimentalement du L Glucose plutôt que du D glucose. Même résultat si on fournit du D galactose par exemple (1). Interprétation : la diffusion est réalisée par une protéine transporteur (0,5) avec les propriétés suivantes : le D glucose se fixe spécifiquement sur un site de la protéine (0,5), avec une affinité propre mesurée par le Km (0,25). Il existe donc une spécificité de la protéine transporteur pour la molécule transportée, impliquant des liaisons faibles et une complémentarité de forme (d où la stéréospécificité en particulier). Le processus de diffusion est spécifique (0,5). Au-delà d une certaine concentration extracellulaire de glucose, on observe une saturation de la protéine : tous les sites de fixation sont occupés, la vitesse de transfert ne peut plus augmenter. (0,5) A glycémie normale, la vitesse est d environ 390mmol/s soit 77% de la vitesse maximale. (0,5)
Structure d une sous unité de GLUT1 12 hélices α transmembranaires GLUT1: deux Sous unités seulement ont été représentées (ici glucose) Schéma bilan (1) III- Les groupes sanguins sont déterminés par des antigènes des hématies A- Test de reconnaissance entre anticorps et antigènes des groupes sanguins Doc 1: 4- Les hématies O ne sont jamais reconnues et agglutinées Donc elles ne portent pas d antigène dans leur membrane. (0,75) 1-Le sérum anti-b agglutine les hématies B et AB. DONC Les anticorps anti-b reconnaissent les antigènes B, portés par les hématies B ou AB. (0,75) 2- Le sérum anti-a agglutine les hématies A et AB DONC Les anticorps anti-a reconnaissent les antigènes A, portés par les hématies A ou AB. (0,75) 3- Le sérum anti AB agglutine les hématies A, B et AB. Il contient des anticorps anti-a et anti-b. (0,75) B- La reconnaissance anticorps antigène se fait grâce aux groupements oligosaccharides Document 2: Prot: L électrophorèse est réalisée en conditions dénaturantes, par conséquent les interactions et liaisons faibles sont conservées (0,5). Un acide aminé est marqué radioactivement, la partie protéique est radioactive on peut donc la repérer avec l autoradiographie (0,5). Rés1: sans ajout d anticorps anti-a, la bande témoin sert de référence pour la migration des glycoprotéines. (0,5) Rés 2: Lorsque la migration a lieu en présence de l anticorps anti-a, la bande est visible à une plus faible distance du dépôt. Int 2: la glycoprotéine migre plus lentement, à cause de l interaction qui a lieu entre l anticorps et la glycoprotéine. L anticorps Anti-A reconnaît et interagit avec la glycoprotéine. (1) Rés 3: le traitement enzymatique détruit la partie oligosaccharide. On observe que la migration est quasiment identique à celle du témoin. Int3: Il n y a pas eu d interaction entre l anticorps et la protéine. L anticorps doit interagir avec la partie oligosaccharide. (1) La petite différence de migration peut être du à la perte du groupement oligosaccharide qui induit une Masse moléculaire un peu plus faible (0,5)
C- qui sont spécifiques de chaque groupe sanguin Document 3 - Prot: Comme on a marqué le NAG, le pic de radioactivité nous indique le ou les tubes qui contiennent les groupements oligosaccharides. (0,5) Rés: Les hématies de groupes A ou B sont caractérisées par des groupements oligosaccharides de 6 ose. Alors que les hématies O ont des groupements oligosaccharides à 5 oses. (0,5) Int: La reconnaissance se fait sur le nombre d oses entre le groupe O et les 2 autres (A ou B), mais ce caractère est insuffisant pour distinguer tous les groupes. Hyp: la nature des oses est probablement différente selon le groupe sanguin. (0,75) Document 4: Pour le groupe sanguin A: on distingue 5 oses différents, pour un oligosaccharide à 6 oses, 1: Glucose, 2: Galactose, 3: N-acétyl Glucosamine (NAG), 4: N- acétyl Galactosamine (NAGal), 5: Fucose. Mais le pic 2 est 2 fois plus haut, on peut supposer que le groupement comporte 2 galactose. (0,75) Pour le groupe sanguin B: on distingue 4 oses différents, pour un oligosaccharide à 6 oses 1: Glucose, 2: Galactose, 3: N-acétyl Glucosamine (NAG), 5: Fucose. Mais le pic 2 est 3 fois plus haut, on peut supposer que le groupement comporte 3 galactoses. (0,75) Pour le groupe sanguin O: on distingue 4 oses différents, pour un oligosaccharide à 5 oses 1: Glucose, 2: Galactose, 3: N-acétyl Glucosamine (NAG), 5: Fucose. Mais le pic 2 est 2 fois plus haut, on peut supposer que le groupement comporte 2 galactose. (0,75) Schéma bilan (1) Antigène 0 reconnu par les anticorps Anti-O Antigène A reconnu par les anticorps Anti-A Antigène B reconnu par les anticorps Anti-B