Génétique II A) Transformation d'e.scherichia coli par l'adn plasmidique. 1- Principe : La transformation bactérienne survient dans les conditions naturelles et concerne un changement dans les caractères héréditaires d'une souche causé par l'adn d'une autre. La transformation bactérienne a été découverte pour la première fois, chez Diplococcus pneumoniae, et a été par la suite retrouvée notamment chez Haemaphilus influenzae et Bacillus subtilis. Chez les bactéries Gram positives, la cellule qui va être transformée devient tout d'abord compétente, c'est-à-dire capable d'incorporer l'adn exogène. L'ADN absorbé sous forme de double brin, va passer à l'état du simple brin, ce passage est accompagné d'une phase d'éclipse, où l'adn simple brin, demeure résistant à l'action des nucléases et s'intègre par recombinaison au niveau du chromosome bactérien. Finalement, l'adn intégré se réplique, ségrége et s'exprime et on dit que la cellule hôte a été ainsi transformée puisqu'elle acquiert un nouveau phénotype (figure 2). Récepteur (DNA binding protein) Protéine de compétence se liant à l ADN Nucléase Nucléotides Rec A (enzyme permettant la recombinaison) Chromosome Intégration d une partie de la molécule d ADN exogène Hétéroduplex Figure 2. Mécanisme de la transformation génétique chez les bactéries. (a) l'adn exogène est adsorbée sur la paroi de la cellule grâce à des récepteurs. b) l'adn exogène pénètre dans la cellule sous forme simple brin, le brin complémentaire est digéré par les nucléases localisées au niveau de la paroi. L'ADN simple brin est protégée des nucléases cellulaires par les protéines spécifiques de la compétence (c) l'adn exogène reconnaît la partie du chromosome bactérien qui lui est complémentaire et s apparie avec elle. Par double crossing-over l'adn exogène est intégrée à l'un des deux brin du chromosome (d) formation d'un hétéroduplex: chromosome bactérien avec un brin parental et un brin recombiné. La division bactérienne aboutit à deux bactéries filles dont l'une est parentale et l'autre est transformée 1
Les premières tentatives de transformation expérimentale d'e. coli ont été infructueuses et il en avait été déduit que cette bactérie ne comportait pas à l'état naturel les systèmes de transformation. Mandel et "Higa " (1970) ont découvert que E, coli pouvait être transfectée par les phages (φ2 et λ) après traitement par les ions calcium; cette méthode a été ensuite modifiée par Cohen et coli. (1972) pour l'obtention de cellules d E. coli survivantes transformées par l' ADN plasmidique après traitement au CaCl2. Expérimentalement, la méthode (Lederberg et Cohen, 1974) consiste à faire croître des bactéries dans une solution hypotonique de chlorure de calcium à 0 C, ce qui provoque la formation de sphéroplastes (Renner et coll.,1973); l'adn ajouté forme des complexes hydroxyle-calcium-phoshate résistants aux DNAses et qui adhèrent à la surface cellulaire ; Ce complexe peut être incorporé par un bref choc thermique des cellules compétentes. Dans cette méthode donc, l'état de compétence (qui ne demeure que deux à trois jours) est induit artificiellement en exposant les cellules au chlorure de calcium avant l addition de l ADN. Cependant, si la durée du temps d incubation en CaC12 passe de 30 minutes à 24 heures, Le taux de transformation (nombre de cellules viables transformées x 100 / nombre total de cellules viables) est de l'ordre de 20% (Dagert et Ehrlich, 1979). Un autre aspect contrôlé du processus, concerne la stabilité de 1 ADN pénétré dans la cellule. En effet, il a été démontré que la forme surenroulée de l ADN plasmidique présentait une efficacité de transformation de l'ordre de 10 à 100 fois plus élevée que la forme linéaire de la même molécule; la forme linéaire est en effet dégradable par les exonucléases, ce qui empêche sa circularisation, état nécessaire à sa réplication ultérieure. Pour améliorer l'efficacité de transformation, certains chercheurs se sont orientés vers l'utilisation de souches d'e. coli mutante présentant des enveloppes cellulaires altérées ou déficientes pour les systèmes de restriction-modification. 2- Matériel et méthodes: 2-a- Matériel biologique : *Souche bactérienne: souche mutante de E coli désignée par DH5 α. 2
*Plasmides: ADN circulaire désigné par pcr2.1 ayant un gène de résistance à l'ampicilline et un deuxième de résistance à kanamycine (figure). 2-b- Méthodes:, Les milieux et la verrerie utilisés ont été préalablement sté1ilisés. -Préparation des cellules compétentes Les cellules DH5 a sont préparées de la façon suivante : * 1,.5 ml de milieu LB dans une mini fiole est inocule par une colonie de DH5 α (préculture jusqu'à la phase stationnaire toute la nuit à 37 C). : * la pré culture est transférée dans Une fiole contenant 50 ml de L B et incubée à 37 C jusqu'à obtenir une DO (densité optique) de 0,2-0,3 à 640 nm. *-Centrifuger 5 min à 3000g * Reprise du culot dans 10 ml de CaCl2 50mM * Incuber 20 min ou plus dans la glace *Centrifuger 5 min à 3000g * Reprendre le culot dans 1,5 ml de CaCl2 50mM Les bactéries sont prêtes à être transformées (stockées dans le froid, les cellules compétentes gardent cette propriété pendant trois jours ). -Transformation. * Dans un tube Eppendorf, 100 µl de bactéries compétentes auxquelles on ajoute 2 à 10 µl de solution de plasmide sont incubées dans la glace pendant 30 à 60min. * Le tube est ensuite, chauffé à 42 C (bain Marie) pendant 90 secondes * Le tube est réincubé ensuite sur la glace pendant 2min * On ajoute 850 µl de milieu LB au tube * On incube une heure à 37 C sous agitation douce. * Différentes dilution." sont faites et ensemencées sur boites LB+ Ampicilline (10 µg/ml finale) 3
B- Extraction de l ADN plasmidique l-principe : Pour un certain nombre de manipulations ( digestion enzymatique, transformation, etc.) il n'est pas nécessaire d'avoir une grande quantité d'adn plasmidique purifié; aussi des techniques rapides (mini lysats, mini préparations) ont été mises au point pour obtenir rapidement de petites quantités de plasmides relativement pures. Toute procédure concernant l'isolement de l ADN plasmidique comporte nécessairement les trois étapes principales suivantes: * Croissance bactérienne, * lyse cellulaire, * purification de l'adn plasmidique. a) Croissance bactérienne Les bactéries sont d'ordinaire mises en croissance en milieu riche, sous agitation vigoureuse. La croissance est effectuée à partir d'une seule colonie bactérienne, dont il a été prouvé qu elle contenait le plasmide. Pour ce faire, cette croissance est réalisée dans les conditions de systèmes sélectifs adéquats. b) Lyse cellulaire La lyse des bactéries s'effectue en deux étapes. Dans un premier temps, les cellules sont traitées par le lysozyme qui affecte l'intégralité de la paroi cellulaire et provoque la formation de sphéroplastes; ce traitement est effectué en présence de glucose (qui permet la conservation de l'intégrité de ces structures) et du tampon tris-edta qui, chez les bactéries gram négatives comme E.coli, élimine les.constituants de l'enveloppe externe et expose ainsi les péptidoglycanes de la paroi. Dans un second temps la lyse est complétée par l'addition d un détergent. Dans le cas des détergents ioniques (SDS, sarcosyle) ce traitement libère l'ensemble de l'adn cellulaire à partir duquel l'adn du chromosome bactérien sera ultérieurement fragmenté 4
(alors que l'adn plasmidique y sera conservé intact à "causé,de sa petite taille et de sa conformation particulière). c) Séparation de l'adn plasmidique La plupart des minipréparations de l ADN plasmidique fermé contraint, sont basées sur la méthode au traitement alcalin. Le traitement par la soude dénature l' ADN, mais il existe une gamme étroite de ph (entre 12 et 12,5) où seuls les brins complémentaires, des formes de duplexe linéaires et circulaires ouverts sont séparées, alors que ceux de la forme fermée contrainte restent appariés; après neutralisation (acétate de sodium 4M ph 5,8) l'adn dénaturé se renature et s'agrège, sous forme d un précipité, insoluble (pelote), qui peut être extrait du surnageant. 2-Matériel et méthodes - Minipréparation dé l'adn plasmidique * 8 ml de LB + Antibiotique est inoculé par une colonie de bactéries transformées et incubé une nuit à 37 C sous agitation. Le contenu est réparti dans des tubes Eppendorf soit 1,5 ml par tube. * Après une centrifugation de 5 min à 10 000 g le culot est repris dans 100 µl de TEG (Tris-HCl 25 mm ph 7, EDTA 10 mm, Glucose 5OmM) + le lysozyme qui est ajouté au moment de l'emploi (2 µg/ml). Le tout est homogénéisé au vortex puis incubé 10 min à la température ambiante. * Ajouter au tube 200 µl de la solution NaOH 0,2 N et SDS 1% ; et incuber le tube 10 min dans la glace * Neutraliser en ajoutant 150 µl de la solution acétate de sodium 3M ph 4,8 et incuber 30 min à 0 C (sur la glace). * Centrifuger 5 min à 10 000g et à 4 C. le surnageant est récupéré et l ADN plasmidique est précipité en ajoutant 1 ml d'éthanol. * Centrifuger à 10 000g pendant 10 min puis rincer à l'éthanol 70% (1ml d'éthanol 70%), centrifuger à 10 000g pendant 20 secondes et en ensuite sécher et reprendre dans 20 µl de tampon TE. 5
c- Eléctrophorèse analytique d'adn 1-Principe: Dans les zones de ph neutre ou alcalines, les groupements phosphates de l'acide phosphorique de l'adn, sont ionisés; il en résulte que les chaînes polynucléotidiques d ADN constituent des polyanions qui, lorsqu'ils sont soumis à un champ électrique, se déplacent vers l'anode. La mobilité électrophorétique des fragments d'adn, à taille égale, dépend principalement de la viscosité du milieu. Deux types de support sont utilisés en électrophorèse d ADN: L'agarose et l acrylalmide La taille des pore d un gel d'agarose dépend de la concentration de l agarose dans le milieu, qui; peut varier de 0,5 à 2 %.L'utilisation du gel d'agarose permet la détection des fragments de taille comprise entre 0,5 et 50 Kb par contre, le gel d acrylamide est réservé à la détection des tailles de fragments d'adn au dessous de, 1 Kb. A titre d exemple un, gel d agarose à 1% de 12 cm de longueur peut permettre la résolution des fragments de restriction de 30 Kb à 200 pb, alors qu un gel, de polyacrylamide à 7,5 % de même longueur, peut résoudre les fragments d'une taille comprise entre 2 Kb et 50 pb.. Le bromure d'éthidium (BET) est un analogue de base qui s'intercale dans l ADN et qui présente la propriété d'émettre une fluorescence orange lorsqu'il est excité en lumière ultra-violette. La longueur d onde optimale est 254 nm, mais celle de 300nm est généralement utilisée, pour éviter les coupures et dimérisation de la molécule. Les fragments d ADN ayant migré peuvent être ainsi révélés après un bain du gel dans une solution de bromure d'éthidium et exposition aux UV. La technique est extrêmement sensible puisque, à la limite, 10 ng d ADN par bande peuvent ainsi être révélés; de plus l'intensité de la fluorescence est directement proportionnelle à la masse d'adn par fragment. La vitesse de migration électrophorétique des fragments d'adn dépend de deux facteurs principaux : 6
La taille : les molécules d'adn linéaire double brin migrent d'autant plus rapidement que leur taille est petite. Il existe une relation inverse entre la mobilité et le logarithme de la taille. La conformation: les molécules d'adn plasmidiques circulaires, comme pbr322, se présentent sous trois conformations de taille identique; la forme circulaire contrainte (formei), la forme circulaire relâchée (forme II) et la forme linéaire (forme III). La mobilité électrophorétique de ces trois formes peut varier selon la taille et dépend de nombreux facteurs, dont; le diamètre des pores du gel, le voltage et la force du tampon de migration utilisé. Il en résulte que, dans certains cas, la forme l migre plus rapidement que la forme III, mais dans d'autres cas cet ordre peut être inversé. En concentration de plus en plus élevée en bromure d'éthidium, la forme II se transforme progressivement en forme l par incorporation progressive du colorant, et la mobilité de la molécule saturée est ainsi augmentée. L'analyse électrophorétique de ce type d'adn est encore compliquée par le fait qu'il existe aussi, dans les préparations plasmidiques, des dimères surenroulés ou relâchés des mêmes molécules. Par digestion avec une enzyme de restriction, un plasmide peut être ouvert, ce qui permet l'estimation de la mobilité de sa forme linéaire. La taille des fragments d'adn est estimé par comparaison à des marqueurs de taille tels que «1 Kb Lader» ou «Lambda/HindIII». 2- Matériel et Méthodes Mise en pratique de l électrophorèse d ADN sur gel d agarose. Préparation du matériel Gel d agarose 1- Mélanger tampon TAE et agarose à raison de 0,8 g d'agarose pour 100 ml de tampon (la proportion d agarose dépend de la taille des molécules d ADN à séparer). 2- Faire fondre l'agarose au four à micro-ondes en surveillant pour éviter les projections ou au bain marie. Agiter de temps à autre pour homogénéiser le mélange. 3- Laisser refroidir jusqu'à ce qu il devienne possible de saisir le flacon à main nue (environ 60 C). 7
4- Placer les joints fournis avec la cuve pour fermer le support de gel et positionner le peigne à 1 mm du fond et à environ 1 cm de l extrémité du support. Régler le niveau pour que le support de gel soit horizontal. 5- Couler lentement le gel sur 3 à 5 mm d'épaisseur en veillant à ce qu il entoure bien les dents du peigne. 6- Laisser refroidir, enlever le peigne et les joints. Le gel est prêt pour le dépôt des échantillons. NB On peut préparer du gel à l avance et le conserver solide au réfrigérateur dans un flacon en verre (rempli aux 2/3 maximum). Au moment de l emploi, refondre le gel au four à micro-ondes (ouvrir le bouchon et surveiller pour éviter les projections) ou au bainmarie bouillant (ouvrir le bouchon). Gel d'agarose (0,8 g/100 ml) Mise en place du peigne et des joints de coulage (minicuve pour gel 8 x 6,5 cm) Électrophorèse en gel d agarose après migration et coloration par le bromure d éthidium. FIGURE DE GAUCHE: - piste 1: Marqueurs de taille (en paires de bases). - piste 2: Echantillon d ADN dont la taille est à déterminer. FIGURE DE DROITE: - Courbe d étalonnage en abscisses, les distances par rapport au puits d inclusion: et en ordonnées les poids moléculaires (échelle logarithmique). o Préparation et dépôt des échantillons 8
Les solutions d'adn peuvent être conservées indéfiniment à - 20 C. Protocole * Placer les échantillons d ADN pendant 3 min à 60-65 C. * Les transférer sur de la glace pendant 2-3 min. Ces deux opérations sont destinées à empêcher la ligation de fragments possédant éventuellement des extrémités cohésives. 1. Mélanger le tampon de charge et l ADN et prélever le mélange avec une micropipette réglée sur le volume approprié en changeant de cône à chaque prélèvement. 2. Placer le support avec le gel dans la cuve d'électrophorèse en positionnant les puits du côté de la cathode (pôle noir). 3. Remplir la cuve de tampon TAE 4. Remplir les puits en faisant attention de ne pas déchirer le fond du gel avec la pointe de la pipette. 5. Fermer la cuve, brancher les fils et mettre sous tension. 6. Laisser migrer jusqu à ce que le colorant de charge arrive à proximité du bord du gel (environ 55 min à 100 V pour un gel de 80 mm dans une minicuve). 7. Couper l alimentation, débrancher les connections et récupérer le gel dans son support. Attention au transport : le gel glisse très facilement de son support. 9
Electrophorèse d'adn sur gel d'agarose 15 x 10 cm (15 puits) Noter la migration du colorant de charge de la cathode vers l'anode o Révélation des bandes d ADN En plus de la coloration des ADN au bromure d éthidium déjà mentionnée plus haut, on peut révéler les ADN par coloration au bleu de Nile. Cette technique offre le double avantage de la facilité et de la sécurité. En effet pour visualiser les ADN après coloration on a pas besoin des UV comme pour la coloration au bromure d éthidium. On évite donc l utilisation des UV et de bromure d éthidium qui sont tout les deux dangereux. o Coloration des bandes d ADN au bleu de Nile Attention, le gel doit être manipulé avec soin car il est très fragile. 1. Recouvrir le gel avec le colorant. 2. Laisser agir de 1 h à une nuit puis vider le colorant (qui peut être réutilisé). Les bandes d ADN apparaissent en bleu. Les gels sont observables à ce stade mais on peut vouloir décolorer le fond pour améliorer la qualité des photographies. 1. Rincer dans l eau distillée pendant quelques heures en changeant l eau de temps en temps. 2. Photographier le gel avec un appareil numérique ou le scanner. Le cliché ci-dessous, réalisés avec un scanner, présentent les résultats obtenus pour un gel d'agarose. 10
Noter que le contraste de l image a été amélioré par traitement numérique de l images afin d'éviter la perte d'informations résultant de la prise de vue. En effet, les bandes les moins marquées mais néanmoins visibles à l'oeil nu ne sont parfois pas détectées par l'appareil de prise de vue. Minigel 8 x 6,5 cm coloré par le bleu de Nile 11
Informations pratiques o Solutions Tampon TAE 10 X (Tris Acétate EDTA) ph 7,6 Pour 2 L d eau distillée : Tris-base [tris(hydroxyméthyl)aminométhane] : 0,4M : 96,88 g Acétate de sodium 0,05 M : 13,60 g d acétate de sodium 3H 2 O EDTA 0,01 M : 7,44 g (sel disodique de l acide éthylène diamine tétraacétique). Ajuster le ph à 7,6 avec HCl 12N Tampon TE 10 X (Tris EDTA) ph 8 Tris-base [tris(hydroxyméthyl)aminométhane] 100 mm ph 8 EDTA (sel disodique de l acide éthylène diamine tétraacétique) 1 mm ph 8 Colorant de charge ph 8 Bleu de bromophénol 3 mm Saccharose 1,5 M Tris 10 mm ph 8 Solution de coloration pour les gels Solution stock (concentrée 100 fois) à conserver au réfrigérateur : Dissoudre 10 mg de bleu de Nile dans 5 ml d eau distillée. Solution de coloration : 1 ml de la solution stock pour 100 ml d eau distillée. Selon la taille de la cuve de coloration, préparer 200 à 300 ml de la solution de coloration Milieu LB (Luria-Bertani) Composition pour un litre: 1.0% Tryptone soit 10 g 0.5% extraits de levures soit 5 g 0.5% NaCl soit 5 g ph 7.0 12
Marqueur de poids moléculaire : Smartladder. 13
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