Phénomènes interfaciaux mis en jeu dans les interac6ons molécule- membrane V. Rosilio Ins$tut Galien Paris- Sud, UMR CNRS 8612 - Université Paris- Sud 11 Journées de Chimie X-ENS-ESPCI ParisTech-UPS de Chimie 2013
Challenges de la délivrance ciblée de substances aux cellules Solubilité aqueuse RE R M Transport passif (médié ou non) Transport ac3f N G Mi spécificité gemcitabine M: membrane plasmique N: noyau G: golgi RE: re6culum endoplasmique Mi: mitochondrie R: récepteur membranaire tetraphenylporphyrine (TPP) 2
Interac6on de la gemcitabine avec la cellule Gemcitabine Hydrosoluble Lignée cellulaire sensible Lignée cellulaire résistante hent1 Transport ac6f Pas de transport ac6f, ni passif Bildstein et al., So? Ma@er, 2010 3
Le concept de la squalenoyla6on squalene squalene γ gemcitabine SQ- Gem Couvreur et al., Nano Le@ers 2006 Rosilio et al., EP1761551 B1, 2011 European Inventor Award finalists, 2013 4
Le concept de la squalenoyla6on squalene a = 8.8 nm H 1 squalene D = 80-150 nm γ gemcitabine SQ- Gem Couvreur et al., Nano Le@ers 2006 Rosilio et al., EP1761551 B1, 2011 European Inventor Award finalists, 2013 DL = 50% Couvreur et al., Small 2008 5
Porphyrines glycodendrimériques NH N N HN H H H H H H H H H HN NH NH HN H NH HH H H H H H H H H H H H H H α- mannose ou H (DP) GDP- DEG GDP- TEG Ballut et al., Chem Commun. 2009 récepteur lec6nique (Concanavaline A) 6
Mécanismes d interac6on avec la membrane? reconnaissance moléculaire? endocytose? Diffusion passive? SQ-Gem Porphyrines 7
Membranes cellulaires Modèle mosaïque fluide, Singer & Nicholson, Science, 1972 R RE M N G Mi Modèle mosaïque, Engelman, Nature, 2005 Extracellulaire M: membrane plasmique N: noyau G: golgi RE: re6culum endoplasmique Mi: mitochondrie R: récepteur membranaire Intracellulaire 8
Modélisa6on de la membrane cellulaire Modèles bicouches et monocouches Alberts, Molecular Biology of the Cell 1985. 9
Modélisa6on de la membrane cellulaire Intérêt des monocouches dans l approche biomimé3que Curr. pin. Struct. Biol. 1999 + V b - - V + b V - b Air Water Monolayer π contrôle de la composi6on contrôle de la densité superficielle Bilayer Water contrôle de la pression latérale contrôle de la nature du milieu environnant 10
Lipides membranaires Composi6on lipidique des membranes, van Meer, Nat Rev Mol Cell Biol 2008 choline (40-50%) sérine éthanolamine (<10%) ( 20%) R- glycérol- (chaine d acide gras) 2 : glycérophospholipide ou R- sphingosine- acide gras : céramide ( 20%) 11
Propriétés des lipides membranaires SPC Propriétés des phospholipides Géométrie globale (CPP) Température de transi6on de phase Nature des têtes polaires Conforma6on des chaines acyl SPHINGMYELINE rganisa6on latérale non aléatoire 12
Propriétés des lipides membranaires Paramètre d empilement (critical packing parameter) CPP = v h a p l c a p = aire moyenne par tête l c = longueur de la chaine v h = volume chaine hydrocarbonée T, ph et I - dépendant 1 < CPP <1 2 CPP < 1 3 CPP 1 1 3 < CPP < 1 2 CPP >1 Israelachvili, Intermolecular Forces 1992 Nagarajan, Langmuir 2002 13
Propriétés des lipides membranaires Polymorphisme lyotrope et thermotrope Wilkinson & Nagle, BBA 1982 Barenholz & Cevc in Physical Chemistry of Biological Interfaces 2000 14
Propriétés interfaciales des lipides membranaires
Isotherme π - A Changement d état au sein d une monocouche CLLAPSE! Π (mn/m)" ETAT SLIDE! ETAT LIQUIDE! LC LE ETAT GAZEUX! Aire moléculaire (Å 2 )! 16
Propriétés des lipides membranaires Effet de la température sur le comportement interfacial de DPPC π = Δγ 45 C T m = 41 C Wilkinson & Nagle, BBA 1982 15 C Bordi et al., Colloids Surf B 2008 17
Propriétés interfaciales des lipides membranaires Effet de la nature de la tête polaire sur le comportement interfacial du phospholipide (interface air/eau et air/tampon) SPC/eau SPE/eau SPS/eau Température : 22 ±1 C ph eau: 6.5 ph sol HEPES: 6.5 SPC/HEPES SPE/HEPES SPS/HEPES HEPES: 4- (2- hydroxyethyl)- 1- piperazineethane sulfonic acid 18
Propriétés interfaciales des lipides membranaires Effet de la conforma3on des chaines acyl sur le comportement des phospholipides Comparaison de DSPC, DPC et SPC (T= 22 ±1 C) T m = 6 C T m = - 20 C T m = 55 C 19
Propriétés interfaciales des lipides membranaires Compressibilité latérale C s des monocouches Comparaison de DSPC, SPC et DPC (T = 22 ±1 C) C 1 s = 1 = A dπ C s da DSPC SPC LC DPC LE G 20
Propriétés interfaciales des lipides membranaires Mélanges de lipides: π 2 composants immiscibles ou miscibles π A 12 ( N 1 A 1 + N 2 A 2 ) = 0 π A 12 ( N 1 A 1 + N 2 A 2 ) = ΔA EXC π 2 π 1 π 1 N 1 =0 N 1 =1 N 1 =0 N 1 =1 A ΔG π π m = (A 12 N 1 A 1 N 2 A 2 )dπ + RT N 1 ln N 1 + N 2 ln N 2 0 π ΔG excès + A ( ) ΔG m Idéal 21
Propriétés interfaciales des lipides membranaires Mélanges DPC- DSPC (1:1) T m (DPC)= -20 C T m (DSPC) = 55 C C s 1 = A dπ da DSPC DPC LC DSPC DPC Hac- Wydro et al., Colloids Surf. B 2009 22
Propriétés interfaciales des lipides membranaires Mélanges DPC- DSPC (1:1) π ΔG excès π = (A 12 0 N 1 A 1 N 2 A 2 )dπ G exc > 0 DPC DSPC DPC DSPC A 12 ( N 1 A 1 + N 2 A 2 ) 0 DSPC DPC Hac- Wydro et al., Colloids Surf. B 2009 23
Interac6on molécules- membrane SQ- Gem/DPC- DSPC- CHL
Modélisa6on des interac6ons molécule/membrane Analyse du phénomène d adsorp3on- pénétra3on tensiomètre 1 π = γ aq γ m Comportement interfacial de la substance Ciné6que d adsorp6on Tension superficielle d équilibre 2 Comportement interfacial du modèle lipidique Stabilité de la monocouche 3 Interac6on substance- monocouche à pressions ini6ales π i Δπ = π T π i 25
Comportement interfacial des NP de SQ- Gem [SQ-Gem] =3.9 x 10-5 M π = γ H 2 γ 38 mn/m 28.6 mn/m 13 mn/m 40 π (mn/m) 13 mn/m 38.1 mn/m 35 38 mn/m 30 25 38.4 mn/m SQ-Gem NP SQ-Gem molecules 20 15 10 5 0 0 1 2 3 Ambike et al., Langmuir 2011 4 5 6 7 8 Time (h) 9 10 11 12 13 14 15 26
Interac6on des NP avec des monocouches lipidiques [SQ-Gem] =3.9 x 10-5 M 40 π or π (mn/m) 35 30 25 20 15 10 5 Free interface DPC-DSPC-CHL (4.5: 4.3: 1.2) DPC DPC-DSPC (1:1) π i = 30 mn/m π 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Time (h) DPC: dioleoylphosphatidylcholine DSPC: distearoylphosphatidylcholine Ambike et al., Langmuir 2011 27
Comportement de SQ- Gem en mélange avec les lipides Analyse de l interaction de SQ-Gem avec chaque lipide ΔG EXC = π ΔA 0 EXC dπ Pour une monocouche contenant 20% de SQ-Gem, à 30 mn/m: G EXC (DPC) = - 930 J/mol G EXC (DSPC) = - 20 J/mol G EXC (CHL) = + 310 J/mol Interaction défavorable 28
rganisa6on des monocouches mixtes SQ- Gem- lipides DPC-DSPC-SQ Gem GEXC = +223 J/mol LC Interac3on défavorable LE DPC-DSPC GEXC = +75 J/mol DSPC- DPC- CHL DPC-DSPC-CHL-SQ Gem GEXC = - 47 J/mol DSPC- DPC Ambike et al., Langmuir 2011 29
Interac6on non spécifique molécule- membrane Porphyrines/SPC- SPE- SPS- CHL NH N N HN H H H H H H H H H HN NH NH HN H NH HH H H H H H H H H H H H H H Diffusion passive?
Propriétés interfaciales des lipides membranaires Mélange de phospholipides (SPC, SPE, SPS) avec cholestérol M0: 0% Chol CHL: 5 wt% 11 wt% 18 wt% M3, M2, M1 Makky et al., Langmuir 2010a 31
Interac6on des porphyrines /monocouche M3 π i = γ aq γ m Δπ = π T π i π i = 15 mn/m π i > 28mN/m Pression maximale d insertion Makky et al., Langmuir 2010a 32
Interac6on des porphyrines /monocouche M3 Π e = π T = aπ i + b SPC-SPE-SPS-CHL (36/34/12/18) a GDP- TEG = 0,59 a DP = 0,69 a GDP- DEG = 0,72 Calvez, Langmuir 2011 GDP- DEG > DP > GDP- TEG 33
Interac6on spécifique molécule- membrane Porphyrines/SPC- SPE- SPS- CHL- Con A Reconnaissance moléculaire
Interac6on spécifique porphyrines- Concanavaline A QCM- D Δm = C n Δf SAUERBREY Δf (Hz) 0-50 -100-150 -200 R: rinçage R R DP R GDP- DEG R GDP- TEG 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Time (min) Makky et al., Langmuir 2010b 35
QCM- D Interac6on porphyrine/bicouche- Con A Con A Si 2 Δf (Hz) 0-20 -40-60 -80-100 -120 GDP- DEG GDP- TEG R R 0 20 40 60 80 100 Time (min) DP R R Makky et al., BBA 2011 36
QCM- D Interac6on porphyrines/cellules Y79 Modifica6on de surface Dépôt cellulaire Poly- lysine R DP f (Hz) GDP- TEG GDP- DEG GDP- TEG GDP- TEG Temps (min) Makky et al., BBA 2012 37
Conclusion endocytose Diffusion passive SQ-Gem/ DPC-DSPC-CHL (Diffusion passive) Reconnaissance moléculaire endocytose Porphyrines/ SPC-SPE-SPS-CHL Bildstein et al, So? Ma@er, 2010 38
Remerciements SQ-Gem P. Couvreur et S. Lepêtre-Mouelhi A. Ambike et B. Stella Porphyrines glycoconjuguées P. Maillard, J.P Michel A. Makky, K. Daghildjian et S. Ballut 39