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La plate-forme Biopuces et Séquençage de Strasbourg est équipée des technologies Affymetrix et Agilent pour l étude du transcriptome et du génome sur puces à ADN. SOMMAIRE ANALYSE TRANSCRIPTIONNELLE... 3 ANALYSE TRANSCRIPTIONNELLE SUR PUCE 3 EUCARYOTE AFFYMETRIX... 4 ANALYSE TRANSCRIPTIONNELLE SUR PUCE EXON 1.0 ST AFFYMETRIX... 7 ANALYSE TRANSCRIPTIONNELLE SUR PUCE GENE 1.0 ST AFFYMETRIX... 10 ANALYSE DES VARIATIONS DE L ADN GENOMIQUE... 13 GENOTYPAGE DE SNP SUR PUCE AFFYMETRIX... 14 HYBRIDATION GENOMIQUE COMPARATIVE (CGH) SUR PUCE AGILENT... 17 ANALYSE DES SITES DE LIAISON DE PROTEINES REGULATRICES SUR L ADN... 20 ANALYSE DES PRODUITS D'IMMUNOPRECIPITATION CHROMATINIENNE SUR PUCE AGILENT (ChIP-on-Chip)... 21 CONTACT Plate-forme Biopuces et Séquençage de Strasbourg IGBMC 1 rue Laurent Fries 67404 ILLKIRCH Cedex Dr Philippe Kastner Tél: 03.88.65.34.72 Email: kastner@igbmc.fr www-microarrays.u-strasbg.fr 2/23
ANALYSE TRANSCRIPTIONNELLE PRESTATIONS STANDARD Pour l étude de l expression génique, notre plate-forme propose un service pour l ensemble des solutions clé en main de la Société Affymetrix. Trois lignes de produits sont actuellement disponibles : Les puces «3» eucaryotes Affymetrix : Ces puces pan-génomiques constituent la première génération des puces d expression Affymetrix et sont disponibles pour une trentaine d espèces différentes. Elles contiennent des oligonucléotides de 25-mer qui interrogent la région 3 des transcrits, proche de la queue poly A (~600 bases). Les puces «Exon» Affymetrix : Ces puces, commercialisées depuis fin 2005 ont une densité 5 fois supérieure aux puces «3». Elles permettent d explorer simultanément l expression génique et les patterns d épissage alternatif à l échelle du génome sur une seule puce. Elles interrogent plus d un million d exons dans les régions transcrites connues, mais aussi prédites. Affymetrix propose des puces «Exon» pour l homme, le rat et la souris uniquement. Les puces «Gene» Affymetrix: Dernières nées des puces d expression Affymetrix, ces puces sont destinées à mesurer l activité transcriptionnelle totale des gènes les mieux annotés chez l homme, la souris ou le rat en utilisant des oligonucléotides distribués sur toute la longueur des transcrits. De part leur prix attractif, elles représentent un outil avantageux pour les nouveaux utilisateurs de puces à ADN ou pour ceux souhaitant augmenter le nombre de réplicats biologiques dans leurs expériences. PRESTATIONS A LA CARTE En complément de ces prestations standard et pour répondre à des besoins spécifiques, nous pouvons adapter les protocoles existants ou réaliser des projets en utilisant d autres technologies. Ainsi par le passé, nous avons conduit des analyses transcriptionnelles sur des puces procaryotes à façon Affymetrix, sur des puces d expression de la Société Agilent ou sur des puces à oligonucléotides spottées sur lames de verre. Nous collaborons également fréquemment avec des équipes de recherche pour développer de nouvelles applications. Les produits en cours d évaluation actuellement sur notre plate-forme concernent l analyse des mirna sur puces Agilent. 3/23
ANALYSE TRANSCRIPTIONNELLE SUR PUCE 3 EUCARYOTE AFFYMETRIX Les puces «3» eucaryotes Affymetrix utilisent des ARNc biotinylés comme sonde dans une hybridation à une couleur où chaque échantillon à comparer est hybridé sur une puce distincte. Notre plate-forme prend en charge l ensemble des étapes depuis la validation des ARN totaux jusqu à l extraction des données d expression des images de puces. 1. GENECHIP 3 EXPRESSION ARRAYS Sur ces puces à haute densité, chaque transcrit est interrogé par un set de 11 à 16 paires d oligonucléotides distinctes. Les oligonucléotides d une longueur de 25-mer sont dirigés préférentiellement contre la région 3 des messagers, proche de la queue polya. Chaque paire d oligonucléotides est constituée d un oligonucléotide «perfect match» complémentaire à la séquence d intérêt et d un oligonucléotide «mismatch» identique au «perfect match» correspondant, à l exception de la base centrale qui a été mutée. L oligonucléotide «mismatch» sert à détecter et éliminer le signal non spécifique. Le tableau ci-dessous résume les caractéristiques générales de quelques unes des puces Affymetrix utilisées par la plate-forme à ce jour. Pour une liste exhaustive des puces ou pour de plus amples informations, veuillez consulter le site web www.affymetrix.com GeneChip Arrays Human Genome U133 Plus 2.0 Array Mouse Genome 430 2.0 Array Rat Genome 230 2.0 Array Arabidopsis ATH1 Genome Array Drosophila Genome 2.0 Array Conditionnement 2, 6, 30 2, 6, 30 2, 6, 30 5, 30 2, 6, 30 Nombre de transcrits interrogés ~47400 ~39000 ~30000 ~24000 ~18500 Nombre de gènes interrogés ~38500 ~34000 ~28000 n/a n/a Nombre de sets d oligonucléotides >54000 >45000 >31000 >22500 18880 Source principale des séquences Paires d oligonucléotide/ transcrit interrogé GenBank, dbest, RefSeq, UniGene Database Build133, 04/2001 GenBank, dbest, RefSeq, UniGene Database Build107, 06/2002 GenBank, dbest, RefSeq, UniGene Database Build99, 06/2002 TIGR-ATH1 Data base, 12/2001 D. melanogaster genome Release 3.1 de FlyBase et BDGP 11 11 11 11 14 4/23
2. SERVICES PROPOSES Quantification et validation des ARN totaux par spectrophotométrie et électrophorèse capillaire Synthèse d ARNc biotinylés Hybridation, lavage et scanning des puces Extraction des données, normalisation et calcul du signal avec les algorithmes statistiques d Affymetrix (version MAS 5.0) et/ou les algorithmes Robust Multiarray Average (RMA) à l aide du logiciel «Expression Console» d Affymetrix L analyse des transcrits différentiellement exprimés entre groupes expérimentaux qui requiert l utilisation d outils additionnels n est pas prise en charge dans la prestation standard. Elle peut néanmoins être réalisée sous la forme de collaboration avec des membres des plate-formes ou des équipes de recherche de l IGBMC. 3. ECHANTILLONS DE DEPART Le succès final de l expérience est étroitement lié à la qualité des échantillons d ARN totaux de départ. Un soin tout particulier doit être pris pour éviter toute trace de contamination (phénol, DEPC, ADN génomique ) ou de dégradation. Quantité Concentration Caractéristiques des ARN totaux à fournir Quantité optimale : 600 à 1000 ng Quantité minimale : 20 à 50 ng 50-100 ng/ul DO260/DO280 1,8 Qualité Réplicats biologiques Conditions d envoi Absence de signe de dégradation sur un gel d agarose ou Ratio 28S/18S 1,6 et/ou RIN 6 sur un profil du Bioanalyzer d Agilent Nombre recommandé : 5 Nombre minimal : 3 En solution dans de l eau sur de la carboglace Les tubes doivent être bien identifiés et accompagnés d une fiche descriptive avec la concentration et le volume total de chaque ARN 5/23
4. CONTROLES QUALITE Qualité des ARNc synthétisés Rendement Taille moyenne Ratio des intensités 3 /5 des gènes contrôles (actine, GAPDH ) 30 µg à partir de 250 ng d ARN total 1000-1500 nt 3-4 Qualité des hybridations ARNc procaryote BioB (0.75 pm) ARNc procaryotes BioC (2.5 pm), BioD (12.5 pm), Cre (50 pm) «Présent» dans 50% des échantillons «Présent» dans 100% des échantillons Bruit de fond moyen 150 bruit (variation de pixel à pixel) 4 Pourcentage de gènes détectés Intensité globale des puces 20-30% et ne variant pas plus de 10 à 15% entre des échantillons biologiques équivalents ne variant pas plus de 2 à 3 fois entre des échantillons biologiques équivalents 5. LIVRAISON DES RESULTATS A la fin de son projet, le client reçoit sous forme électronique (sur DVD) : Une copie de l ensemble des données brutes Affymetrix (fichiers.xml,.dat,.cel,.chp) Une copie des données d expression (fichier.chp) au format Excel Un document résumant l ensemble des contrôles qualité effectués lors du projet 6/23
ANALYSE TRANSCRIPTIONNELLE SUR PUCE EXON 1.0 ST AFFYMETRIX Les puces «Exon» Affymetrix utilisent des ADNc simple brin biotinylés comme sonde dans une hybridation à une couleur où chaque échantillon à comparer est hybridé sur une puce distincte. Notre plate-forme prend en charge l ensemble des étapes depuis la validation des ARN totaux jusqu à l extraction des données d expression avec les outils Affymetrix. 1. GENECHIP EXON 1.0 ST ARRAYS Ces puces qui contiennent de 4 à 5.5 millions d oligonucléotides, permettent de mesurer le niveau d expression non seulement des transcrits mais aussi des exons individuellement. La plupart des exons d une taille > 25 pb sont représentés sur la puce par au moins une probe set. Les probe sets sont constituées de 4 oligonucléotides «perfect match» de 25- mer en moyenne, pour un total de >30 oligonucléotides pour la majorité des transcrits. Les sondes ont été conçues à partir de séquences génomiques. Elles sont annotées avec leurs coordonnées génomiques et leur appartenance aux transcrits et exons connus ou prédits. Les probe sets ont été classifiées en fonction du niveau de confiance de leur annotation (Core set : sondes basées sur les séquences d ADNc, Extended set : Core set + sondes basées sur les séquences d EST, Full set : Extended set + sondes basées sur les séquences prédites). Les utilisateurs peuvent aisément choisir d analyser leurs données à l un ou l autre des 3 degrés d annotation des probe sets, au niveau des transcrits et/ou des exons. Le tableau ci-dessous résume les caractéristiques générales des puces «Exon» Affymetrix. Pour de plus amples informations, veuillez consulter le site web www.affymetrix.com GeneChip Arrays Human Exon 1.0 ST array Mouse Exon 1.0 ST array Rat Exon 1.0 ST array Conditionnement 2, 6, 30 2, 6, 30 2, 6, 30 Nombre total de probe sets 1.4 million 1.2 million 1.0 million Nombre total d exon clusters Nombre total de transcrit clusters Source principale des séquences >1 million ~1 million ~ 850,000 >150 000 >80 000 >73 000 Juillet 2003 (GenBank, dbest, RefSeq, UCSC genome synteny maps, Ensembl, GENSCAN ) Mai 2004 (GenBank, dbest, RefSeq, UCSC genome synteny maps, Ensembl, GENSCAN ) Juin 2003 (GenBank, dbest, RefSeq, UCSC genome synteny maps, Ensembl, GENSCAN ) 7/23
2. SERVICES PROPOSES Quantification et validation des ARN totaux par spectrophotométrie et électrophorèse capillaire Synthèse d ADNc biotinylés Hybridation, lavage et scanning des puces Extraction des données, normalisation et calcul du signal avec les algorithmes Robust Multiarray Average (RMA) pour les sondes du Core set au niveau des transcrits et des exons, à l aide du logiciel «Expression Console» d Affymetrix L analyse des transcrits ou des exons différentiellement exprimés entre groupes expérimentaux qui requiert l utilisation d outils commerciaux additionnels tels que Array Assist de Stratagene, Xray de Biotics System ou Genomic suite de Partek, n est pas prise en charge dans la prestation standard. Elle peut néanmoins être réalisée sous la forme de collaboration avec des membres des plate-formes ou des équipes de recherche de l IGBMC. 3. ECHANTILLONS DE DEPART Le succès final de l expérience est étroitement lié à la qualité des échantillons d ARN totaux de départ. Un soin tout particulier doit être pris pour éviter toute trace de contamination (phénol, DEPC, ADN génomique ) ou de dégradation. Quantité Concentration Caractéristiques des ARN totaux à fournir Quantité optimale : 5 à 7 μg Quantité minimale : 1 à 2 μg 600 ng/μl DO260/DO280 1,8 Qualité Réplicats biologiques Conditions d envoi Absence de signe de dégradation sur un gel d agarose ou Ratio 28S/18S 1,6 et/ou RIN 6 sur un profil du Bioanalyzer d Agilent Nombre recommandé : 5 Nombre minimal : 3 En solution dans de l eau sur de la carboglace Les tubes doivent être bien identifiés et accompagnés d une fiche descriptive avec la concentration et le volume total de chaque ARN 8/23
4. CONTROLES QUALITE Qualité des sondes synthétisées Rendement de la synthèse d ARNc Taille moyenne des ARNc Rendement de la synthèse d ADNc simple brin 20 μg à partir de 2 μg d ARN total 1000-1500 nt 5.5 μg à partir de 8 à 10 μg d ARNc Qualité des hybridations Intensités des sondes bactériennes contrôles poly-adénylées ajoutées aux Ilys<Iphe<Ithr<Idap échantillons avant synthèse Intensités des sondes procaryotes contrôles ajoutées aux échantillons IBioB< IBioC<IBioD<ICre avant hybridation Pos vs Neg auc 0.80 Pourcentage de gènes détectés 20-30% et ne variant pas plus de 10 à 15% entre des échantillons biologiques équivalents 5. LIVRAISON DES RESULTATS A la fin de son projet, le client reçoit sous forme électronique (sur DVD) : une copie des données brutes Affymetrix à l exception des fichiers DAT (fichiers.xml,.cel,.chp) Une copie des résultats d expression au format.txt Un document résumant l ensemble des contrôles qualités effectués lors du projet. 9/23
ANALYSE TRANSCRIPTIONNELLE SUR PUCE GENE 1.0 ST AFFYMETRIX Les puces «Gene» Affymetrix utilisent des ADNc simple brin biotinylés comme sonde dans une hybridation à une couleur où chaque échantillon à comparer est hybridé sur une puce distincte. Notre plate-forme prend en charge l ensemble des étapes depuis la validation des ARN totaux jusqu à l extraction des données d expression. 1. GENECHIP GENE 1.0 ST ARRAYS Les puces «Gene» bénéficient d un design simplifié utilisant les informations de séquences génomiques les plus récentes. Chaque gène est interrogé par un seul set de 26 oligonucléotides «perfect-match» en moyenne. Ces oligonucléotides de 25-mer sont distribués sur toute la longueur du locus génomique. Lors de l analyse, leurs signaux sont compilés en une seule valeur représentant tous les transcrits d un même gène. Le tableau ci-dessous résume les caractéristiques générales des puces «Gene» Affymetrix. Pour de plus amples informations, veuillez consulter le site web www.affymetrix.com GeneChip Arrays Human Gene 1.0 ST array Mouse Gene 1.0 ST array Rat Gene 1.0 ST array Conditionnement 2, 6, 30 2, 6, 30 2, 6, 30 Nombre total d oligonucléotides 764885 770317 772254 Nombre de gènes interrogés ~28869 ~28853 ~27342 Assemblage du génome Mars 2006 (UCSC Hg18 ; NCBI build 36 Fev. 2006 (UCSC mm8 ; NCBI build 36 Nov. 2004 (UCSC rn4 ; Baylor HGSC build 3.4 2. SERVICES PROPOSES Quantification et validation des ARN totaux par spectrophotométrie et électrophorèse capillaire Synthèse d ADNc biotinylés Hybridation, lavage et scanning des puces Extraction des données, normalisation et calcul du signal avec les algorithmes Robust Multiarray Average (RMA) à l aide du logiciel «Expression Console» d Affymetrix L analyse des transcrits différentiellement exprimés entre groupes expérimentaux qui requiert l utilisation d outils additionnels n est pas prise en charge dans la prestation standard. Elle peut néanmoins être réalisée sous la forme de collaboration avec des membres des plate-formes ou des équipes de recherche de l IGBMC. 10/23
3. ECHANTILLONS DE DEPART Le succès final de l expérience est étroitement lié à la qualité des échantillons d ARN totaux de départ. Un soin tout particulier doit être pris pour éviter toute trace de contamination (phénol, DEPC, ADN génomique ) ou de dégradation. Quantité Concentration Caractéristiques des ARN totaux à fournir Quantité optimale : 600 à 1000 ng Quantité minimale : 100 à 250 ng 50 ng/μl DO260/DO280 1,8 Qualité Réplicats biologiques Conditions d envoi Absence de signe de dégradation sur un gel d agarose ou Ratio 28S/18S 1,6 et/ou RIN 6 sur un profil du Bioanalyzer d Agilent Nombre recommandé : 5 Nombre minimal : 3 En solution dans de l eau sur de la carboglace Les tubes doivent être bien identifiés et accompagnés d une fiche descriptive avec la concentration et le volume total de chaque ARN 4. CONTROLES QUALITE Qualité des sondes synthétisées Rendement de la synthèse d ARNc Taille moyenne des ARNc Rendement de la synthèse d ADNc simple brin 20 μg à partir de 100-300 ng d ARN total 1000-1500 nt 5.5 μg à partir de 8 à 10 μg d ARNc 11/23
Intensités des sondes bactériennes contrôles polyadénylées ajoutées aux échantillons avant synthèse Intensités des sondes procaryotes contrôles ajoutées aux échantillons avant hybridation Qualité des hybridations Pos vs Neg auc 0.80 [all probe set rle mean]max [all probe set rle mean]min All probeset mad-residual mean 0.65 Ilys<Iphe<Ithr<Idap IBioB< IBioC<IBioD<ICre 0.3 entre des échantillons biologiques équivalents 5. LIVRAISON DES RESULTATS A la fin de son projet, le client reçoit sous forme électronique (sur DVD) : une copie de l ensemble des données brutes Affymetrix (fichiers.xml,.dat,.cel,.chp) Une copie des résultats d expression au format Excel Un document résumant l ensemble des contrôles qualités effectués lors du projet. 12/23
ANALYSE DES VARIATIONS DE L ADN GENOMIQUE PRESTATIONS STANDARD Notre plate-forme propose deux types de technologies distinctes pour l analyse des variations de l ADN génomique : les puces de cartographie (ou puce SNP) de la Société Affymetrix et les puces à hybridation génomique comparative (CGH) de la Société Agilent. Les puces de Cartographie Affymetrix: Leur application première est le génotypage des polymorphismes à simple nucléotide (SNP). Cependant, à haute densité, elles peuvent être simultanément mises à profit pour cartographier les gains et les pertes de régions chromosomiques. Les GeneChip Mapping 10K 2.0 et 100K Array sets ont été abondamment mis à profit pour des études de liaison et d association, néanmoins, Affymetrix recommande l utilisation du plus récent «GeneChip Mapping 500K Array Set pour ces applications. De même, si les GeneChip Mapping 100K et 500K Array sets ont été utilisés avec succès pour les analyses de variation du nombre de copies, Affymetrix préconise l utilisation de leur nouvelle puce «Genome-Wide Human SNP Array 6.0» (ci-dessous) pour cette application. Les puces CGH Agilent: Elles sont destinées à mesurer les pertes et les gains de chromosomes ou de régions sub-chromosomiques. Elles contiennent des oligonucléotides de 50- à 60-mer localisés à des positions connues du génome dans les régions codantes et non codantes. Les puces sont disponibles en 3 formats qui se distinguent respectivement, par le nombre d oligonucléotides synthétisés par array (44 000, 105 000 ou 244 000) et le nombre d arrays par lame (4, 2 ou 1). PRESTATIONS A LA CARTE En complément de ces prestations standard, nous pouvons effectuer des prestations à la carte afin de fournir les outils les mieux adaptés à vos recherches. A titre d exemple, par le passé, nous avons réalisé des analyses de variation du nombre de copie des gènes chez la levure, sur des puces d expression Affymetrix et sur des puces CGH à façon Agilent. Depuis mi-2008, Affymetrix commercialise une nouvelle puce contenant plus de 1,8 million de marqueurs dont 906,600 SNPs et 946,000 sondes non polymorphiques («Genome- Wide Human SNP Array 6.0»). le personnel de notre plate-forme a été formé par Affymetrix pour l utilisation de ces puces et peut d ores et déjà réaliser des projets de génotypage et d analyse de variation du nombre de copies sur ces microarrays. 13/23
GENOTYPAGE DE SNP SUR PUCE MAPPING AFFYMETRIX La préparation des sondes à hybrider sur puce de cartographie fait intervenir une réduction de la complexité du génome via une digestion de l ADN génomique par une ou plusieurs enzymes de restriction, suivie d une amplification des fragments obtenus par PCR. Chaque échantillon d ADN à analyser est ensuite hybridé sur une puce distincte après fragmentation et marquage terminal à la biotine. Notre plate-forme prend en charge l ensemble des étapes depuis la validation des ADN génomiques de départ jusqu'à l extraction des données d hybridation. 1. GENECHIP MAPPING ARRAYS Sur les puces de cartographie, chaque SNP est interrogé par un set de 12 à 20 paires d oligonucléotides de 25-mer distinctes. Une paire est constituée d un oligonucléotide «perfect match» (PM) complémentaire à la séquence d intérêt et d un oligonucléotide «mismatch» (MM) identique au PM correspondant, à l exception de la base centrale qui a été mutée. L oligonucléotide MM est utilisé pour détecter et éliminer le signal non spécifique. Les 24 ou 40 oligonucléotides sont organisés en quartets interrogeant les deux allèles possibles sur l un des deux brins d ADN ou sur les deux. Le tableau ci-dessous résume les caractéristiques générales des puces de génotypage utilisées par notre plate-forme à ce jour. Pour de plus amples informations, veuillez consulter le site web www.affymetrix.com Human Mapping Arrays Nb de puces Nb de SNPs interrogés Distance intermarqueur moyenne Hétérozygosité moyenne Mapping 10K 2.0 array 1 10200 258 kb 0.38 Mapping 100K set 2 x 50K* 116000 23.6 kb 0.30 Mapping 500K set 2 x 250K* 500568 5.8 kb 0.30 *Chaque puce du set peut être utilisée individuellement 2. SERVICES PROPOSES Quantification et validation des ADN génomiques par spectrophotométrie et électrophorèse sur gel d agarose Préparation des sondes d ADN biotinylées à partir d ADN génomique Hybridation, lavage et scanning des puces Extraction des données d hybridation avec les outils Affymetrix, «GeneChip Genotyping Analysis Software» (GTYPE) pour les puces 10K et «Genotyping Console» (GTC) pour les puces 50 et 250K. 14/23
3. ECHANTILLONS DE DEPART Caractéristiques des ADN génomiques à fournir Sang Sources validées par Affymetrix Méthodes d extraction validées par Affymetrix Quantité Concentration Qualité Conditions d envoi Lignées cellulaires Cellules dérivées de la muqueuse buccale Digestion SDS/Protéinase K, extraction phénol/chloroforme, ultra-purification et concentration sur microcon ou centricon (Millipore) QIAamp DNA Blood Maxi kit de Qiagen Quantité optimale : 1 µg Quantité minimale : 300 ng (par puce) 50-100 ng/μl DO260/DO280 1,8 Absence de signe de dégradation sur un gel d agarose Affymetrix recommande une étape de nettoyage de tout ADN suspecté de contenir des contaminants par précipitation à l éthanol En solution dans du tampon TE réduit (0.1 mm EDTA ph 8.0, 10 mm Tris-HCl ph 8.0) ou en solution dans l eau Les tubes doivent être bien identifiés et accompagnés d une fiche descriptive avec la concentration et le volume total de chaque ADN 4. CONTROLES QUALITE Qualité des sondes d ADN marquées Rendement de la PCR 20 μg pour les puces 10K et 50K Taille des amplicons 90 μg pour les puces 250K 250-1000 nt pour les puces 10K 200-2000 nt pour les puces 50K Contrôles négatifs (sans ADN) effectués lors des étapes de digestion/ligation (T DL ) et de PCR (T PCR ) 200-1100 nt pour les puces 250K Absence de contaminant sur gel d agarose 15/23
Qualité des hybridations 4 oligonucléotides contrôles Affymetrix (2.5 à 7.5 pm) ajoutés avant hybridation Pourcentage de SNP génotypés «SNP calls rate» détectés dans tous les échantillons 92 pour la puce 10K 95 pour les puces 50K 93 pour les puces 250K 5. LIVRAISON DES RESULTATS : A la fin de son projet, le client reçoit sous forme électronique (sur DVD) : Une copie des données brutes Affymetrix (fichiers.xml,.cel,.chp et.cn) Une copie des résultats de génotypage et/ou de variation du nombre de copie au format.txt (fichier.chp,.cn) Un document résumant l ensemble des contrôles qualité effectués lors du projet 16/23
HYBRIDATION GENOMIQUE COMPARATIVE (CGH) SUR PUCE AGILENT Cette application mesure les variations du nombre de copies d ADN entre deux échantillons en utilisant un processus d hybridation à 2 couleurs. Pour chaque couple d ADN à analyser sur une même puce, l échantillon de référence et l échantillon expérimental sont marqués avec deux fluorochromes distincts. Le choix de la polarité du marquage est à définir lors du design de l expérience. La préparation des sondes fait intervenir une digestion des ADN génomiques par deux enzymes de restriction suivie d un marquage des fragments obtenus par amorçage aléatoire (random priming). Notre plateforme se propose de prendre en charge l ensemble des étapes depuis la validation des ADN génomiques de départ jusqu à l obtention des données normalisées. Une concertation préalable avec le personnel de la plate-forme concernant le design expérimental est hautement conseillée pour chaque projet traité. 1. OLIGO acgh MICRORRAYS La Société Agilent distribue des puces CGH de densité variable pour l homme, la souris et le rat. Elles contiennent des oligonucléotides de 50- à 60-mer synthétisés in situ par la technologie Inkjet SurePrint TM. Contrairement aux puces d expression génique, les oligonucléotides pour la CGH ne sont pas confinés à la région 3 des séquences exprimées mais peuvent aussi être localisés dans les régions introniques et intergéniques. Néanmoins, la sélection des sondes a été biaisée vers les gènes. Une attention particulière a été mise sur les gènes les mieux caractérisés, les promoteurs, les mirnas et les régions télomériques. Le tableau ci-dessous résume les caractéristiques générales des puces CGH humaines Agilent. Pour une liste exhaustive des puces ou pour de plus amples informations, veuillez consulter le site web www.chem.agilent.com CGH Arrays Human Genome CGH 244A Human Genome CGH 105A Human Genome CGH 44K Nb d arrays par lame Nb de séquences représentées Distance inter-oligo médiane 1 x 244K 236000 8.9 kb 2 x 105K 99000 21.7 kb 4 x 44K 43000 43.0 kb Assemblage du génome Mars 2006 (UCSC Hg18 ; NCBI build 36) Mars 2006 (UCSC Hg18 ; NCBI build 36) Mars 2006 (UCSC Hg18 ; NCBI build 36) 17/23
2. SERVICES PROPOSES Quantification et validation des ADN génomiques par spectrophotométrie et électrophorèse sur gel d agarose Marquage fluorescent des ADN génomiques Hybridation, lavage et scanning des puces Extraction et normalisation des données avec le logiciel «Feature Extraction» d Agilent Normalisation additionnelle avec un outil développé par notre plate-forme. L analyse des variations du nombre de copies d ADN par le logiciel «CGH Analytics» d Agilent ou par un outil équivalent n est pas prise en charge dans la prestation standard. Elle peut néanmoins être réalisée sous la forme de collaboration avec des membres des plate-formes ou des équipes de recherche de l IGBMC. 3. ECHANTILLONS DE DEPART Caractéristiques des ADN génomiques à fournir Lignées cellulaires Source validées par Agilent Tissus congelés Méthodes d extraction validées par Agilent Quantité Concentration DNeasy Blood and Tissue kit de Qiagen Quantité optimale : 3 µg Quantité minimale : 1.5 µg 200 ng/μl DO260/DO280 1,8 Qualité Conditions d envoi Absence de signe de dégradation sur un gel d agarose En solution dans de l eau Les tubes doivent être bien identifiés et accompagnés d une fiche descriptive avec la concentration et le volume total de chaque ADN 18/23
4. CONTROLES QUALITE Qualité des sondes d ADN marquées Taille des fragments de restriction 200 à 500 pb Rendement du marquage 5 μg >25 pmol/μg pour le marquage Cy3 Activité spécifique des sondes >20 pmol/μg pour le marquage Cy5 Qualité des hybridations Valeur du «derivative of log ratio» (DLR) 0.2 spread 5. LIVRAISON DES RESULTATS A la fin de son projet, le client reçoit un e-mail expliquant la démarche à suivre pour récupérer les données, téléchargeables sur le site FTP de notre plate-forme, et contenant des informations sur l analyse effectuée. Les données disponibles comprennent : Une copie de l ensemble des données brutes et normalisées issues de «Feature Extraction» au format.txt Une copie du fichier «Grid template» au format.xml décrivant l organisation des sondes sur la puce (nécessaire pour l analyse des données sur CGH analytics) Une copie du QC report généré par «Feature Extraction» au format.pdf 19/23
ANALYSE DES SITES DE LIAISON DE PROTEINES REGULATRICES SUR L ADN PRESTATIONS STANDARD La technologie que nous avons mise en œuvre pour l étude des sites de liaison de protéines telles que les facteurs de transcription, les histones ou les polymérases sur un génome cible est la technologie ChIP-on-Chip d Agilent. Cette Société propose des microarrays couvrant soit les génomes dans leur ensemble, soit uniquement les régions promotrices des gènes. Elle offre également un service en ligne (e-array) pour le design de puces à façon permettant de cibler les régions d intérêt à interroger. PRESTATIONS A LA CARTE Le récent développement du séquençage haut débit offre une nouvelle alternative pour l étude des sites de liaison de protéines régulatrices sur l ADN via la technique de ChIP- Seq. La plate-forme a récemment acquis le Système Genome Analyzer II de la Société Illumina et peut prendre en charge dès à présent vos projets de séquençage sur simple demande. 20/23
ANALYSE DES PRODUITS D'IMMUNOPRECIPITATION CHROMATINIENNE SUR PUCE AGILENT (ChIP-on-Chip) Le principe de cette application est de comparer via un processus d hybridation à 2 couleurs un couple d échantillons constitué d ADN génomique issu de chromatine immunoprécipitée avec un anticorps dirigé contre une protéine d intérêt et d ADN génomique contrôle, par exemple issu de chromatine totale (input). Pour chaque couple d échantillon à analyser sur une même puce, l IP (chromatine immuno-précipitée avec l anticorps) est marqué à la Cyanine 5 (Cy5) tandis que le contrôle est marqué avec la Cyanine 3 (Cy3). La préparation des échantillons à hybrider comprend de multiples étapes dont plusieurs sont à la charge du porteur du projet. En effet, la plate-forme ne prend en charge les échantillons qu après immunoprécipitation et amplification des fragments d ADN. Le porteur du projet doit donc effectuer la fixation des complexes protéine-adn in vivo, la lyse des cellules et la fragmentation de l ADN, l immunoprécipitation des complexes protéine- ADN avec l anticorps de son choix et l amplification de l ADN immunoprécipité. Un protocole de référence est disponible sur le site web www.chem.agilent.com. 1. CHIP-ON-CHIP MICROARRAYS Les puces ChIP-on-chip de la Société Agilent sont composées d oligonucléotides de 60- mer, espacés de ~100-300 pb dans les régions d intérêt couvrant des séquences codantes et non-codantes. Les formats disponibles incluent des puces pan-génomiques ou des puces dédiées interrogeant les régions promotrices des gènes. Le tableau ci-dessous résume les caractéristiques générales des puces promoteurs humaines et murines Agilent utilisées par la plate-forme. Pour une liste exhaustive des puces ou pour de plus amples informations, veuillez consulter le site web www.chem.agilent.com ChIP- on-chip Arrays Nb de lames par array Nb de transcrits représentés Région interrogée autour du site d initiation de la transcription Human Promoter set 2 x 244K ~ 17000-5.5 kb à + 2.5 kb Mouse Promoter set 2 x 244K ~ 17000-5.5 kb à + 2.5 kb Assemblage du génome Mars 2006 (UCSC Hg18 ; NCBI build 36.1) Février 2006 (UCSC mm8 ; NCBI build 36) 21/23