Livret de TP Méthodes Licence Sciences de la Vie et de la Santé

Livret de TP Méthodes Licence Sciences de la Vie et de la Santé

LIVRET DE TRAVAUX PRATIQUES - METHODES TABLE DES MATIERES Bonnes pratiques de laboratoire...3 Verrerie et matériel pour la mesure de volumes...4 Pipetman...5 Dilutions simples - Dilutions en série...6 Autres expressions courantes pour les solutions...7 Préparation de solution tampon...8 Utilisation du ph-mètre... Spectrophotomètre...0 Spectrophotométrie pratique... Electrophorèse...2 Utilisation du microscope optique (= photonique)...3 Recommandations pour les dessins d observation...4 Notes personnelles...6 2

BONNES PRATIQUES DE LABORATOIRE - Mettre sa blouse - elle protège des produits toxiques, corrosifs - l enseignant est responsable en cas d accident aggravé par l absence de blouse Aucun étudiant ne peut-être accepté sans blouse en salle de TP - Organiser son plan de travail : - laisser un espace sans feuille ni crayon pour pouvoir manipuler librement. - Organiser son travail : - Lire le protocole avant de venir en TP - Dans le cas de TP en binôme, répartir le travail équitablement entre les 2 personnes - Noter et respecter les consignes de sécurité (travail sous hotte chimique, port de lunettes ou de gants de protection) mettre les déchets toxiques dans les poubelles prévues à cet effet). Lire les étiquettes des produits et connaître les symboles de toxicité : Anciens pictogrammes (totalement remplacés au plus tard le er juin 205) Nouveaux pictogrammes (depuis le 20 janvier 200) 3

VERRERIE ET MATERIEL POUR LA MESURE DE VOLUMES Pour une mesure exacte, choisir l instrument de plus petit volume qui permet de prélever la quantité souhaitée en une seule fois. Exemples : pour prélever 3 ml, utiliser une pipette de 5 ml, et non pas 3 fois une pipette de ml, cela multiplie par 3 l'erreur. Pour prélever 250 µl, utiliser le pipetman de 000 µl ou P000. Eprouvettes : 25 ml, 50 ml, 00 ml, 250 ml, 500 ml, L. Lire le volume à la base du ménisque Pipettes : 2 ml ; 5mL ; 0 ml ; 25 ml, en verre ou en plastique. Prélever à l aide d une propipette (ou poire d'aspiration) Vider l air bille haut Aspirer bille centrale Vider la solution bille latérale Tenir toujours la pipette vers le bas (pour Tenir toujours la pipette vers le bas (pour éviter la remontée des produits dans la poire éviter d'aspiration) la remont ée des produits dans la propipette ). En cas de probl ème avec la «poire» En cas de problème de fonctionnement, NE NE PAS PAS FORCER. FORCER. Demander Demander à à l'enseignant l enseignant de replacer de replacer les billes. les billes. Vider la poire (bille du haut) Plonger la pointe de la pipette à 2 cm dans le liquide à prélever. Aspirer au moins le volume souhaité (bille centrale). En cas d'excès, sortir la pointe de la pipette du liquide, l'appliquer sur la paroi et ajuster le volume en pressant doucement la bille latérale. Le volume est lu en tenant la pipette verticale, et en plaçant le ménisque à hauteur des yeux. Délivrer le volume en appliquant la pointe de pipette sur la paroi du récipient (bille latérale). A la fin, une goutte reste toujours dans la pipette. C EST NORMAL et comptabilisé dans le volume prédéfini. Ne pas chercher à l évacuer. Micropipettes ou "pipetmans" : 20 µl, 200 µl, 000 µl. Voir fiche spécifique AUTRES ELEMENTS DE VERRERIE COURANTE Béchers : de 25 ml à 2 L. La graduation de ces récipients est approximative. Ils ne sont pas adaptés pour mesurer un volume précis de solution. On les emploie pour faire des mélanges (avec agitateur magnétique), des mesures (ph-mètre). Erlenmeyers : de 50 ml à 4 L. La graduation de ces récipients est approximative. On les emploie pour les incubations de cultures sous agitation. 4

PIPETMAN La micropipette, ou pipetman, permet de délivrer de façon reproductible des microvolumes. Elle renferme un mécanisme à piston très sensible à la corrosion. Elle doit toujours être tenue verticalement afin de ne pas faire entrer de liquide dedans. Il existe différents modèles dont les plus courants sont : Modèle Cône adapté Gamme de volumes P20 P200 P000 Jaune Jaune Bleu -20 µl 20-200 µl 00 µl à ml (000 µl) Utilisation Ajuster le volume désiré avec la molette de réglage Exemples d'affichage du volume P20 P200 P000 0 2 5 2,5 µl 4 7 47 µl 0 3 8 380 µl Placer le corps dans la paume de la main de façon à pouvoir presser le piston avec le pouce. Placer à l'extrémité du pipetman un cône à usage unique adapté au modèle de pipetman (ne pas toucher l'extrémité avec les doigts) Presser le piston jusqu'à la première butée Plonger le cône de quelques mm dans le liquide à prélever Relâcher doucement le piston de façon à faire monter le liquide sans créer de bulles ou d'aérosol. Placer le cône contre la paroi près du fond du tube ou de la surface où le liquide doit être apporté Presser jusqu'à la première butée et marquer un temps Si tout le volume n'est pas délivré, enfoncer un peu plus le piston Retirer le pipetman du tube avant de relâcher le piston (doucement) Enlever le cône soit à l'éjecteur, soit à la main en "dévissant" pour éviter les aérosols, sources de contaminations (très important pour la PCR) Précautions Ne pas tenir par l'embout porte-cône : la chaleur de la main dilate l'air à l'intérieur et fausse le volume prélevé. Ne pas poser à plat ou tenir pointe en l'air une pipette avec le cône contenant du liquide : risque de corrosion du mécanisme. En cas d'aspiration accidentelle de liquide dans le corps du pipetman, ou de mauvais fonctionnement (le liquide ne tient pas dans le cône lorsque le piston est relâché), avertir un enseignant. 5

DILUTIONS SIMPLES - DILUTIONS EN SERIE Les dilutions augmentent le volume d'une solution en ajoutant du solvant, sans changer la quantité de soluté. La dilution abaisse la concentration de soluté. Pour visualiser cela, penser à un verre de sirop : le sirop est très concentré en sucre; le boire tel quel n'est pas agréable. Si on met cl de sirop dans un verre et qu'on ajoute 5 cl d'eau, on dilue ce sirop 6 fois (le volume total devient 6 cl) et c'est beaucoup plus agréable à boire : le sucre est dilué 6 fois. Mais quand on a bu tout le verre, on a avalé la même quantité de sucre que si on avait bu directement cl de sirop pur. La quantité de soluté n'est pas changée par la dilution. La concentration peut avoir deux expressions : Concentration molaire : C = n/v (exprimée en mol.l - ) Concentration massique : C = m/v (exprimée en g.l - ). Dilutions simples Dans la plupart des protocoles expérimentaux, on doit préparer des solutions diluées de volume final V f et de concentration finale C f à partir de solutions de concentration initiale C i plus élevée (solutions "stocks" ou solutions "mères"). Le raisonnement à tenir est que la quantité de soluté présente dans la solution finale sera la même que celle à prélever dans la solution stock. Cette quantité est un nombre de moles une masse n = CV si C est une concentration molaire m = CV si C est une concentration massique Dans le cas d'une solution exprimée en concentration molaire, la quantité de soluté n i = n f soit C i V i = C f V f C i : concentration initiale (disponible avant dilution) V i : volume initial (à prélever pour réaliser la dilution) C f : concentration finale (à atteindre après dilution) V f : volume final total (V f = V diluant + V i ) D'où le volume à prélever de solution stock V i = (C f V f )/C i Nomenclature : dilution - facteur de dilution Le rapport V i /V f correspond à la dilution d. Dans l'exemple du sirop, d = V i /V f = /6. On a fait une dilution au /6 ème. L'inverse de d, V f /V i est le facteur de dilution f. Dans le même exemple, f = V f /V i = 6. Le sirop est dilué d'un facteur 6. 2. Dilutions en série ou dilution en progression géométrique On peut être amené à faire des dilutions très grandes, par exemple pour dénombrer les bactéries présentes dans une culture. On compte le nombre de colonies formées à partir d'une dilution sur une boîte de milieu gélosé. On peut au maximum isoler entre 000 et 0000 colonies sur gélose. Une culture saturée peut contenir plus de 0 bactéries par ml. Il faut donc la diluer au moins d'un facteur 0 5 (00 000). On a le choix entre : - Prélever ml de culture et la diluer dans 00 000 ml de milieu (00 litres!) - Prélever 0, 0000 ml(un centième de microlitre!) de culture et la diluer dans ml - Faire des dilutions en série Les deux premières options sont inapplicables (consommation de milieu, problème de récipients pour la première, imprécision des pipettes pour la seconde). La dilution en série est un moyen pratique et fiable pour réaliser une grande dilution. On dilue la solution S 0 d'un facteur f choisi pour obtenir la solution S, puis on dilue S du même facteur f pour obtenir S 2 et on répète cela jusqu'à atteindre la dilution souhaitée. Le facteur de dilution final est le produit des facteurs de dilution de chaque étape. C =C 0 /f, C 2 =C /f, C 3 =C 2 /f etc d'où C n =C 0 /f n Dans l'exemple des bactéries, on réalise classiquement des dilutions en série d'un facteur 0 ( volume de solution à diluer + volumes de diluant). Les dilutions successives /0 ème, /00 ème, /000 ème etc sont ainsi facilement obtenues. 6

3. Réalisation pratique d une dilution en série Préparer le tableau de dilutions avant de commencer les manipulations Annoter les tubes soigneusement Mettre dans chaque tube un volume identique de solvant Ajouter dans le tube le volume de solution V dil préalablement défini en plongeant uniquement l extrémité du cône dans le solvant. Homogénéiser soit par 3 aspirations refoulements à la pipette, soit par retournement du tube bouché, soit par agitation (vortex) en évitant la formation de bulles ou de mousse. Sans changer de cône, reprendre dans le tube le volume de solution V dil et le délivrer dans le tube 2 comme précédemment. Homogénéiser. Reprendre dans le tube 2 le même volume de solution V dil et le délivrer dans le tube 3. Procéder ainsi jusqu au dernier tube de la gamme de dilutions. Cette méthode ne nécessite pas de changer de cône à chaque pipetage bien que l'on aille des solutions les plus concentrées vers les plus diluées car on considère que l'erreur sur le volume est négligeable. De plus, cette erreur est reproduite à l'identique à chaque dilution. Ainsi, la progression géométrique est assurée. Pour déposer les dilutions, partir de la plus diluée et procéder sans changer de cône. Exemple de tableau de dilutions d'une culture bactérienne saturée Nom de la Solution S0 S S2 S4 S5 S6 S7 S8 S Volume de solvant (ml) - Solution ajoutée S0 S S2 S4 S5 S6 S7 S8 Volume de solution ajoutée (ml) Dilution par rapport à S0 /0 ème /00 ème /000 ème /0000 ème /00000 ème /000000 ème /0000000 ème /00000000 ème Bactéries/mL 0 0 8 0 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 AUTRES EXPRESSIONS COURANTES POUR LES SOLUTIONS Le pourcentage. Une solution à 2% correspond à 2g de soluté pour 00mL de solvant. Le facteur de concentration. Une solution mère notée 50x doit être diluée 50 fois pour être utilisée. 7

- Choix du tampon : PREPARATION DE SOLUTION TAMPON Une solution acide faible/base faible, acide fort/base faible ou acide faible/base forte, sera tamponnée si le ph de la solution est proche de la valeur du pka du couple acido-basique utilisé. Pour préparer une solution tampon on choisira donc un couple acide/base dont le pka est proche de la valeur tampon qui nous intéresse. * Concrètement, il faut utiliser un couple acide/base dont le pka ne s écarte pas de plus d unité du ph de la solution tampon à obtenir. * La concentration des tampons doit être comprise entre 0, et 0M. Pour simplifier, on pourra préparer des solutions tampon à M et les diluer à la concentration choisie avant utilisation. - Pour une solution tampon acide, on choisit classiquement Le couple CH 3 COOH/CH 3 COO - Na +, de pka = 4,8 - Pour se rapprocher du ph physiologique, on choisit classiquement Le couple NaH 2 PO 4 /Na 2 HPO 4, de pka = 6,86 Le couple Tris/HCl, de pka = 8, - Dans les cas d une solution d acide faible et de sa base conjuguée, on aura une solution tampon pour n A =n B ou C A V A =C B V B. Il est donc possible de déterminer les volumes de l acide et de la base à mettre d après l équation d Henderson-Hasselbach : ph = pka+log [B]/[A] Il a été ainsi défini les volumes suivants de NaH 2 PO 4 M et de Na 2 HPO 4 M à mélanger à 00 ml d'h 2 O pour obtenir L de solution tampon 0,M : ph final Volume de Na 2 HPO 4 (ml) Volume de NaH 2 PO 4 (ml) 6,2 6,6 6,8 7,0 7,2 7,4 7,8 7,8 35,2 46,3 57,7 68,4 77,4 8,6 82,2 64,8 53,7 42,3 3,6 22,6 0,4 - Dans le cas d une solution acide faible/base forte ou acide fort/base faible, il s agira d ajuster le ph à l aide de l acide ou la base appropriée. * Exemple pour préparer 500 ml de tampon Tris M ph 7,2 (pka = 8, ; les tampons Tris ont un ph variant généralement de 7 à ). PM tris = 2,4. * Prélever V final (L) * Molarité finale (mol/l) * PM tris (g/l) = 0,5 * * 2,4 = 60,57 g de Tris base * Dissoudre dans un becher le Tris dans la moitié du volume final souhaité (250 ml) à l aide d eau distillée. * Ajuster le ph à l aide d une solution d HCl N. * Transvaser en éprouvette graduée et ajuster le volume à 500 ml à l aide d H 2 O distillée. 8

UTILISATION DU PH-METRE Un ph-mètre est un voltmètre dédié à la mesure du ph des solutions aqueuses. Il est constitué d un boîtier électronique qui indique la valeur du ph et d'une sonde renfermant 2 électrodes que l'on plonge dans la solution aqueuse dont on veut mesurer le ph. Ces deux électrodes sont à l'intérieur d'un tube de verre microporeux, ce qui permet aux ions H 3 O + de diffuser de la solution mesurée vers l'intérieur de la sonde. Les électrodes d un ph-mètre sont fragiles. La sonde doit toujours être immergée dans une solution aqueuse. Avant et après utilisation, la sonde est conservée immergée dans une solution de forte salinité (généralement KCl). Principe : Le ph-mètre mesure la différence de potentiel ΔE entre une électrode de potentiel constant (l'électrode de référence) et une électrode dont le potentiel dépend du ph (l'électrode de verre ou de mesure). La différence de potentiel est une fonction affine décroissante du ph : ΔE = a b.ph où a et b sont des constantes qui dépendent de la nature des électrodes, des solutions dans lesquelles elles sont immergées et de la température. Les valeurs de a et b sont ajustées par l'étalonnage du ph-mètre. L'appareil calcule et affiche directement la valeur du ph : ph = (a-δe)/b Utilisation : Elle se fait en 3 temps. er temps : étalonnage en température. Sur les modèles manuels, on entre la valeur de température à laquelle se font les mesures (généralement, la température de la salle). Les ph-mètres modernes possèdent une sonde de température installée dans la sonde de verre et font cet étalonnage automatiquement. 2 ème temps : étalonnage en ph (à l'aide de 2 ou 3 solutions commerciales de ph fixé, encadrant le ph que l'on souhaite mesurer. Rincer la sonde à l'eau distillée, et assécher l'excès d'eau à l'aide d'un papier absorbant. Immerger la sonde dans la première solution d'étalonnage (par exemple ph = 0) sous agitation magnétique. Attendre que la valeur de ph se stabilise et régler manuellement à 0. Répéter ces opérations avec les solutions de ph = 7 et ph = 4. 3 ème temps : mesure de la solution, ajustement du ph Rincer la sonde à l'eau distillée, et assécher l'excès d'eau à l'aide d'un papier absorbant. Immerger la sonde dans la solution que l'on souhaite mesurer ou ajuster, sous agitation magnétique. Après stabilisation de la valeur affichée par le ph-mètre, ajouter l acide ou la base petit à petit à l aide d une pipette pasteur. Attendre la stabilisation de la valeur mesurée avant d ajouter une autre quantité d acide/base. Attendre environ 5 min pour considérer le dernier ph obtenu comme définitif. En fin de mesure, la sonde est lavée à l'eau distillée et replacée dans la solution de KCl pour être conservée. Transvaser la solution en préparation dans une éprouvette graduée et ajuster au volume final souhaité avec de l eau distillée.

SPECTROPHOTOMETRE Absorption de la lumière par les solutions - Absorbance Le spectre électromagnétique a été divisé en 6 gammes de longueur d onde différentes en fonction des domaines d utilisation. Le spectre visible comprend les longueurs d'onde comprises entre 400 nm et 800 nm. Au-dessous de 400 nm, ce sont les ultra-violets (UV), au-dessus de 800 nm, ce sont les infra-rouges (IR). La radiation électromagnétique est associée à un champ magnétique oscillant et un champ électrique de forme sinusoïdale, d énergie E = hν = h.c/λ (h = constante de Planck, c = vitesse de la lumière, λ = distance entre 2 oscillations ou longueur d'onde) Lorsqu une radiation associée à une certaine énergie rencontre une molécule, la molécule peut absorber cette énergie. Son organisation (atomes constituants, types de liaisons chimiques, présence d'électrons délocalisés) détermine quelles énergies elle peut absorber. Ainsi, certaines molécules en solution absorbent une partie du spectre visible : on les voit colorées. Elles réfléchissent les longueurs d onde non absorbées. D'autres, comme l'adn ou certaines protéines, absorbent dans l'uv. La solution paraît incolore. On utilise cette propriété d'absorption pour mesurer leur concentration à l'aide d'un spectrophotomètre. Principe : Une source de lumière (blanche pour le visible, lampe à mercure pour l'uv) traverse un dispositif qui sélectionne une longueur d'onde λ. Le faisceau de lumière monochromatique d'intensité I 0 traverse l'échantillon. Un capteur transforme l'intensité lumineuse sortante I en signal électrique. Un analyseur mesure le signal électrique et affiche la valeur de l'absorbance. L'absorbance ou densité optique (DO) est définie par A = log 0 (I 0 /I). C'est une grandeur logarithmique, sans dimension. Le tableau ci-dessous indique quelques correspondances entre A et I 0 /I. Absorbance (A) 0 2 % de lumière transmise (I 0 /I x 00) 00% 0% % Pour une solution donnée, on détermine la longueur d'onde d absorption maximale λ max à laquelle on effectuera la mesure grâce à la réalisation d'un spectre d'absorption : la solution est soumise à un faisceau dont on fait varier la longueur d'onde. Le profil d'absorption d'une solution de protéines a l'allure suivante : On mesurera donc la concentration des protéines à 280 nm. 0

SPECTROPHOTOMETRIE PRATIQUE L'intensité de la lumière diminue exponentiellement au fur et à mesure qu'elle traverse l'échantillon. Cette absorption dépend du nombre de molécules de la substance absorbante présentes dans le trajet lumineux. L'absorbance est directement proportionnelle à la concentration c. C'est la loi de Beer-Lambert. A = log 0 (I 0 /I) = ε.l.c ε = Coefficient d'extinction molaire, spécifique de la substance absorbante. ε est exprimé en M - cm - l = longueur du trajet optique dans la cuve (exprimé en cm) c = Concentration de la substance absorbante (exprimée en moles/l) Utilisation des cuvettes Application Choisir le type de cuvette adapté à la longeur d'onde : quartz pour les ultra-violets (0-400 nm), verre ou plastique pour le visible (400 nm - 800 nm) Tenir la cuvette par les faces dépolies, jamais par les faces transparentes (les traces de doigts faussent la lecture). Manipuler avec précaution : cuvette quartz = 50, cuvette verre = 20, cuvette plastique = 0, Remplir la cuvette avec le volume adapté et enlever les bulles d'air: le faisceau lumineux doit traverser un milieu homogène. Bien s'assurer que le niveau du liquide est suffisant pour que le faisceau passe sous le ménisque. Mesure Spectrophotomètre monofaisceau : la mesure se fait en 2 temps.. réglage du zéro ou "blanc". On mesure l'absorbance de l'ensemble {cuvette + solvant} sans le soluté puis on donne à l'absorbance correspondante la valeur zéro : A cuvette+solvant = 0 2. mesure de l'échantillon {cuvette + solvant + soluté}. L'appareil indique une absorbance A échantillon A échantillon = A cuvette + solvant + soluté A échantillon = A cuvette+solvant + A soluté.comme on a donné la valeur zéro à A cuvette+solvant A échantillon = A soluté Spectrophotomètre bi-faisceau : un second faisceau identique au premier traverse une cuvette contrôle contenant le solvant seul. L'absorbance affichée est directement la différence A échantillon A contrôle = A soluté Veiller à toujours se placer dans la gamme des absorbances entre 0, et! La loi de Beer-Lambert ne s applique que pour des solutions faiblement concentrées. Pour une solution donnée, le domaine de concentration où cette loi s'applique doit être défini en réalisant une gamme étalon : on mesure l'absorbance d'une série de solutions de concentrations croissantes connues. Le domaine de validité correspond aux valeurs pour lesquelles l'absorbance croît de façon linéaire avec la concentration. Détermination de concentration d'une solution inconnue On réalise d'abord une courbe d'étalonnage du spectrophotomètre à partir de solutions de concentration croissante de l'espèce à déterminer, couvrant l'intervalle d'absorbance de 0 à. On mesure l'échantillon inconnu soit pur, soit dilué d'un facteur connu afin de se trouver dans la gamme d'absorbance 0,<A< et on en déduit sa concentration en se reportant à la courbe d'étalonnage.

Principe ELECTROPHORESE L'électrophorèse est une technique de séparation de molécules en solution basée sur leur différence de mobilité dans un champ électrique. Un mélange de molécules est soumis à un champ électrique, ce qui entraîne la migration des molécules chargées. La vitesse de migration dépend de plusieurs paramètres : charge, masse, forme, nature du support, ph, température). Supports d'électrophorèse L'électrophorèse utilise un support solide, chimiquement inerte vis-à-vis des espèces que l'on désire séparer. Il doit avoir les propriétés d'un tamis moléculaire et maintenir les molécules en place pour les révéler en fin d'expérience. Les plus courants sont les gels d'agarose et les gels de polyacrylamide qui ont supplanté les supports papier ou acétate de cellulose. Sur ces derniers, la migration a lieu à la surface du support imbibé d'une pellicule de solution tampon. Dans les gels d'agarose et de polyacrylamide, la migration s'effectue dans l'épaisseur du gel, ce qui offre une plus grande capacité et une meilleure séparation. Le choix du support est dicté par la nature des molécules à séparer. Les gels forment un tamis moléculaire tridimensionnel. Les molécules progressent dans les espaces libres du tamis. Plus ces molécules sont encombrantes, plus leur progression est difficile et lente. Au-delà d'un encombrement, toute migration est impossible : c'est la limite supérieure de séparation. Au contraire, les très petites molécules passent librement les pores et sont mal séparées. On adaptera le maillage ou la réticulation du tamis en fonction des tailles de molécules que l'on veut séparer. Exemples Molécule ADN Protéines Taille -20 kb 0,5-5 kb 0,-2 kb 30-500 pb -00 pb 40-400 kda 20-200 kda 0-00 kda 2-40 kda Type de Agarose Polyacrylamide Polyacrylamide gel % 0,8% % 2% 4% 8% 7,5% 0% 2% 5% Mise en œuvre Le gel est préparé dans un tampon adapté et coulé à l'état liquide sur un support adapté : horizontal pour l'agarose, vertical pour le polyacrylamide. Un peigne destiné à former les puits de dépôt est mis en place et laissé jusqu'à solidification du gel. Il est alors retiré et le gel est placé dans une cuve, remplie de tampon et munie de deux électrodes reliées à un générateur. Les échantillons sont déposés ainsi qu'une référence (ou marqueur de taille). L'électrophorèse est lancée en faisant passer un courant adapté (ampérage, voltage) pendant une durée déterminée. Le gel est démonté, coloré pour révéler les molécules d'intérêt et photographié. Exemples de gel : Système pour protéines Système pour ADN 2

UTILISATION DU MICROSCOPE OPTIQUE (= PHOTONIQUE) oculaire tube optique tourelle objectif potence platine ouverture diaphragme diaphragme lumière réglage lumière socle valet vis macrométrique vis micrométrique alimentation. Préparation du microscope - Placer la potence du microscope face à soi. - Brancher l alimentation. - Vérifier que le plus petit objectif (x4 ou x0 selon le modèle) est placé sous le tube optique. - Allumer la lampe (en tournant le bouton de réglage de la lumière). 2. Mise en place de la préparation microscopique - Placer la préparation microscopique sur la platine (lamelle vers le haut) - Fixer la préparation avec les valets. - Placer la zone à observer au centre de la platine (au dessus de la lumière). 3. Mise au point - Regarder à travers le ou les oculaires tout en remontant lentement la platine avec la vis macrométrique jusqu à ce que l image soit nette. - Régler les oculaires à sa vision (pour modèles binoculaires) : régler l'écartement et faire la netteté avec l'oculaire fixe, puis mettre au point l'autre oculaire avec la bague de réglage. - Affiner la mise au point avec la vis micrométrique. - Régler l intensité de la lumière et le contraste en tournant le diaphragme. 4. Augmenter le grossissement - Faire tourner les objectifs jusqu à obtenir le grossissement désiré. - Affiner la mise au point. 5. Pour calculer le grossissement Multiplier le grossissement de l oculaire par celui de l objectif. 5. A la fin de la séance - Baisser la platine. - Remettre les objectifs sur la position de plus faible grossissement. - Eteindre la lampe. - Débrancher l alimentation. - Recouvrir le microscope avec sa housse. 3

RECOMMANDATIONS POUR LES DESSINS D OBSERVATION Choisir un papier à grain fin, de type papier machine, format A4. Tout doit être réalisé au crayon HB taillé. Mettre le nom, le prénom et le groupe sur chaque feuille. Toujours mettre une page de garde : page de «sommaire» du TP, comprenant le titre du TP, les titres des dessins et d éventuelles précisions que vous souhaitez voir figurer. Ne mettre qu un dessin par page (le recto verso est autorisé). LE TITRE Le titre doit être centré et comporter : - la nature de la représentation : dessin, schéma, etc. - la nature de l observation : coupe transversale, coupe longitudinale, morphologie générale, phase particulière (ex. sporulation mitotique) ou directement nom de ce qui est observé (ex : zygospore), - les noms de genre et d espèce (sp. si l espèce n est pas connue) soulignés NB : La première lettre du premier terme (le nom de genre) s'écrit en majuscule et tout le reste en minuscules, ainsi que le groupe de l'organisme considéré (ex : Polypodium vulgare (Filicopsida), ou Polypodium sp. (Filicopsida)). - la méthode d observation (observé à l œil nu, à la loupe binoculaire, au microscope optique). - L origine de la lame: préparation commerciale, préparation personnelle. Exemples : Dessin d observation d une coupe transversale dans un rhizome de Polypodium vulgare (Filicopsida) au microscope optique. Préparation personnelle. Dessin d observation de la morphologie générale d un Polypodium sp. (Filicopsida) à l œil nu. LE DESSIN Toujours centrer le dessin S efforcer d observer dans le microscope «en même temps» que l on dessine, et non alternativement (pas 5 min d observation puis 5 min de dessin). Afin de bien voir les contours cellulaires et l épaisseur des parois, il est nécessaire de faire varier constamment la mise au point avec la vis micrométrique, ainsi que le contraste à l'aide du diaphragme. Respecter les proportions entre les différentes parties du dessin Concernant la représentation des cellules : - Au faible grossissement, jouer sur l épaisseur du trait de crayon pour représenter les parois plus ou moins épaisses - Au fort grossissement, représenter les parois épaissies par deux traits distincts (un trait pour la limite interne et un pour la limite externe), la paroi ayant toujours une épaisseur constante (sauf cas particulier) Dessiner les cellules d'épithélium bien collées les unes aux autres (pas de vide entre elles). Ne pas faire chevaucher les parois des cellules. Représenter chaque cellule indépendamment de sa voisine Ne pas oublier d indiquer une partie des parois voisines et de leurs épaississements éventuels en limite de votre dessin, pour montrer que ce n est pas une limite naturelle, mais un extrait du tissu comme si vous l aviez coupé avec une paire de ciseaux. NE PAS GRISER NI HACHURER! Autrement dit, ne pas représenter les ombres ou les zones plus sombres dans les tissus ou cellules en grisant ou hachurant des zones LES LEGENDES Ne pas croiser les flèches. Les flèches sont des traits simples, horizontaux (sauf si c est impossible), à la règle, ne se terminant pas par "->". Placer les légendes en dehors du dessin (en général à droite), Les légendes doivent êtres brèves mais précises et complètes, écrites lisiblement, bien orthographiées et horizontalement (prenez l habitude de glisser sous votre feuille de papier une feuille quadrillée). LE GROSSISSEMENT / L ECHELLE Grossissement (microscope, loupe binoculaire): Dans le titre ou en dessous du titre, mentionner l oculaire et l objectif. Ex : G = oc. 0 x obj. 40 Echelle (microscope, loupe binoculaire, œil nu): ) Mesurer la taille réelle : - S il s agit d une observation à l œil nu, mesurer précisément la taille de l objet dessiné. - S il s agit d une observation au microscope : 4

o Soit l objet dessiné est visible à l œil nu, et peut être mesuré directement à la règle sur la lame. o Soit l objet n est pas visible à l œil nu, dans ce cas lors de l observation au microscope, glisser une pointe de porte-mine (critérium) dont la largeur est connue (en général 0,7 mm, voir ce qui est écrit sur le porte-mine) entre la lame et l objectif si l espace est suffisant entre lame et objectif! Ne pas forcer pour ne pas risquer d abîmer l objectif. Evaluer la taille réelle de l objet. 2) Mesurer la taille du dessin 3) Placer l échelle. Deux types d échelles : - Barre d cm, au dessus de laquelle on fait figurer à combien de cm dans la réalité correspond cm sur le dessin. - Barre correspondant à un chiffre rond ( cm, 0 µm, 50 µm ). réalité dessin 5,5 cm 3,5 cm Réalité (cm) Dessin (cm) 5,5 3,5? X ou,6 cm cm? = 5,5/3,5 =,6 cm (à écrire sur la barre) X = 3,5/5,5 = 0,6 cm (taille de la barre) BILAN et exemple. 5

NOTES PERSONNELLES 6