Bases moléculaires des mutations Marc Jeanpierre

Bases moléculaires des mutations Marc Jeanpierre Chaque enfant qui naît hérite de 10 à 30 nouvelles mutations ponctuelles. L essentiel des ces mutations sont heureusement des variations neutres de séquence dans les régions intergéniques. On distingue traditionnellement les mutations somatiques (apparues dans les cellules d un tissu ou d un organe) des mutations germinales (apparues dans la lignée germinale et pouvant être transmises à la descendance). Lorsqu une mutation apparaît au cours du développement, la mutation n est observée que dans une partie seulement des tissus; on désigne la présence de deux types de cellules chez le même individu comme un mosaïcisme si la fraction minoritaire de cellules est supérieure à 5%. Une mutation en mosaïque peut être transmise à la decendance si elle est présente dans la lignée germinale. Les mutations sont habituellement considérées par leurs conséquences pathologiques, mais certaines mutations sont bénéfiques comme les mutations somatiques des régions variables des gènes d immunoglobuline qui augmentent la spécificité de l anticorps et sont sélectionnées positivement au cours des immunisations successives. I-Différents types de mutations On distingue deux types de mutations: les mutations simples qui ont une faible probabilité de survenue (au plus 10-5 ), et les mutations survenant sur des séquences instables formées par la répétition successive d un motif de quelques nucléotides. L instabilité est directement liée au nombre de triplets et à l homogénéité de la répétition (l interruption des répétitions par une variation de séquence stabilise le domaine). A-Mutations simples 95% des mutations sont des mutations ponctuelles (variations de séquence d une ou de quelques bases par remplacement d une base par une autre, petite délétion ou insertion) et seulement 5% sont des lésions de grande taille (délétions et insertions importantes, inversions). La proportion de mutations limitées à quelques bases et de remaniement important varient selon les gènes: des délétions d au moins un exon représentent 2/3 des mutations de la dystrophine; la moitié des hémophilies A sont

2 expliquées par l inversion d une partie du gène du facteur VIII hérité du père de la première conductrice. Chaque gène a un profil de mutation particulier. Les mutations ponctuelles peuvent être divisées en deux catégories: le remplacement d une base par une autre et les petites insertions et délétions. 1-Remplacement d une base On distingue les transitions (remplacement d une base purique par une autre base purique ou d une base pyrimidique par une autre base pyrimidique) et les transversions (remplacement d une base purique par une base pyrimidique ou l inverse). Les transitions sont deux fois plus fréquentes que les transversions. Nomenclature: (1) au niveau de la séquence d ADN, le remplacement d une adénine par une guanine en position 1555 d une séquence est une transition notée A1555G. Nomenclature: (2) En règle générale cependant, une mutation qui conduit à un changement simple d acide aminé dans une protéine (par exemple remplacement d une cystéine par une tyrosine en position 282) est désignée par la modification engendrée sur la protéine (par exemple C282Y) de préférence à la modification de la séquence: ainsi le terme G551D sera préféré à G1784A pour désigner la même mutation. Parmi les transitions, celles qui concernent la séquence CG vers TG ou CA représentent environ 40% de toutes les mutations ponctuelles. Le dinucleotide CpG est donc un point chaud de mutation. Les cytosines sont susceptibles d être désaminées en uracile qui n est pas un composant normal de l ADN et qui est retiré par un complexe enzymatique (uracile DNA glycosylase) pour être remplacé par la base attendue (cytosine). Ce mécanisme de réparation très efficace ne peut être utilisé si la cytosine est méthylée car, dans ce cas, la désamination transforme la cytosine en thymine qui est un composant normal de l ADN. Comme les cytosines ne peuvent être méthylées que si elles sont suivies d une guanine, les mutations survenant sur les cytosines méthylées du dinucleotide CpG sont des points chauds de mutation. Exemple: CGA (Arginine) Æ TGA (Stop). Certaines mutations touchant les CpG ont une fréquence particulièrement élevée comme la mutation G1138A du gène FGFR3 (recepteur 3 pour le FGF) responsable de l achondroplasie dont la fréquence est de 1/20 000 par génération. Cette mutation conduit au remplacement d un résidu acide aminé glycine par une arginine dans la protéine (G380R).

3 2-Petites délétions Les petites deletions aboutissent à la perte d une à plusieurs bases. Nomenclature: Les petites délétions sont désignées par la position dans la séquence suivie du suffixe del et soit la séquence des bases délétées (exemple 413delAG) soit du nombre de bases délétées (1706del17 désigne la délétion de 17 bases à partir de la position 1706 d une séquence; 1706-1722del est aussi utilisé pour désigner la même délétion). Les deletions/insertions de la séquence codante qui ne sont pas des multiples de 3 bases entraînent un décalage du cadre de lecture et conduisent en règle générale à une protéine incomplète qui est rapidement dégradée. La délétion de trois bases (ou d un multiple de trois bases) cause la perte d un (ou de plusieurs) résidus acides aminés dans la protéine; le résidu manquant peut être précédé du préfixe d ou delta Exemple: F508 dans le gène CFTR, signifiant la perte du résidu phénylalanine - symbole F dans le code à une lettre- en position 508 de la protéine CFTR. Cette délétion peut être aussi décrite comme F508del. Lorsque le même changement au niveau de la protéine (par exemple G628R) peut être causé par des mutations distinctes (G2014A et G2014C), la modification de la séquence d ADN peut être indiquée à la suite comme G628R(G>A) et G628R(G>C). 3-Petites insertions Les petites insertions désignent les mutations associées à l apparition d une ou plusieurs bases dans une séquence donnée. Nomenclature: Les petites insertions sont désignées par leur position dans la séquence suivi du suffixe ins, comme 121-122insT qui désigne l insertion d un T entre les nucléotides 121 et 122, ou 146ins4 qui désigne l insertion de 4 bases en position 146. les insertions sont très souvent des duplications comme CTGAG vers CTGATGAG qui peut être décrit comme une insertion de trois bases (4-5insTGA) ou une duplication (dup2-4). Nomenclature: dup1751->61 pour une duplication des bases 1751 à 1761 soit 11 bp. 4-Délétions et insertions importantes Les délétions d un exon, d un gène entier ou de plusieurs gènes sont peu fréquentes excepté pour les gènes liés au chromosome X où les remaniements

4 génomiques importants sont communs (la proportion de délétions varie de 5 à 95% selon les gènes considérés du chromosome X). En général les grandes mutations ne sont pas connues à la base près; elles sont habituellement décrites sans référence à une séquence (exemple: délétion des exons 45 à 47 dans le gène de la dystrophine). On retrouve parfois des séquences particulières aux extrémités d un remaniement de grande taille sans que cela soit une règle générale. L un des meilleurs exemples est la duplication de 1,5 Mbases contenant le gène PMP22 sur le chromosome 17 qui est responsable de l une des formes de neuropathie de Charcot-Marie-Tooth. De manière tout à fait exceptionnelle, une mutation peut être causée par l insertion d un élément mobile. Il existe deux types d éléments mobiles chez l homme, les courts (séquence Alu de 300 pb) et les longs (séquence L1 de 6 kb apparentée aux transposons). Ces éléments mobiles n ont qu un rôle anecdotique en pathologie humaine, mais ils constituent des marqueurs génétiques extrêmement intéressants parce que chaque insertion est un évènement irréversible. 5-Bases de données Il existe plus de 600 bases de données de mutations dont la liste peut être obtenue par l intermédiaire du projet Hugo: http://ariel.ucs.unimelb.edu.au:80/~cotton/mdi.html ou du projet Human Gene Mutation Database de Cardiff http://www.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/hgmd0.html. Les 18000 mutations répertoriées ne représentent qu une partie des mutations connues.

5 B-Mutations instables Les séquences instables sont formées par la répétition successive et homogène d un motif de quelques nucléotides (dinucleotides comme (TG)n, trinucleotides comme (CAG)n...). Dans la population générale, le nombre de répétitions observé est variable mais relativement stable lorsque ce nombre est petit (le seuil dépend de la séquence considérée). L instabilité naît de la longueur de la répétition homogène de la même séquence: les séquences les plus longues sont les moins stables. Cette instabilité est le plus souvent méiotique (le nombre de répétitions transmises d une génération à l autre est variable) mais peut être mitotique pour les plus grandes répétitions de certaines séquences; dans ce cas, les différentes cellules ayant un nombre différent de répétitions, les mutations sont en mosaïque. Les maladies regroupées parce que leur mutation survient sur une séquence instable sont le plus souvent des maladies neuromusculaires. Les séquences instables peuvent être situées dans la région traduite d un gène (exemple: chorée de Huntington), dans un intron (exemple: ataxie de Freidreich), dans les régions flanquantes (exemples: au début du gène dans le syndrome de l X fragile ou à la fin du gène dans la myotonie de Steinert).

6 1-Chorée de Huntington La chorée de Huntington est le type de maladies neurodégénératives causées par l amplification d une séquence de trois bases (CAG) codant pour la glutamine. Un gène normal possède de 10 à 35 codons glutamine. Toute personne dont l une des copies du gène huntingtine contient plus de 35 codons glutamine développera une chorée de Huntington, d autant plus précocément que le nombre de répétition est élevé (jusqu à 120 CAG; le plus souvent de 40 à 55). Les variations du nombre de CAG sont essentiellement observées dans le gène hérité du père. Il existe une dizaine d autres maladies dégénératives du système nerveux central (en particulier pathologie spino-cérébelleuse) dont la mutation est l amplification de codons glutamine. 40/17 18/ 20 15/ 20 44/20 17/18 42/20 44/15 60/17 57/18 Figure [mutation 1] Exemple de famille de chorée de Huntington (maladie de Huntington). Les personnes ayant hérité d un allèle muté du gène de la huntigtine sont représentés en grisé. Le nombre de CAG est représenté sous chaque individu. Les allèles normaux (15 à 20 CAG dans cette famille) sont transmis sans changement alors que les allèles mutés (en gras, 40 à 60 CAG dans cette famille) peuvent être amplifiés à chaque génération lorsqu ils sont transmis par le père.

7 2-Syndrome de l X fragile (FRAXA) La mutation responsable du syndrome de l X fragile est une amplification pathologique d une séquence CGG située dans la région 5 non traduite de l exon1 du gène FMR situé en Xq27.3. Les allèles normaux sont habituellement formés de 5 à 50 triplets. Les répétitions de 60 à 230 triplets sont appelés prémutés car susceptibles d être amplifiés lors du passage à la génération suivante. Les allèles mutés contiennent plus de 230 triplets (jusqu à plus de 2000 triplets). La région entourant l exon1 des allèles mutés sont méthylés alors que les allèles normaux et prémutés ne le sont pas. Cette méthylation empêche l expression du gène FMR. Allèles normaux du gène FMR: 5-50 CGG ATG TAA Allèles prémut és du gène FMR: 60-230 CGG ATG TAA Allèles mut és du gène FMR: 230 à plus de 2000 CGG ATG TAA Figure [mutation 2] Amplification du triplet CGG dans le gène FMR. Le nombre d exons a été réduit pour la clarté du schéma. Chez les garçons atteints, le nombre de triplets CGG est habituellement compris entre 230 et plus de 1000 : cette mutation " complète " s accompagne habituellement d une méthylation des cytosines des CGG qui empêche la transcription du gène et occasionne la maladie. Dans tous les cas, une " prémutation " s est créée progressivement dans la famille, par un accroissement de quelques exemplaires par génération du nombre de CGG du motif : cette prémutation est ainsi transmise par des hommes ou des femmes asymptomatiques.

8 Lorsque le nombre de CGG d un des gènes FMR1 d une femme " prémutée " (hétérozygote) est compris entre 60 et 90, et que cette femme transmet à un enfant une copie de ce gène, ce peut être soit sous une forme prémutée (éventuellement accrue de quelques CGG), soit sous la forme d une mutation complète ; la probabilité de cette deuxième éventualité s accroit de 5 % quand la mère possède 60 CGG à 100% quand elle possède 90 CGG. Un garçon porteur d une mutation complète est pratiquement toujours retardé quand celle-ci est méthylée ; il peut avoir reçu la mutation soit d une mère prémutée soit d une femme porteuse d une mutation complète. Une femme porteuse d une mutation complète aura une probabilité de 50% d être retardée : on parle de semi-dominance liée à l X. On décèle fréquemment des antécédents familiaux quand le diagnostic est posé sur un garçon ; en outre, l on peut observer, en amont, la transmission apparemment paradoxale de la maladie, sous forme de prémutation, par des mâles sains. En revanche, une mutation complète n apparait jamais dans la descendance directe d un homme prémuté. 3-Dystrophie myotonique de Steinert La mutation responsable de la dystrophie myotonique de Steinert est une amplification pathologique d une répétition de triplets CTG. Cette séquence est située dans la partie 3 non traduite du gène DMPK, et ne code donc pas pour une partie de la protéine à la différence de l exemple précédent. Les allèles normaux ont moins de 80 CTG, et le plus souvent entre 5 et 40 CTG; toutefois les allèles susceptibles d être amplifiés à la génération suivante contiennent de 50 à 80 CTG et sont appelés prémutés car ils sont à l origine des mutations (80 à 1000 CTG pour la forme adulte de la myotonie de Steinert). Il existe une forme congénitale très sévère et souvent létale, toujours d origine maternelle dont les mutations ont 2000 à 3000 CTG. 4-Autres mutations instables Dans les trois exemples précédents, l amplification concerne une séquence de 3 paires de bases, dont l instabilité est liée au nombre de répétitions. Il existe une maladie (épilepsie myoclonique dont le gène est sur le chromosome 21) pour laquelle la majorité des mutations est l amplification (plus de 50 copies au lieu de 3) d une séquence de 12 bases (CCCCGCCCCGCG) en amont du gène; cette maladie est transmise sur le mode autosomique récessif comme pour l ataxie de Friedreich (200-900 triplets GAA au lieu de 6-30 dans un intron).

9 Les maladies autosomiques dominantes associées à des mutations instables ont en commun un phénomène d anticipation: les malades des dernières générations sont en règle plus sévèrement atteints que leurs parents.

10 II-Réparation de l ADN et sa pathologie L ADN est en permanence soumis à des aggressions physiques (comme les UV de la lumière solaire sur les cellules de la peau) ou chimiques (mutagènes). Les lésions induites par ces agents sont réparées avec une remarquable efficacité comme le montre l augmentation spectaculaire des mutations lorsque la réparation de l ADN est génétiquement altérée. A-Réparer ou mourir Les grandes lignes des mécanismes correcteurs des erreurs de l ADN sont retrouvés dans tous les eucaryotes et pour la majorité d entre eux également chez les procaryotes. Il existe plusieurs systèmes de surveillance et de correction des erreurs concourrant au même but. Ainsi devant une altération de l ADN, la cellule peut s apoptoser (détruisant tout risque de prolifération anormale) en particulier en présence d une cassure d ADN double brin non réparée, détecter et réparer l erreur (corriger la séquence mal appariée ou enlever les bases modifiées) contrôler l intégrité de l ADN au moment de la réplication. Plusieurs millions de divisions cellulaires par secondes sont nécessaires pour maintenir l intégrité d un être humain (3 millions de divisions cellulaires par secondes demandent la synthèse de plus de 500 millions de km d ADN par jour, plus que la distance de la terre au soleil). Il existe 7 ADN polymérases dans les cellules de mammifères dont certaines (exemple: ADN polymérase h) ne sont utilisées que pour pouvoir répliquer l ADN modifié (exemple: dimères de thymines induits par les UV). B-Nucleotides mal appariés ou modifiés Il existe deux voies principales de réparation de l ADN: le système de réparation des misappariements et le système d excision des bases modifiées. Dans le système de réparation des bases mal appariées, le mauvais appariement est reconnu par la protéine MSH2 associée à MSH3 ou MSH6, puis par la protéine MLH1 associée à PMS1 ou PMS2; l un des deux brins de l ADN est coupé à 1 kb environ des bases mal appariées, et remplacé par une nouvelle copie jusqu à la lésion. Lorsque l un des composant du système de réparation des misappariements (les 6 gènes cités, mais les mutations de MSH2 et MLH1 sont de loin les plus fréquemment observées) est déficient,

11 la cellule accumule les mutations somatiques et, à terme, prolifère en dehors de tout contrôle. Les cancers résultant d une rupture du système de réparation des misappariements sont sporadiques (les deux copies d un des gènes sont mutées par accident dans la cellule) ou héréditaires (les individus prédisposés sont hétérozygotes et la copie normale du gène est secondairement altérée). Les formes familiales des cancers résultant de ces mutations sont essentiellement des cancers du colon de type HNPCC (prédisposition familiale au cancer du colon sans polypose: 10% des cancers du colon) alors que les formes sporadiques sont à l origine de cancers de différents tissus (cancers de l estomac, de l endomètre et du colon).

12 Erreur lors de la synthèse d'un brin d'adn T G Bases mal appariées reconnues par MSH2 MSH6 (MutSα) MLH1 PMS2 (MutLα) rejoint MutSα G T L'un des brins d'adn est interrompu par une endonuclease T G Un kb d'adn environ est excisé G Un nouveau brin d'adn est synthésisé par l'adn polymérase δ G Figure [mutation 3] Mécanisme de réparation des bases mal appariées (mismatch repair). L hetérodimère MSH2 MSH6 (MutSa) et MSH2 MSH3 (MutSb) ont le même rôle; l hetérodimère MLH1 PMS2 (MutLa) a aussi le même rôle que MLH1 PMS1 (MutLb): MSH2 et MLH1 n étant pas redondants leur inactivation ne peut être compensée par un gène homologue. La voie de réparation des bases mal appariées est inactivée (par mutation ou hyperméthylation des deux copies de MLH1 ou de MSH2) dans 15-25% des cancers coliques, gastriques et de l endomètre. Dans les formes familiales de cancer colique sans polypose (HNPCC) les malades sont hétérozygotes pour l une des mutations des gènes de cette voie: si l allèle normal du gène est muté dans une cellule d un hétérozygote la correction des erreurs de réplication n est plus possible par la voie du mismatch repair ce qui entraîne rapidement une prolifération maligne.

13 Dans le système de réparation des bases modifiées, le brin d ADN est contenant la lésion est interrompu de part d autre de la base modifiée (les deux coupures sont à 27-29 bases l une de l autre) et remplacé par une séquence complémentaire du brin non modifié. Les mutations de l un des gènes codant pour un composant de ce système sont responsables de la sensibilité aux UV et à l accumulation de cancers cutanés observée chez les malades atteints du syndrome rare xeroderma pigmentosum. Cette maladie se transmet sur le mode autosomique récessif. Certaines modifications covalentes de l ADN (en particulier l oxydation de certaines bases) peuvent être réparées par l une ou l autre des deux voies. Les hétérozygotes pour une anomalie du système de réparation des misappariements (mismatch repair) sont prédisposés au cancer (transmission autosomique dominante), alors que seuls les homozygotes pour une anomalie du système de réparation des bases modifiées sont malades (transmission autosomique récessive). Pourquoi? Dans le premier cas la perte accidentelle de la copie normale dans une cellule somatique entraîne l apparition de tumeurs parce que les erreurs à corriger sont présentes en permanence et que les cellules peuvent acquérir rapidement un avantage prolifératif, alors que dans le deuxième cas la perte accidentelle de la copie normale n entraîne d anomalie qu en présence d un éventuel agent chimique ou physique, ce qui ne permet pas la sélection rapide des cellules mutées. Les produits de certains des gènes (exemple MLH1) de ces deux systèmes ont aussi un rôle important dans le mécanisme des recombinaisons méiotiques et la conversion génique.

14 C-Réparation des cassures de l ADN Les cassures des deux brins de l ADN sont immédiatement réparés par l un de deux mécanismes (réparation simple et recombinaison homologue). si cette réparation ne peut avoir lieu, l apoptose de la cellule est activée conduisant à détruire la cellule déficiente. le premier mécanisme est une réparation dite simple ou non homologue, où les extrémités libres sont simplement remises en contact et liées; le second est la répartion par recombinaison homologue. La base moléculaire de chacun de ces deux mécanismes est la même de la bactérie à l homme. Dans la réparation simple, des protéines se fixent les extrémités libres et la continuité de l ADN est restaurée par la ligase IV. Ce sont les mêmes protéines qui sont utilisées ce type de recombinaison et la recombinaison physiologique (et nécessaire) V(D)J des gènes d immunoglobuline. Dans la réparation homologue, les séquences proches de la cassure s apparient avec la copie intacte du gène situé sur le chromosome homologue et un brin complémentaire de ce gène est synthétisé. A la suite de cette réparation, la séquence du ène intact aura été copiée à l emplacement du gène cassé (conversion génique). Les produits des gènes BRCA1 et BRCA2 (mutés dans les formes familiales de cancer du sein) sont associés à la protéine Rad51 nécessaire à la recombinaison homologue. Au total, les systèmes enzymatiques permettant de maintenir la continuité de l ADN sont nécessaires (1) pour réparer les modifications chimiques ou les erreurs de réplication, (2) pour permettre les recombinaisons des gènes d immunoglobulines qui sont des mutations physiologiquement contrôlées (par exemple transition des IgM vers les IgG au cours de l immunisation), (3) pour permettre les recombinaisons lors de la méiose.