Module d ouverture : «Biotechnologies en 10 leçons»
Les Enzymes Professeur D. Combes INSA, Toulouse
Les enzymes Les enzymes Production des enzymes Purification des enzymes Immobilisation des enzymes
Historique 1783 Spallanzani, viande "liquéfiée" par le suc gastrique des faucons. 1833 première découverte d'une enzyme : Payen et Persoz. 1858 à 1871, Pasteur observe les changements chimiques qui se produisent lors de la fermentation. 1878 : Kühne propose le mot ENZYME qui signifie "dans la levure". 1897, Bertrand : coenzymes.
Historique fin des années 20 : les enzymes sont des protéines années 40 et 50, des centaines de nouvelles enzymes sont découvertes, purifiées, cristallisées : voies métaboliques clefs élucidées, mécanismes d'action et de régulation des enzymes étudiés. 1960 : 1 ère enzyme (la Ribonucléase) séquencée 1969 : Ribonucléase synthétisée par voie chimique. de 1969 à nos jours : Génie Génétique
Classification 1 - Oxydoréductases : réactions d'oxydo-réduction. 2 - Transférases :transfert d'un groupe d'une molécule à une autre. 3 - Hydrolases : coupure hydrolytique des liaisons C-O, C- N, C-C 4 - Lyases : coupure des liaisons C-C, C-O et C-N par élimination, en formant des = liaisons ou des cycles 5 - Isomérases : changements structuraux dans une molécule 6 - Ligases : liaison entre deux molécules, couplée à l'hydrolyse d'une liaison Phosphate de l'atp
Exemples Transférases transfert d'un groupe spécifique d'une molécule à une autre Dextrane Saccharase = E.C. 2.4.1.5 Sacch + Dex n (1,6 Glu) D-fruct. + (Dex) n+1 Lévane Saccharase = E.C. 2.4.1.10 Sacch + Lev n (2,6 Fruct) D-glu + (Lev) n+1 Saccharose Phosphorylase = E.C. 2.4.1.7 Sacch+P D-fructose+G-1P Hexokinase = E.C. 2.7.1.1 ATP + Hexose ADP + Hexose 6-P
Exemples Isomérases Changements géométriques ou structuraux dans une molécule : glucose-isomérase (E.C. 5.3.1.5) Xylose Isomérase glucose fructose Ligases liaison entre deux molécules, couplée à l'hydrolyse d'une liaison Phosphate de l'atp : E.C. 6.4.1.1 Pyruvate carboxylase ATP+Pyruvate+HCO 3 - ADP+ PO 4 -+Oxaloacétate
Notion de Catalyse Enzymes / Catalyseurs Site actif Liaison tridimensionnelle Flexibilité du site actif Efficacité catalytique
Enzymes / Catalyseurs Énergie S* Énergie d activation de la réaction Substrats ΔG < 0 Produits Avancement de la réaction
Enzymes / Catalyseurs Il existe un état de transition S * Comment accélérer la réaction de transformation de S en P? -élever la température - diminuer l'énergie d'activation
Enzymes / Catalyseurs Énergie ΔE S* Énergie d activation de la réaction Substrats ΔG < 0 Produits temps
Enzymes / Catalyseurs Les enzymes diminuent sélectivement l'énergie d'activation d'une réaction donnée. La température ambiante est alors suffisante pour qu'un nombre important de S P. Les enzymes sont des catalyseurs qui augmentent la vitesse des réactions chimiques sans être consommées
Site actif - région complémentaire en taille, forme et nature chimique du substrat - il y a seulement une douzaine d'acides aminés autour du site actif avec seulement 2 ou 3 qui sont directement impliqués.
Site actif Site actif A B C enzyme
Efficacité catalytique des enzymes Les enzymes accélèrent les vitesses de réaction en diminuant l'énergie d'activation : - les réactions enzymatiques se déroulent suivant un mécanisme de réactions organiques (acide-base, nucléophile, électrophile) pour lesquelles l'enzyme fournit les groupes catalytiques - les facteurs de proximité et d'orientation sont prépondérants. Sans enzyme, les rencontres de deux molécules se font au hasard : ce n'est plus le cas ici - certaines liaisons du substrat sont tendues par l'enzyme
Cinétique d enzymes à un substrat : Michaelis-Menten Observations : la vitesse initiale de réaction est directement proportionnelle à la concentration de la préparation enzymatique cette vitesse augmente de manière non linéaire avec la concentration du substrat elle atteint une vitesse maximale
Michaelis-Menten Hypothèses 1- L'enzyme est un catalyseur 2 - L'enzyme et le substrat réagissent rapidement pour former un complexe enzymesubstrat 3 - Un seul substrat et un seul complexe enzyme-substrat sont impliqués et le complexe enzyme-substrat se brise pour donner directement l'enzyme libre et le produit 4 - L'enzyme, le substrat et le complexe enzyme-substrat sont en équilibre. De plus la vitesse de dissociation de ES en E + S est beaucoup plus rapide que la vitesse de coupure de ES pour former E + P
Michaelis-Menten - 5 - La concentration du substrat est beaucoup plus élevée que celle de l'enzyme ; ainsi la formation du complexe ES n'altère pas la valeur de la concentration de S 6 - La vitesse globale de la réaction est limitée par la coupure du complexe ES pour former l'enzyme libre et le produit 7 - La vitesse est mesurée dans les premiers instants de la réaction de telle manière que la réaction inverse n'est pas significative. EQUATION DE MICHAELIS-MENTEN
Michaelis-Menten : équation V = V M [S] K M + [S]
Michaelis-Menten : traitement graphique Vi V M V M /2 K M [S]
Les producteurs d enzymes Novozyme (Danemark) : 50% DSM (Hollande) : 20% Genencor International (USA) : 15% Solvay-Miles (USA) : 5% Amano, Nagase (Japon)
Evolution des ventes mondiales d enzymes millions de $ 1250 1000 750 500 250 0 1966 1970 1980 1990 2000
Le marché des enzymes dans les détergents 1966 1970 1980 1990 Réflexe négatif des consommateurs : problème d'allergie causé par les poudres. Les enzymes sont incluses dans des granules en fibre de cellulose
Répartition des ventes d enzymes en 1995 Cosmétique Alcool Bière jus de fruits nourriture animale diagnostics chimie boulangerie arômes graisses papier cuir Textile Produits laitiers 10 % Autres 29 % 14 % Amidon 15 % 32 % Détergents
Répartition des ventes d enzymes en 2005 Textile Produits laitiers 10 % 14 % 15 % Amidon Textile Produits laitiers 6 % 8 % 12 %Amidon Autres 29 % 32 % Détergents 47 % 27 % Autres Détergents 70 % de la croissance du marché entre 1985 et 2005 (500 millions de $)
Types d enzymes 75 % sont des enzymes catalysant des hydrolyses, utilisées pour dépolymériser des substances naturelles. 40 % : Protéase (produits laitiers, détergents). Carbohydrolase (industries de l'amidon et du textile, boulangerie, alcools). Plusieurs milliers d'enzymes ont été identifiées en 1983 : 30 enzymes produites à grande échelle. en 1995 : 60 enzymes produites à grande échelle.
Enzymes d origine végétale Nom de l enzyme Origine Lipoxygénase béta-amylase Papaïne Ficine Bromélaïne Fève - Soja Malt - Soja Latex de papayer Latex de figuier Ananas
Enzymes d origine animale Nom de l enzyme Origine Trypsine Chymotripsine Pepsine Chymosine Lipase Lysozyme Pancréas de porc Pancréas de porc Estomac de porc Veau Pancréas de porc Blanc d œuf de poule
Les sources d enzymes 1991 1993 1995 Native 77 15 8 ADN recombinant 16 71 67 Ingénierie des protéines 7 14 25
Production par fermentation indépendance des contraintes saisonnières et géographiques utilisation de matières premières bon marché utilisation d installations industrielles polyvalentes rendements de production pouvant faire l objet d amélioration. lourdeur des investissements coût énergétique nécessité d un personnel qualifié risques de contamination, pollution
Enzymes produites par A. niger Endo Exo Glucose oxydase Catalase alpha-amylase Amyloglucosidase Maltase Cellulase Pectinase Béta-glucanase Inulinase Lipase Lactase Protéase acide
Technologie de base Culture dans un milieu induisant la production efficace de l'enzyme. Retrait de la biomasse, extraction et purification de l'enzyme, addition de conservateurs, immobilisation. Isolement d'un micro-organisme naturel sécrétant une enzyme d'intérêt. Le plus souvent la fermentation se fait dans une cuve agitée (jusqu à 200 m 3 ). Energie d agitation élevée (5 à 10 CV /m 3 ). Système de refroidissement important. Contrôle de la T, du ph, de la po 2,desmousses.
Apport des Biotechnologies modernes Génie génétique : transfert de gènes entre microorganismes. Clonage du gène d'une enzyme provenant d'un organisme rare chez un organisme permettant une production industrielle efficace. Ingénierie des protéines : production d'enzymes sur mesure. Purification : production sous forme de cristaux purs.
Purification des enzymes Obtenir en quantité suffisante une protéine «pure» tout en préservant ses propriétés physiologiques (structure et activité). Source Extraction Purification Dosage de la quantité produite Contrôle de la pureté Contrôle de l activité Stockage
Extraction 1 - Obtention de la source de la protéine : biopsie d organes, collecte de plantes, cultures de cellules,... 2 - Lyse des cellules : lyse mécanique, lyse chimique ou biochimique. 3 - Séparation des composants insolubles : centrifugation ou filtration.
Origine de l enzyme animale végétale microbienne broyage intracellulaire extracellulaire broyage cellulaire centrifugation / filtration mécanique non mécanique cellules surnageant élimination des acides nucléiques UF / diafiltration
Techniques de purification Techniques basées sur les propriétés de solubilité Dénaturation thermique Précipitation par ajout de sels Ajout de solvant Procédés membranaires Les méthodes de chromatographie
Les procédés membranaires Procédé Membrane Force motrice Filtration poreuse gradient de pression hydrostatique Ultrafiltration poreuse gradient de pression hydrostatique Osmose inverse non poreuse gradient de pression hydrostatique Dialyse poreuse gradient de potentiel chimique Electrodialyse poreuse différence de potentiel électrostatique
Principales méthodes de purification des protéines par chromatographie Propriétés des protéines Taille Hydrophobicité Charge Activité exclusion hydrophobe échange d ions affinité Méthodes de chromatographie
Protéine naturelle et protéine de fusion 1 - Le gène de la protéine n est pas cloné : seules les méthodes classiques de purification peuvent être utilisées. 2 - Le gène de la protéine est cloné : les méthodes classiques peuvent être utilisées mais aussi le gène de la protéine peut être modifié de telle sorte que la protéine soit exprimée sous forme de protéine de fusion.
Protéine de fusion ATG TGA Gène de la protéine Protéine Ajout de la séquence d ADN codant pour le complément de fusion ATG TGA Gène de la protéine de fusion Protéine de fusion
Fin de la purification Dialyse, diafiltration Concentration Détermination de la quantité de protéine Évaluation de la pureté Mesure de l activité Stockage : conserver une protéine tout en préservant son activité (sous forme lyophilisée,conservation à 4 C, à -20 C, à -70 C, ajout dans le tampon de stockage de composés qui stabilisent la protéine (polyols, sels, agents réducteurs,...)).
Immobilisation des enzymes Introduction Méthodes d immobilisation inclusion adsorption liaison covalente Réticulation Conséquences de l immobilisation
Intérêt d immobiliser les enzymes Résolution du mélange racémique D-L-méthionine par l acylase (procédé Tanabe, Japon) 100 énergie Coût relatif (%) 80 60 40 20 0 travail enzyme substrat Procédé discontinu conventionnel support 40 % de gain Procédé continu à enzyme immobilisée
L inclusion Les enzymes sont retenues à l intérieur d une matrice poreuse E E E E E E E Inclusion dans un gel E E E E E E E E E Inclusion dans une micro-capsule E E E E Inclusion dans une fibre
Membranes semi-perméables Substrat Membranes avec seuil de coupure de 500 à 300.000 Da choisi tel que... E E E E E E Produits E Produits Système intéressant pour hydrolyser des macromolécules (amidon, protéines )
L inclusion Les réactions de polymérisation ou de gélification sont bien maîtrisées L inclusion permet en une seule étape d immobiliser la totalité de la masse d enzyme Il n existe aucun lien entre l enzyme et le polymère : peu de risque de dénaturation Applications à tout type d enzymes Les solvants utilisés et les valeurs de ph extrêmes peuvent s avérer dénaturant. Problèmes de diffusion au travers des gels. Mauvaise tenue mécanique des gels. Problèmes d encombrement stérique.
Immobilisation d enzymes par adsorption Les enzymes sont retenues à la surface d un support insoluble par établissement d interactions secondaires entre les groupes fonctionnels de l enzyme et du support. +
Types d interaction interactions de Van der Waals : électrostatiques entre atomes ou molécules interactions hydrophobes liaisons ioniques : les résidus d acides aminés basiques et acides sont ionisés (+ et -) respectivement au voisinage de ph 7) d où la possibilité d échange d ions. liaisons hydrogènes : polarisation des liaisons entre un atome d hydrogène et un atome plus électronégatif (O ou N)
L adsorption Très grande facilité de mise en œuvre Possibilité de régénérer le support par désorption et remplacement de l enzyme. - procédé Tanabe pour résolution du mélange racémique D,L méthionine par l acylase : le support DEAE Sephadex a un prix non négligeable : même support utilisé pendant 5 ans. Risque important de désorption Problèmes stériques Mauvaise orientation de l enzyme : perte d activité
Immobilisation d enzymes par liaison covalente Il est nécessaire d activer soit les groupements de l enzyme, soit ceux du support : - activation de l enzyme : perte d activité - il faut donc activer le support. A A A activation X X X + A X
La liaison covalente Très grande solidité de la liaison enzyme-support Grande variété de supports et de méthodes Rigidification de la structure tridimensionnelle : meilleure stabilité Complexité de la méthode. Modification de la structure de l enzyme : perte d activité Impossible de prévoir le rendement de greffage Supports présentant de mauvaises propriétés mécaniques