MERLET-BILLON Maryvonne PALAGI Alexandre STREK Laura GB4 2011-2012

TP de Microbiologie MERLET-BILLON Maryvonne PALAGI Alexandre STREK Laura GB4 2011-2012 1

ADN : Acide DésoxyriboNucléique ARN : Acide RiboNucléique BET : Bromure d Ethidium CaCl 2 : Chlorure de Calcium DO : Densité Optique LB : Lysogeny broth MgCl 2 : Chlorure de Magnésium NaCl : Chlorure de Sodium PCR : Polymerase Chain Reaction PSM : Poste de Sécurité Microbien U.V : Ultra Violet Abréviations 2

Introduction Au cours de ce TP nous avons eu à choisir les expériences et établir les protocoles que nous souhaitions réaliser. Nous avons décidé de suivre le cheminement suivant : Etablir des courbes de croissance de Bacillus subtilis en présence et en absence de différents sels Préparer une expérience de dénombrement sur Bacillus subtilis Analyser des prélèvements de surface que nous avons effectué sous une semelle de chaussure et au niveau d un interrupteur dans les toilettes des hommes Les prélèvements sont mis en culture de manière à obtenir des colonies isolées Une coloration de gram est réalisée pour chaque prélèvement Une PCR est réalisée pour chaque prélèvement Réaliser une série d expérience pour identifier une souche inconnue : Culture pour isolement PCR Galerie API 3

Protocoles I. Détermination de courbe de croissance de B. subtilis Nous avons choisi d étudier l effet de trois sels sur la croissance de la souche bactérienne Bacillus subtilis : le NaCl, le CaCl 2 et le MgCl 2. Suite à des recherches bibliographiques nous avons sélectionné les concentrations suivantes : 0,5 et 1,5M pour le NaCl préparées à partir d une solution mère à 5M 10 et 50mM pour le CaCl 2 et le MgCl 2 préparées à partir de solutions mères à 2M 10 tubes contenant 4mL de LB ont été préparés selon le tableau suivant : Numéro du tube et contenant Volume de LB enlevé Volume de solution ajouté Tube n 1 : contrôle LB pour CaCl 2 et MgCl 2 à 20µL 20µL d eau stérile 10mM Tube n 2 : contrôle LB pour CaCl 2 et MgCl 2 à 100µL 100µL d eau stérile 50mM Tube n 3 : contrôle LB pour NaCl à 0,5M 400µL 400µL d eau stérile Tube n 4 : contrôle LB pour NaCl à 1,5M 1,2mL 1,2mL d eau stérile Tube n 5 : NaCl à 0,5M 400µL 400µL de NaCl à 5M Tube n 6 : CaCl 2 à 50mM 100µL 100µL de CaCl 2 à 2M Tube n 7 : MgCl 2 à 10mM 20µL 20µL de MgCl 2 à 2M Tube n 8 : MgCl 2 à 50mM 100µL 100µL de MgCl 2 à 2M Tube n 9 : CaCl 2 à 10mM 20µL 20µL de CaCl 2 à 2M Tube n 10 : NaCl à 1,5M 1,2mL 1,2mL de NaCl à 5m Nous avons ensuite mesuré la turbidité de chaque échantillon en diluant 100µL dans 900µL de LB et ce toutes les demi-heures pendant 7h30. Nous avons tracé le graphe représentant la DO en fonction du temps pour chaque condition ainsi que log(do) en fonction du temps et calculé µmax (coefficient de la tangente lors de la 4

phase exponentielle de croissance) et le temps de génération ln(µmax)/2 à partir de ce dernier graphe. II. Détermination du nombre de bactérie d une solution inconnue A partir d une solution mère inconnue nous avons dénombré le nombre de bactérie par la technique des dilutions en séries : Nous avons effectué des dilutions en séries au 10 ème à partir de la solution mère, jusqu à une dilution finale de 1/10 6 : 100µl de la solution mère ont été prélevés, puis dilués dans 900µl d eau distillée stérile. De cette dilution de 1/10, 100µl ont été de nouveau prélevés et dilués dans 900µl d eau distillée stérile, pour une nouvelle solution concentrée au centième de la solution mère. Cette opération a été répétée jusqu à obtenir une concentration finale de 1/10 6. Pour chacune de ces dilutions, 100µl ont été étalés sur boite de gélose (LB agar), en condition stérile sous PSM (poste de sécurité microbien). Une fois ensemencées, les boites ont été placées en incubateur 24 heures. Pour faciliter les calculs, il est aisé de constater que l ensemencement correspond à une nouvelle dilution au 10 ème. Un comptage du nombre de colonie est effectué 24h après incubation, afin d estimer la quantité de bactérie par ml de la solution mère. Le schéma suivant, que nous avons réalisé, récapitule l expérience : 5

III. Prélèvements Pour réaliser les prélèvements de surface nous avons utilisé des écouvillons stériles. Nous avons effectué ces prélèvements sur des surfaces équivalentes d environ 3 à 4 cm 2. Les écouvillons ont ensuite été utilisés pour ensemencer trois boites de pétri successivement par la techniques des cadrans. Les boites sont utilisées pour les expériences suivantes après 24h et 48h d incubation à 37 C. IV. Coloration de gram sur E. coli, B. subtilis et les prélèvements Objectif : distinguer et classifier les bactéries à partir des propriétés de leur paroi bactérienne. Le violet de gentiane se fixe sur des composants cytoplasmiques et après ce temps de coloration, toutes les bactéries sont violettes. Chez les bactéries à Gram négatif, la paroi, riche en peptidoglycanes, laisse passer l acétone qui décolore le cytoplasme alors que, chez les bactéries à Gram positif, la paroi constitue une barrière imperméable et le cytoplasme demeure coloré en violet. Etapes à suivre : - Préparer un frottis fixé : déposer une goutte d eau stérile sur une lame puis ajouter à l anse de platine stérilisée une colonie isolée. Etaler et fixer à l alcool jusqu à obtenir une lame sèche. - Recouvrir la lame de violet de gentiane et laisser agir pendant 30 secondes. Rejeter le colorant et rincer à l eau déminéralisée. - Mordançage au lugol : recouvrir la lame de lugol et laisser agir pendant 30 secondes. Rincer à l eau déminéralisée. - Décoloration : recouvrir la lame d acétone et laisser agir 10 secondes. Rincer rapidement à l eau déminéralisée. - Recoloration : recouvrir la lame de safranine et laisser agir pendant 30 secondes. Rejeter le colorant et rincer légèrement à l eau déminéralisée. Sécher délicatement la lame avec du papier. - Observation au microscope. Ajouter une goutte d huile à immersion sur la lame pour l observation à l objectif 100. 6

V. Galeries API Objectif : Analyser le métabolisme d une colonie bactérienne isolée sur boite, afin de vérifier s il s agissait bien, ou non, d une colonie d Escherichia coli. Pour cela, nous avons utilisé une galerie API 20E (Biomérieux) se présentant sous la forme d une galerie de petits tubes en plastique contenant chacun un milieu différent déshydraté. Après inoculation et incubation durant 24H, la coloration des milieux sera révélatrice d une modification ou non d un composé donné par l organisme étudié. Les résultats obtenus sont ensuite reportés sur une fiche d identification, permettant d obtenir un code propre à la souche étudiée, et l identification se fait par consultation du catalogue de références fourni par Biomérieux. La galerie API 20E est une galerie dédiée à l identification des entérobactéries, et est relativement simple à mettre en place, mais nécessitant travailler en condition stérile puisqu une seule souche bactérienne ne peut être étudiée à la fois. Par manque de réactifs révélateurs, nous n avons pu analyser que la partie «métabolisme» dans partie des résultats. Protocole : Les étapes de réalisation d une galerie API, toutes en conditions stériles via bec benzène, sont décrites dans le manuel livré avec le kit, et sont résumés ci-dessous. - Répendre 5ml d eau distillée sur les alvéoles du fond de la boite d inoculation, pour créer une atmosphère humide. - Prélèvement d une colonie bactérienne jeune (18/24h) sur boite de gélose, avec une anse de platine. - Resuspension de la colonie prélevée dans 5ml d eau distillée stérile. - Inoculation de tous les puits à l aide de la même pipette (et même cône) : o Pour les tests CIT, VP et GEL, remplissage du tube et de la cupule. o Pour tous les autres, remplir les tubes mais pas les cupules. o Pour les tests ADH, LDC, ODC, H2S, URE, remplir la cupule avec de l huile de paraffine pour créer une anaérobiose. - Refermer la boite et incuber à 37 C environ (±2 C) pendant 18 à 24h. Le lendemain, la lecture de certains résultats passe par différents révélateurs à rajouter à certains puits, dont nous ne disposions malheureusement pas. D autres restent néanmoins directement lisibles : GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY, ARA. 7

VI. PCR sur colonie 1 ) Choix des amorces : Nous avions 6 amorces à notre disposition : Amorce 1: CCA GTT TCC AAT GAC CCT CCC C Amorce 2: AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG Amorce 3: AGC CCG GGG ATT TCA CAT CTG ACT TA Amorce 4: CTG CTC CCT CCC GTA G Amorce 5: AAG TCG AGC GGA CAG ATG G Amorce 6: GGA AGA AGC TTG CTT CTT TGC TGA C Pour chaque amorce nous avons lancé un BLAST afin de déterminer quels couples nous pouvions utiliser et pour quelles souches. Souche bactérienne Gène Amorce Reverse Amorce Forward Température de dénaturation Taille de l amplicon E. Coli 50 16S 3 78 C E. Coli 50 16S 6 74 C 544pb B. Subtilis JR5-5 16S 1 70 C B. Subtilis JR5-5 16S 2 60 C 645pb B. Subtilis JR5-5 16S 1 70 C B. Subtilis JR5-5 16S 5 60 C 594pb Pour mettre en évidence la présence d E. coli via la technique de PCR sur colonie, nous avons donc choisi les amorces 3 et 6. En effet, au sein de ce couple nous disposons d une amorce forward et d une amorce reverse codant pour l ARN 16S de la souche E. coli 50 et amplifiant un fragment d ADN de taille adéquate pour la réalisation d une PCR. En suivant le même 8

raisonnement que précédemment, nous avons choisi les couples d amorce 1 et 2 puis 1 et 5 pour détecter la présence de B. subtilis. Remarque : l amorce 4 ne correspondant pas à l une des souches bactériennes que nous étudions ici, nous ne l avons pas utilisée. 2 ) PCR Préparation du milieu réactionnel : Nous réalisons une PCR sur colonie, l ADN bactérien n a donc pas besoin d être extrait des bactéries car celles-ci seront lysées thermiquement lors de la réaction de PCR. Nous avons testé plusieurs conditions : - Tube 1 (contrôle négatif) : mix + A3/A6 - Tube 2 (contrôle négatif) : mix + A1/A2 - Tube 3 (contrôle négatif) : mix + A1/A5 - Tube 4 (contrôle positif) : mix + E. coli + A3/A6 - Tube 5 (contrôle positif) : mix + B. subtilis + A1/A2 - Tube 6 (contrôle positif) : mix + B. subtilis + A1/A5 - Tube 7 : mix + prélèvement 1 + A3/A6 - Tube 8 : mix + prélèvement 1 + A1/A2 - Tube 9 : mix + prélèvement 1 + A1/A5 - Tube 10 : mix + prélèvement 2 + A3/A6 - Tube 11 : mix + prélèvement 2 + A1/A2 - Tube 12 : mix + prélèvement 2 + A1/A5 La colonie présente dans le tube 4 appartient à la souche inconnue que nous avons identifiée comme étant E. coli grâce à la coloration de Gram et à la galerie API. Nous l utilisons dans un premier temps pour confirmer par PCR qu il s agit bien d une souche d E. coli et dans un second temps pour avoir un contrôle positif de la présence d E. coli. Pour chaque condition testée, le volume final de solution est de 25 µl. Nous avons préparé le mélange suivant : 9

Réactifs du mix PCR Concentration de la solution stock Concentration de la solution finale Volume à prélever (µl) Volume à prélever pour 13 tubes (µl) ThermoPrime 5U/µl 0,625 U 0,125 1,625 (Taq) Tampon de 10X 1X 2,5 32,5 réaction dntp Mix 20 mm 0,2 mm pour 1 13 chaque MgCl2 25 mm 2 mm (1,5 à 4 mm) 1,5 19,5 Amorce Forward 10 µm 0,5 µm 1,25 16,25 Amorce Reverse 10 µm 0,5 µm 1,25 16,25 Eau - - 17,375 225,875 A ce mélange est ajoutée une colonie bactérienne (E. coli ou B. subtilis selon les conditions). Remarquons que la Taq est ajoutée en dernier. Méthode de prélèvement de la colonie : on prélève stérilement avec un cure-dent une colonie bactérienne et on dépose dans le tube PCR contenant le mélange réactionnel, puis on mélange. Cycle de la PCR : - 94 C 2 minutes (lyse des bactéries et dénaturation initiale) x 1 cycle - 94 C 20 sec (dénaturation) - 60 C (B. Sub) 68 C (E. Coli) 40 secondes (hybridation) x 35 cycles - 72 C 40 secondes (élongation) - 72 C 5 minutes (élongation finale) x 1 cycle Pour amplifier l ADN bactérien d E. coli, nous avons choisi d effectuer l hybridation à 68 C car les amorces 3 et 6 ont une température de dénaturation élevée (74 C pour la 6 et 78 C pour la 3) et la température optimale de catalyse de la Taq est de 72 C, il convient donc de choisir une température relativement élevée. Pour amplifier l ADN de B. subtilis, nous avons choisi d effectuer l hybridation à 60 C car au sein de chaque couple nous disposons d une amorce ayant une température de dénaturation de 50 C et une autre ayant une température de dénaturation de 65 C. 10

Analyse par électrophorèse sur gel d agarose : Préparation du gel : rajouter 20 µl de BET au fond de la cuve, puis verser l agarose liquide, mélanger et placer délicatement le peigne. Préparation des échantillons : ajouter dans chaque échantillon du tampon de charge contenant du rouge crésol et du saccharose (volume 0,2 fois en volume final, soit 5 µl pour 25 µl). Mélanger. Dépôt des échantillons : Puits 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Echantillon Marqueur de taille 1 4 7 10 2 5 8 11 3 6 9 12 Migration puis révélation sous lecteur U.V. 11

Résultats et Discussion I. Courbes de croissance : Nous avons sélectionné les concentrations après des recherches bibliographiques (Shaheen et al. 2008, Donnellan et al. 1964, et Adinarayana et al. 2003). Selon ces publications la tolérance de B. subtilis au NaCl a été démontrée jusqu à 5M. Nous nous sommes donc placés un peu en dessous à 0,5M et 1,5M tout en sachant que notre milieu LB contenait entre 0,9M et 0,17M de NaCl. Nous avons également appris que B. subtilis était normalement cultivé dans un milieu contenant 10mM de CaCl 2 et 0,4mM de MgCl 2. Etant limité par le nombre de tubes de culture que nous pouvions utiliser (10 au total) nous avons donc choisis les mêmes concentrations pour ces deux sels : 10mM et 50mM. A partir des DO mesurées (Tableau 1) nous avons tracé les courbes de croissance (DO en fonction du temps) pour chaque condition (Figure 1) puis les graphes Ln(DO) en fonction du temps (Figure 2). Nous avons finalement calculé la pente de cette dernière droite (µmax) et le temps de génération pour chaque condition (ln(2)/µmax) (Tableau 2). a) Croissance de B. subtilis en présence de NaCl En présence de 0,5M et 1,5M de NaCl la croissance de B. subtilis est altérée par rapport à la condition contrôle. (Figure 1 A et B). Ceci se traduit par un temps de génération nettement inférieur, (113 minutes pour 0,5M) en particulier à 1,5M où la croissance est quasiment nulle (866 minutes) (Tableau 2). Il faut également noter ici que le temps de génération en condition contrôle n est pas représentatif de celui observé en général pour B. subtilis dans des conditions normales de culture qui est d environ 26 minutes. Ceci peut s expliquer par la mise au point de l expérience : nous avons choisi des concentrations élevées de NaCl et nous disposions d une solution mère liquide à 5M. Le volume à ajouter dans le milieu de culture était donc important et nous avons beaucoup dilué nos milieux de culture dans nos conditions contrôles. Il est fort probable que les bactéries n aient pas eu assez de nutriments pour croître de manière optimale. Pour éviter ce biais il faudrait utiliser du NaCl en poudre et le dissoudre directement dans le milieu. b) Croissance de B. subtilis en présence de MgCl 2 En présence de 10mM et 50mM de MgCl 2 la croissance de B. subtilis est légèrement diminuée (Figure 1 C et Figure 2 C et D). Son temps de génération est de 134% en présence de 10mM de MgCl 2 et de 192% en présence de 50mM de MgCl 2 (Tableau 2). 12

c) Croissance de B. subtilis en présence de CaCl2 Lors de cette expérience nous avons observé l apparition d un précipité dans le milieu. Ce phénomène est à prendre en compte car il augmente la turbidité du milieu. Pour contrebalancer ce biais nous aurions pu ajouter deux conditions sans bactérie avec les mêmes concentrations de CaCl 2. En présence de 10mM de CaCl 2 la croissance de B. subtilis est diminuée (Figure 1 C et 2 C) ce qui se traduit par un temps de génération de 205% (Tableau2). B. subtilis est normalement cultivée en présence de CaCl 2, nous pouvons supposer que la concentration dans notre milieu n était pas suffisante pour permettre une croissance optimale et même diminuer cette croissance. En effet nous pouvons observer qu à 50mM de CaCl 2 (Figure 1 D et 2 D) la croissance de B. subtilis est améliorée par rapport au contrôle : le temps de génération est de 71% (Tableau 2). Bien que nous ayons vu dans les publications que B. subtilis était cultivée en présence de CaCl 2 nous avons utilisé un milieu de culture générique, sur lequel un grand nombre de bactérie sont capables de croître. Ce milieu n était pas optimal pour notre souche. Pour avoir de meilleurs résultats concernant l effet de ces sels sur B. subtilis il aurait fallu cultiver notre souche dans un milieu plus spécifique. 13

Condition Equation de la droite Coefficient de corrélation µmax Temps de génération Contrôle 0,5M y = 0,0084x - 4,1878 R² = 0,9606 0,0084 min -1 82,5 minutes NaCl 0,5M y = 0,0061x - 4,4599 R² = 0,9191 0,0061 min -1 113 minutes Contrôle 1,5M y = 0,0077x - 4,2665 R² = 0,8778 0,0077 min -1 90 minutes NaCl 1,5M y = 0,0008x - 4,3011 R² = 0,0975 0,0008 min -1 866 minutes Contrôle 10mM y = 0,0211x - 6,1744 R² = 0,9887 0,0211 min -1 32,8 minutes CaCl 2 10mM y = 0,0103x - 5,1483 R² = 0,9762 0,0103 min -1 67,3 minutes MgCl 2 10mM y = 0,0157x - 5,6336 R² = 0,9984 0,0157 min -1 44,15 minutes Contrôle 50mM y = 0,0215x - 6,2925 R² = 0,9336 0,0215 min -1 32 minutes CaCl 2 50mM y = 0,0301x - 6,3486 R² = 0,9848 0,0301 min -1 23 minutes MgCl 2 50mM y = 0,0113x - 5,1052 R² = 0,9778 0,0113 min -1 61,34 minutes Tableau 2 : Récapitulatif des données de la figure X2 et calcul du temps de génération de B. subtilis. II. Prélèvements Nous avons effectué deux prélèvements : l un sous une semelle de chaussure et l autre sur l interrupteur des toilettes pour homme, puis nous avons cherché à identifier les bactéries présentes dans ces prélèvements. Pour cela, nous avons tout d abord réalisé une identification 14

bactérienne via une coloration de Gram, puis nous avons poursuivi l identification à l aide d une PCR sur colonie. a) Identification bactérienne du prélèvement effectué sous une semelle de chaussure : La coloration de Gram d une des colonies bactériennes obtenues après encensement sur boite de pétri et incubation du prélèvement, a révélé la présence de bacille Gram - (couleur rose) en forme de petits bâtonnets s agrégeant en chaîne (figure 3). Figure 3 : Observation au microscope (grossissement x100) d une coloration de Gram sur une colonie obtenue à partir du prélèvement effectué sous une semelle de chaussure. Ces bactéries étant des bacilles Gram -, elles peuvent appartenir à plusieurs espèces différentes. Sachant que pour la PCR nous avions à notre disposition des amorces permettant d identifier E. coli ou B. subtilis, cette technique nous aurait permis seulement de dire s il s agissait ou non d E. coli. Nous avons donc réalisé une PCR sur colonie à partir des amorces 3 et 6 codant pour l ARN 16S de la souche E. coli 50. Malheureusement, nous n avons obtenu aucun résultat. En effet, nous n avons pu observer de fluorescence sur le gel, pas même pour le marqueur de taille. Nous pensons donc que le BET utilisé a été excessivement exposé à la lumière avant que nous l utilisions, perdant ainsi son efficacité. b) Identification bactérienne du prélèvement effectué sur l interrupteur des toilettes pour homme : Dans le cas de ce prélèvement, la coloration de Gram a révélé la présence de coques Gram + en amas (Figure 4), pouvant correspondre à des staphylocoques ou des microcoques. Pour poursuivre l identification et préciser le genre, il aurait fallu réaliser une galerie API Staph. En effet, suite à des recherches effectuées sur internet, nous avons constaté une certaine similarité entre les staphylocoques et nos bactéries. 15

Figure 4 : Observation au microscope (grossissement x100) d une coloration de Gram sur une colonie obtenue à partir du prélèvement effectué sur l interrupteur des toilettes pour homme. III. Identification d une souche inconnue Pour préparer ce TP nous avions 3 solutions à notre disposition : Une solution de B. subtilis Une solution d E. coli Un mix des deux souches Ces solutions étaient numérotées et nous ne savions pas quelle solution contenait quelle souche. Nous avons donc décidé de réaliser un protocole d identification et nous avons choisi la solution n 1. Une partie de cette solution a été mise en culture de manière à obtenir dès 24h de croissance des colonies isolées. a) Coloration de Gram Après coloration de Gram nous avons observé la lame au microscope. Nous avons pu observer des bactéries Gram -, roses (donc avec une paroi plutôt pauvre en peptidoglycanes) et en forme de bâtonnets (figure 5). Au vue des solutions dont nous disposions nous avons supposé qu il s agissait d E. coli. Afin de confirmer cette hypothèse nous avons réalisé une galerie API. Figure 5 : Observation au microscope (grossissement x100) d une coloration de Gram sur des colonies de la solution 1. 16

b) Galeries API La galerie API 20E a été réalisée selon les recommandations du fournisseur et laissée en incubateur à 37 C environ 20h. L identification de notre souche n a été que partielle car nous n avions pas les réactifs nécessaires à l interprétation de certaines caractéristiques (figure 6 haut et bas, partie de droite). Cependant nous avons pu analyser la partie métabolique de la galerie API. En comparant nos résultats à ceux prédits par le fournisseur nous pouvons fortement penser que la souche présente dans la solution 1 est bien E. coli. En effet, bien que le tube ONPG se révèle négatif dans notre galerie, notre souche est capable de fermentation/oxydation : les tests concernant le glucose, le mannitol, le sorbitol, le rhamnose, le melibiose et l arabinose sont positifs. Figure 6 : Interprétation de la galerie API 20E, réalisée à partir de la solution 1. Tableau d identification du fournisseur (haut), galerie API (bas). IV. Détermination du nombre de bactérie dans une solution de B. subtilis Comme décrit dans le protocole nous avons mis en culture différentes dilutions de B. subtilis. Après 24h de culture nous avons observé les boîtes de pétri et sélectionné deux d entre elles afin de compter les colonies. La première boîte, correspondant à une dilution au 1/10 6 (figure 7 à droite) comportait 168 colonies. La seconde boîte, correspondant à une dilution au 1/10 7 (figure 7 à gauche) comportait 10 colonies. Pour ces dilutions ceci nous a ramené à 168 et 10 bactéries pour 100µL. Soit, 1680 et 100 bactéries par ml de chaque dilution et au final entre 1,68.10 7 et 10 7 bactéries dans la solution mère. Nous avions donc en moyenne 1,3.10 7 bactéries dans notre solution mère de B. subtilis 17

Figure 7 : observation de colonies de B. subtilis après 24h de culture. 18

Conclusion Lors de ce TP nous avons voulu établir des protocoles reflétant une démarche scientifique, par exemple avec la série d expériences que nous avons réalisées pour les prélèvements. Dans nos protocoles il y a cependant des points que nous pourrions améliorer : Utiliser des poudres de sels que nous diluerions directement dans le milieu de culture afin d éviter la dilution des nutriments de notre milieu. Envisager un contrôle spécifique pour l ajout de CaCl 2 dans le milieu puisque ce sel augmente la turbidité. Utiliser un milieu plus spécifique de notre culture bactérienne. Réaliser une galerie API Staph sur l un des prélèvements pour avoir une idée plus précise du genre de la bactérie. Réaliser des PCR pour confirmer certains résultats Pouvoir utiliser tous les réactifs nécessaires pour la galerie API 19

Bibliographie Influence of culture conditions on production and activity of proteases frome Bacillus subtilis BS1. Mussarat Shaheen, Aamer Ali Shah, Abdul Hameed, Fariha Hasan. Pak. J. Bot. 2008 Chemically defined synthetic media for sporulation and for germination and growth of Bacillus subtilis. Hillel S. Levinson J. Edward Donnellan Jr., Ella H. Nags. Journal of bacteriology 1964 Purification and partial characterization of thermostable serine alkaline protease form a newly islated Bacillus subtilis PE-11. Kunamneni Adinarayana, Poluri Ellaiah, and Davuluri Siva Prasad. AAPS PharmSciTech 2003. 20

Fiche financière Consommables : Matériels consommables Marque, fournisseur Quantité totale Quantité utilisée Prix total Amortissement Boîtes de pétri VWR 100 25 89,70 22,425 Milieu LB Grosseron 1L 200 ml 92,18 18,436 Gélose Cônes 1 ml Cônes 200 µl Cônes 20 µl PhysioCare concept PhysioCare concept PhysioCare concept 300 ml 10 x 1000 200 120 2,4 10 x 1000 400 104 0,416 10x384 30 540 4,21 Solution NaCl 5M Solution MgCl2 2M Solution CaCl2 2M VWR 1L 4mL 17,748 0,07 VWR 500mL 200µL 19,38 0,007 VWR 500mL 200µL 25,53 0,01 Ethanol 70% Sigma Aldrich 1L 10 ml 27,10 0,271 Kit galerie API E20 biomérieux (ref 20 100) 25 1 204,19 8,17 Kit PCR Quiagen 400 réactions 24 116 6,96 Tubes falcon 25 ml BD Biosciences 500 3 139 0,834 Eppendorfs 1,5 ml Ecouvillon stérile Jeulin 100 15 6,80 1,02 Grosseron 300 2 364,5 2,43 21

Huile à immersion Gurr Socimed 100mL 100µL 30,63 0,04 Paraffine Lelaborantin.fr 75m 1m 20 0,2 Total 67,899 Matériel Commun : Matériel Techne TC-4 000 (PCR) Vortex Bec Bunsen Incubateur Hotte à flux laminaire Spectrophotomètre WPA Autoclave 23L Microscope cyscope HP Pippette 100µL-1mL Marque/revendeur Prix Durée de vie Techne chez Grosseron Durée d utilisation Amortissement 4427 5 ans 3h 0,30 Grant-bio pv1 167 5 ans 1h 0,003 Sordalab 257 10 ans 1h 0,003 WiseCube 2962 10 ans 48h 1,62 Faster 5644 15 ans 72h 3,1 Biowave DNA 1961 10 ans 12h 0,54 Quirumed 1424 10 ans 72h 1,17 Partec 990 10 ans 1h 0,01 20-200µL/2µL-20µL Eppendorf 558 5 ans 72h 0,91 Pipette 0,1µL-2,5µL Lecteur UV Eppendorf 267 5 ans 24h 0,15 Major science 4706 5 ans 24h 2,58 22

Anse de platine UVDI Labomoderne (ref AP40051) 93,89 5 ans 72h 0,15 Total 10,536 Entre le matériel utilisé et le matériel commun notre TP a couté approximativement : 78,5 23

Fiches de sécurité Phrases de risques des produits utilisés pour les cultures et la réalisation des courbes de croissance : NaCl : R36 R37 R38 S26 S36 Irritant pour les yeux Irritant pour les voies respiratoires Irritant pour la peau En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement et abondamment avec de l eau, consulter un spécialiste Porter un vêtement de protection approprié CaCl : R36 S22 S24 H319 P280 Irritant pour les yeux Ne pas respirer les poussières Eviter le contact avec la peau Provoque une sévère irritation des yeux Porter des gants de protection/des vêtements de protection/un équipement de protection des yeux/du visage MgCl 2 : Si contact avec la peau laver à grandes eaux. Retirer les vêtements contaminés Si contact avec les yeux : laver à grandes eaux en gardant les paupières soulevées En cas d ingestion si malaise recourir à l assistance d un médecin Milieu LB : Pas de dangers dans les conditions normales d utilisation Ethanol à 70%: R11 inflammable Peut provoquer une irritation des yeux 24

Phrases de risques des réactifs utilisés pour la coloration de Gram : Acétone : R11 R36 R6 R67 Facilement inflammable Irritant pour les yeux L'exposition répétée peut provoquer dessèchement ou gerçures de la peau L'inhalation de vapeurs peut provoquer somnolence et vertiges Violet de gentiane : R22 R40 R41 S26 Nocif en cas d'ingestion Effet cancérogène suspecté preuves insuffisantes Risque de lésions oculaires graves En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement et abondamment avec de l'eau et consulter un spécialiste Safranine : R36 R38 Irritant pour les yeux Irritant pour la peau Lugol : Pas de dangers dans les conditions normales d utilisation Phrases de risques des réactifs utilisés pour la PCR : Bromure d éthidium : T+ Très toxique R 22 Nocif en cas d ingestion R 26 Très toxique par inhalation R 68 Possibilités d effets irréversibles S 26 En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement et abondamment avec de l eau, consulter un spécialiste S37 En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement et abondamment avec de l eau, consulter un spécialiste Bleu de bromophénol : R36 R38 Irritant pour les yeux Irritant pour la peau 25

Agarose : R36 R38 Irritant pour les yeux Irritant pour la peau EDTA : R36 S24 S26 Irritant pour les yeux Eviter le contact avec la peau En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement Acide borique : R 60 R61 S53 S45 Peut altérer la fertilité Risque pendant la grossesse d'effets néfastes pour l'enfant Éviter l'exposition - se procurer des instructions spéciales avant l'utilisation En cas d'accident ou de malaise, consulter immédiatement un médecin Tris (Hydroxyméthyle) Aminométhane : R36 R37 R38 S26 S36 Irritant pour les yeux les voies respiratoires Irritant pour la peau En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement consulter un ophtalmologiste Porter un vêtement de protection approprié 26