TP I 2 Organisation fonctionnelle de la cellule/ La cellule eucaryote 1- Membrane plasmique et membranes cellulaires La membrane plasmique forme la limite entre la cellule et son environnement. L ensemble des organites des cellules eucaryotes sont bordés par une ou plusieurs membranes qui les séparent du cytosol. Toutes les membranes cellulaires, y compris la membrane plasmique, possèdent une organisation biochimique proche. Les membranes cellulaires sont non colorées = invisibles en microscopie optique. Elles peuvent toutefois être localisées par la limitation des compartiments. Deux observations complémentaires de la membrane plasmique Croquis avec échelle de la cryofracture ayant donné la photo du bas Bilan : Organisation des membranes cellulaires. 1
2- Noyau Prélever l épiderme d une feuille d oignon blanc avec une pince. Colorer au vert de méthyl-pyronine pour mettre en évidence les acides nucléiques. Monter dans une goutte d eau distillée entre lame et lamelle. Observer. Le vert de méthyl colore l ADN en vert, la pyronine colore les ARN en rose. Enveloppe nucléaire vue en MET (coloration négative) Enveloppe nucléaire en cryofracture Pour étudier le rôle du noyau dans une cellule eucaryote, on réalise l expérience présentée page suivante. Cette expérience est une expérience de pulse-chase (pulse-chasse), qui consiste à cultiver des cellules vivantes pendant un temps court (ici 15 minutes, c est le pulse) dans un milieu contenant un précurseur radioactif (ici l uridine, précurseur des nucléotides à base uracile U de l ARN). Après un lavage qui élimine les précurseurs non utilisés par la cellule, on cultive les cellules vivantes pendant des temps variables en absence de molécules radioactives (c est la chasse). Analyser les résultats obtenus (page suivante). 2
Bilan noyau des cellules eucaryotes Le noyau contient l information génétique portée par des molécules d ADN linéaires, les chromosomes, associées à des protéines. L association ADN + protéines forme la chromatine visible en MET. L euchromatine, moins dense, contient de l ADN qui peut être transcrit ; l hétérochromatine, plus dense, contient de l ADN inactif, qui ne peut pas être transcrit. Des ARN produits par transcription sortent du noyau par les pores nucléaires. Les pores nucléaires permettent également l entrée de protéines dans le noyau (protéines de la réplication, de la transcription, constitutives de la chromatine.). L ensemble des échanges par les pores nucléaires sont contrôlés. 3- Organites semi-autonomes : mitochondries et plastes a) Organisation d une mitochondrie Equation bilan de la respiration cellulaire, p our un glucose : C 6 H 12 O 6 + 6 O 2 6 CO 2 + 6 H 2 O + formation de 36 ATP Schéma : 3
b) Organisation d un chloroplaste Les chloroplastes peuvent être observés dans les cellules de feuille d Elodée sans coloration : ils sont naturellement colorés en vert par les pigments chlorophylliens. On peut également les observer après coloration à l eau iodée : Prélever une jeune feuille d une pousse d Elodée, placer la feuille dans une goutte d eau iodée, recouvrir d une lamelle et observer. Estimer la taille d un chloroplaste. Légender la photo page suivante et indiquer une échelle de taille. L eau iodée colore l amidon (un polymère de stockage du glucose) en bleu marine. E quation bilan de la photosynthèse : 6 CO 2 + 6 H 2 O C 6 H 12 O 6 + 6 O 2 en presence de lumière et de chlorophylle Réalisez un schéma légendé de ce chloroplaste 4
Autres plastes Il existe différents types de plastes dans les cellules végétales, qui dérivent de la différenciation de proplastes incolores et peu différenciés. Chromoplastes Les chromoplastes sont des plastes spécialisés dans l accumulation de pigments jaune-orangé à rouge de nature lipidique : les caroténoïdes et les lycopènes. Ils sont souvent responsables de la couleur des fruits, comme les tomates ou les poivrons ou d'autres organes comme les carottes et plus rarement de la couleur des fleurs, comme les pétales du bouton d or (Ranunculus acris). Avec un scalpel, prélever une tranche très fine de chair de tomate (ou carotte ou poivron). Monter entre lame et lamelle dans une goutte d'eau distillée, écraser et observer. Légender la photo ci-dessous et mettre une échelle de taille. Leucoplastes Ces plastes sont des sites de réserves importantes. Amyloplastes accumulent de l'amidon; oléoplastes accumulent des lipides; protéoplastes accumulent des protéines. Avec un scalpel, prélever une tranche très fine de chair de banane (ou de pomme de terre). Placer la coupe réalisée dans une goutte d'eau iodée sur une lame. Recouvrir par une lamelle, écraser et observer les amyloplastes. Eventuellement, réaliser une observation d amyloplastes au microscope polarisant. Estimer la taille d un amyloplaste. Légender la photo ci-dessous et indiquer la taille de l organite. Chloroplastes Chromoplastes Amyloplastes 5
c) Particularités des plastes et des mitochondries = les organites semi-autonomes 1) Ils possèdent une information génétique propre sous forme d'un chromosome circulaire, et ils possèdent leur propre machinerie d expression génétique. Ceci leur permet de synthétiser de façon indépendante du noyau 5% de leurs protéines. Les autres constituants des mitochondries et chloroplastes sont codés dans le noyau de la cellule. 2) Ils se divisent par étranglement de façon autonome, indépendamment des mitoses cellulaires. Chromosome mitochondrial Division d un chloroplaste Bilan : Origine endo-symbiotique des organites semi-autonomes 4- Système endomembranaire = réticulum, Golgi Le système = réseau endomembranaire des cellules eucaryotes est constitué de membranes internes repliées, limitant des compartiments cellulaires en continuité. a) Le REG: réticulum endoplasmique granulaire ou RER : réticulum endoplasmique rugueux Le RER (REG) est constitué d un compartiment isolé par une membrane repliée en lamelles. La surface externe de sa membrane est recouverte de ribosomes. La surface du REG est ainsi le lieu de la synthèse de protéines, destinées à la membrane plasmique, à la sécrétion et aux différents compartiments du système endomembranaire. b) Le REL: réticulum endoplasmique lisse Le REL est en continuité avec le REG, mais la surface externe de sa membrane est dépourvue de ribosomes. Les REL est le site de synthèse des lipides, qui peuvent ensuite être exportés avec les autres compartiments. Le REL possède également une fonction de détoxification, en particulier au sein d'organes tels que le foie. 6
REG (barre = 1 µm) Schéma REG : REL c) L'appareil de Golgi L'appareil de Golgi est le lieu de transit des protéines synthétisées au niveau du REG. Il possède une très nette polarité et est en continuité avec le REG par les vésicules de transition, et avec la membrane plasmique, via les vésicules de sécrétion. L'ensemble du système RER-Golgi est le site de la maturation des protéines synthétisées, qui sont progressivement modifiées au cours de leur parcours pour arriver à leur forme active finale. A gauche, appareil de Golgi (MET 50 000) A droite, appareil de Golgi observé au MEB après cryofracture et cryodécapage Réalisez un schéma légendé de l appareil de Golgi 7
d) Etude expérimentale du fonctionnement du système endomembranaire Expérience de pulse-chase : Des cellules sécrétant des protéines (ici : des cellules pancréatiques qui sécrètent le suc digestif libéré dans le duodénum) sont mises en contact pendant 3 minutes avec un acide aminé radioactif (précurseur de la synthèse de protéines) : c est l étape du pulse. Puis les cellules sont lavées et placées en milieu non radioactif pendant un temps variable : c est l étape de la chasse. Au bout de différents temps de chasse, les cellules sont prélevées, et la radioactivité incorporée par les cellules est détectée par autoradiographie. Pulse seul : 3 min Chasse : 15 min Chasse : 120 min 8
Principe de l'autoradiographie Sachant que la synthèse de protéines est un processus continu dans les cellules, que va-t-il se passer pendant le pulse? Même question après le pulse (= après élimination des acides aminés radioactifs)? Que permet d'observer l'autoradiographie? Décrire les résultats observés, et conclure sur le trajet intracellulaire des protéines synthétisées par la cellule du pancréas. 5- Structure de la paroi des cellules végétales Réalisez un schéma légendé de la paroi des cellules végétales. Que sont les plasmodesmes? Paroi (microscope optique) Paroi (MET) Plasmodesmes (MET, barre = 0,1 µm) 9
6- Equilibre hydrique des cellules rôles de la paroi et de la vacuole a) Vacuole et équilibre hydrique des cellules végétales La vacuole est un grand compartiment central des cellules végétales, qui occupe jusqu à 80% du volume de la cellule. Elle est entourée d une simple membrane appelée tonoplaste. La vacuole contient de l eau, des ions et, éventuellement, des pigments solubles comme les anthocyanes (couleur rouge du chou, de la betterave, de l oignon rouge). - Elle qui assure le maintien et la croissance de la cellule par turgescence (voir ci-dessous) ; - Elle peut mettre en réserve différents métabolites : ions, vitamines, acides aminés ; - Elle peut jouer un rôle de loupe vis-à-vis de la lumière et favoriser la capture de l énergie lumineuse par les pigments photosynthétiques ; - Son ph est acide, environ 5, et elle contient également des hydrolases acides qui dégradent certains composés. Avec une pince, prélever l'épiderme de l'oignon rouge (chou rouge), et monter dans une goutte d'eau distillée entre lame et lamelle. Recommencer en plaçant l'épiderme dans une goutte de solution de saccharose 1 mol.l -1 entre lame et lamelle. Observer la vacuole colorée des cellules en présence et en absence de saccharose dans le milieu extracellulaire. Bilan : vacuole végétale et plasmolyse/turgescence b) Présence ou absence de paroi et équilibre hydrique Pour évaluer le rôle et l importance de la paroi des cellules végétales, réaliser une préparation de protoplastes (= cellules végétales dépourvues de paroi) selon le protocole suivant. Après observation des cellules végétales sans paroi (protoplastes), proposer un(des) rôle(s) pour la paroi. Protocole de préparation de protoplastes Avec une pince, ôter la couche épidermique d une feuille de poireau sur environ 1 cm 2. Découper le morceau de feuille de poireau dénudée et placer la face dénudée vers le bas, dans une boîte de Pétri contenant la solution enzymatique de digestion de la paroi. La face dénudée est ainsi au contact de la solution enzymatique (cette solution contient de la cellulase et d autres enzymes, qui dégradent les constituants pariétaux). Incuber 3h à 25 C. Gratter la surface du morceau de poireau, récupérer la suspension obtenue et observer quelques gouttes en chambre humide, selon le schéma suivant : Suspension de protoplastes lamelles lame 10
Réaliser 3 préparations de cellules de sang de Mammifère en plaçant les cellules dans 3 milieux différents : eau distillée, NaCl 12 g/l, NaCl 6 g/l, NaCl 3 g/l. Pour cela, préparer, par dilutions successives, 5 ml de chacune des solutions dans des tubes à essai. Lorsque les solutions sont prêtes, placer quelques gouttes de sang animal dans chaque tube. Observer l aspect du sang dilué à l œil nu puis l aspect des cellules au microscope. Interpréter. Bilan équilibre hydrique des cellules végétales et des cellules animales (à rédiger) 7- Endosomes, Lysosomes et Péroxysomes Les endosomes correspondent à des compartiments issus de l'endocytose de matériel extracellulaire. Endocytose: invagination de la membrane plasmique conduisant à la formation d'une vésicule intracellulaire. Ces endosomes sont limités par une simple membrane et sont un lieu de tri des molécules endocytées. Cellesci peuvent être réexpédiées vers la membrane plasmique et l'extérieur de la cellule, ou envoyées dans les lysosomes. Les lysosomes sont des compartiments des cellules animales à simple membrane qui contiennent de nombreuses enzymes de dégradation. La lumière des lysosomes est acide permettant l'activité des enzymes de dégradation. Les molécules organiques qui entrent dans les lysosomes sont entièrement dégradées et les métabolites obtenus peuvent être réutilisés par la cellule. Les péroxysomes sont des compartiments à simple membrane qui contiennent des enzymes catalysant des réactions d'oxydo-réduction. Ils sont présents dans toutes les cellules animales, et dans de nombreuses cellules végétales. Voie des endosomes / lysosomes 8- Jonctions entre cellules Dans les tissus animaux, les cellules voisines sont reliées entre elles par diverses structures qui assurent une cohérence de l'ensemble du tissu. Ces structures qui mettent en jeu deux cellules ou plus sont regroupées sous le terme générique de jonctions intercellulaires. Dans l'organisme, on trouve notamment les types de jonctions suivantes : les jonctions GAP, qui permettent des échanges (diamètre de 2nm, permet le passage de molécules de poids inférieur à 1200 D), les ceintures d adhérence (ZA), les desmosomes (D) permettant une cohésion mécanique et les jonctions serrées (TJ) qui constituent une barrière à la circulation des molécules entre les deux cellules et dans la membrane. Page suivante A gauche : *80000 Zone de contact entre deux cellules intestinales de rat. Staehelin, International review of cytology, vol 29, 1974 A droite : Répliques complémentaires de part et d autre d une zone de cryofracture : B et C sont des jonctions gap, D est une jonction serrée. Hépatocyte. chalcroft, the journal of cell biology, volume 47, 1970. Pages 49-60 11
Réalisez un schéma d interprétation montrant l organisation des jonctions serrées et GAP. Expliquer la différence entre A et A 9- Le cytosquelette Faire des hypothèses quant aux fonctions du cytosquelette dans la cellule Le cytosquelette comporte aussi des filaments d actine, des filaments intermédiaires mais ici on s intéresse aux microtubules de tubuline. Deux centrosomes dans une invagination du noyau (cellule animale). Ce sont les centres organisateurs des microtubules 12 (MTOC)