TD 5 : Génétique humaine Exercice 1 (pour se mettre en forme...). Une femme de vision normale dont le père est daltonien (maladie héréditaire récessive, caractérisée par un défaut de vision des couleurs, et qui est due à la mutation d'un gène localisé sur le chromosome X) se marie avec un homme dont le père est aussi daltonien. 1. Quelle est la probabilité pour qu'un enfant de cette femme soit daltonien? La grand-mère maternelle d'un homme avait une vision normale, son grandpère maternel était daltonien, sa mère était daltonienne et son père avait une vision normale. 2. Quels sont les génotypes concernant la vision des deux parents et grands parents? 3. Quel est le type de vision de cet homme? 4. Quel type de vision possèdent ses sœurs? Exercice 2. Le pedigree suivant est celui d'une famille chez laquelle de nombreux individus ont été atteints de cancers à des sites divers (C, cerveau, S, sein, TM, sarcome des tissus mous, Ov, ovaire, Os, ostéosarcome, L, leucémie). C S TM Ov C Os L TM 1. Que suggère ce pedigree quant à la susceptibilité de développer un cancer chez cette famille? Les personnes atteintes de tumeurs dans cette famille souffrent d'un syndrome de Li-Fraumeni, qui est défini par la susceptibilité héréditaire de développer certains cancers. Des analyses de liaison, effectuées dans plusieurs familles chez lesquelles ce syndrome est présent, ont montré une très forte liaison avec un marqueur microsatellite situé à proximité d'un gène codant une protéine appelée provisoirement TOTO (N.B. Le véritable nom de TOTO sera donné à la fin du TD... Pour éviter que la connaissance de son nom réel n'influe sur le raisonnement que vous devez avoir). Le séquençage du gène TOTO chez les personnes de ces familles ont révélé des mutations dans l'un des allèles de ce gène. 1
2. Proposez une (des) hypothèse(s) quant au rôle éventuel des allèles sauvage et mutants de TOTO dans le développement de tumeurs. Selon ces hypothèses, les mutations présentes chez les personnes atteintes du syndrome sont elles de type gain ou perte de fonction? Le gel ci-dessous présente l'analyse d'un marqueur microsatellite d'adn très proche du gène TOTO extrait à partir de tissu sain d'un homme non atteint par le syndrome (piste 1), de tissu sain (piste 2) et tumoral (piste 3) d'une femme atteinte par le syndrome, et de tissu sain (piste 4) et tumoral (piste 5) de leur enfant également atteint par le syndrome. 1 2 3 4 5 Direction de l'électrophorèse 3. Interprétez ces résultats. Quel allèle du microsatellite est-il associé développement de tumeurs? Quelle est la conséquence des "pertes d'hétérozygotie" observées dans les pistes 3 et 5? Quel(s) mécanisme(s) peuvent-ils conduire à cette perte d'hétérozygotie? Exercice 3. Le gel ci-dessous présente le profil de bandes observées pour un RFLP dans le gène TOTO, et deux RFLP à des loci de part et d'autre de ce gène, pour une famille chez laquelle le syndrome de Li-Fraumeni est présent. Le gel montre une mère atteinte (piste 1), un père non atteint (piste 2), et un fils atteint (piste 3). Les bandes AL et AS correspondent à un RFLP, avec les allèles AL et AS, et les bandes BL et BS correspondent à un autre RFLP avec les allèles BL et BS. Les bandes TOTO+ et TOTO- correspondent au RFLP pour TOTO. L'allèle sauvage donne la bande TOTO+ et l'allèle mutant, dans lequel est présent un élément transposable, donne la bande TOTO-. L'ordre des RFLP le long du chromosome est centromère-a- TOTO-B. 1. Déterminez quels allèles RFLP (AS ou AL, BS ou BL) sont liés à TOTO+ chez le fils. 2. Si l'adn de cellules tumorales du fils était testé pour ces RFLPs, à quel profil de bandes s'attendrait-on pour les cellules suivantes : (i), Cellules ayant perdu le chromosome portant TOTO+ et ayant subi une réduplication du chromosome portant TOTO- (ii), Cellules ayant subi une recombinaison mitotique dans l'intervalle centromère-a (iii), Cellules ayant subi une recombinaison mitotique dans l'intervalle A-TOTO (iv), Cellules présentant une nouvelle mutation non-sens dans l'allèle TOTO+ 2
(v), Cellules présentant une petite délétion qui élimine une partie de l'allèle TOTO sauvage AL AS 1 2 3 TOTO- TOTO+ Direction de l'électrophorèse BL BS 1 2 3 Exercice 4 (D'après Bendavid et al. 2006, Hum Genet 119, 1). L'holoprosencéphalie (HPE) est la cause la plus fréquente de malformations du cerveau antérieur chez l'humain. Lors de l'embryogenèse, le cerveau antérieur se divise normalement en deux hémisphères. L'holoprosencéphalie se caractérise par un défaut plus ou moins accentué de cette division. Les formes les plus sévères résultent en un hémisphère central unique, et il existe des formes moins sévères. La plupart des HPE entraînent un avortement, généralement spontané (le foetus atteint d'hpe n'étant pas viable), ou éventuellement provoqué (si l'hpe est détectée lors d'une échographie). Il existe également des naissances d'enfants HPE (1/16000), qui sont plus ou moins atteints. L'HPE peut être provoquée par des plusieurs facteurs, et en particulier par des mutations dans différents gènes. Des mutations ponctuelles dans l'un des 4 gènes SHH (sonic hedgehog), ZIC2, SIX3 et TGIF avaient été retrouvées chez 14% des foetus atteints d'hpe, ce qui implique que la cause de l'hpe chez 86% des foetus était inconnue. Dans l'article cité en référence, les auteurs utilisent la technique de QMPSF (quantitative multiplex PCR of short fluorescent fragments) pour estimer la quantité d'adn de chacun des 4 gènes SHH, ZIC2, SIX3 et TGIF, ainsi que du gène témoin HMBS, chez plusieurs individus. Dans une PCR "multiplexe", un ensemble d'oligonucléotides est utilisé permettant l'amplification simultanée de plusieurs (ici, 10) amplimères qui sont séparés les uns des autres et identifiés grâce à leur taille. Les tailles des fragments obtenus pour les différents amplimères sont données en table 1. La PCR multiplexe est faite, d'une part avec un témoin (personne saine) et d'autre part avec différents foetus HPE chez lesquels n'a été détectée aucune mutation dans l'un des 4 gènes cités plus haut. Après PCR, les amplimères sont marqués par un fluorophore et soumis à une électrophorèse capillaire ; à la fin de la migration, les amplimères sont détectés grâce à leur fluorescence. Les résultats sont donnés en figure 1 (a, b, c correspondent aux résultats obtenus avec 3 foetus différents). 1. Interprétez les résultats de la figure 1. 2. Comment ces résultats permettent ils de comprendre les causes de l'hpe chez des foetus chez lesquels elle était jusqu'ici incomprise? 3
Fig. 1 Detection of deletions in HPE genes by QMPSF. In each panel, the electrophoregram of the patient (in red) was superimposed to that of a control (in blue) and normalized on HMBS peak intensity. The amplicons corresponding to the primers listed in Table 1 are indicated by their product size (bp). Exercice 5 (D'après Aligianis et al. 2005, Nature Genet 37, 221... Partie du sujet d'examen deuxième session 2004-2005). Le syndrome de Warburg est caractérisé par des défauts de développement de l'œil, du système nerveux central et de l'appareil génital. Cette maladie humaine est transmise sur un mode autosomal récessif. Une première étude par analyse de liaison, effectuée chez plusieurs familles, a permis de localiser le locus responsable de ce syndrome dans la région 2q21.3. Afin de localiser ce locus plus précisément, les allèles d'un ensemble de marqueurs microsatellites ont été déterminés chez plusieurs personnes atteintes de ce syndrome (Figure 1). 4
Figure 1. Allèles de marqueurs microsatellites dans la région 2q21.3. Chacun des deux allèles (indiqués par des nombres à 3 chiffres) de chaque marqueur (Marker, D2S1241, D2S114...D2S2385) est donné pour chaque individu (notés K2, K3...K4). 1. Quelle est la caractéristique de la région entourée par les deux traits noirs? Pour quelle raison cette région est elle particulièrement intéressante? Que pouvez vous dire de la localisation du locus du syndrome de Warburg? La région mise en évidence précédemment contient 9 gènes. 2. Quelle stratégie ont pu utiliser les auteurs pour identifier le gène dont une mutation est responsable du syndrome de Warburg? 5