PHAGOCYTOSE PAR MICROSCOPIE A FLUORESCENCE CHEZ DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM - 1 -
1. Introduction Le but de ce projet est d étudier la phagocytose par microscopie fluorescente chez Dictyostelium discoideum. Ce dernier est considéré comme un organisme modèle car son comportement est proche de celui des organismes de défenses (macrophage etc ) mammifères. De plus, il est très facilement cultivable en laboratoire et peut donc être aisément employé dans les recherches. [1] Le Dictyostelium d. est une amibe sociale, c'est-à-dire qu elles sont capable de se regrouper et de survivre entre elles s il y a, par exemple, pénurie de nourriture. Le Dictyostelium d.vit sur le sol des forêts et ce nourrit par phagocytose. [2] Le processus de phagocytose est principalement utilisé par les cellules comme moyen de nutrition. Il consiste à ingérer des particules solides, contrairement à la pinocytose qui est l ingestion des liquides. Outre la fonction de nutrition, ce processus peut jouer le rôle de protection, ce que nous observons souvent avec les cellules telles que les macrophages, cellule dendritiques ou autres neutrophiles. [2] La phagocytose se déroule selon le schéma suivant. Tout d abord la cellule doit attirer et «fixer»à sa membrane la particule à ingérer. Pour se faire plusieurs protéines entre en jeux. Par la suite des pseudopodes se forment piégeant ainsi la particule et l internalisation de cette dernière à lieu. Il y a alors formation d un phagosome, particule entourée de la membrane de la cellule phagocytaire. Ce phagosome peut alors être digéré par les lysosomes de la cellule. Cela n est pas le cas dans le Dictyostelium d. la particule est simplement exocytée (en quelque sorte le processus inverse de la phagocytose). [3] Lors de ce TP la phagocytose sera observée par microscopie à fluorescence. Pour se faire deux souches de cellule sont utilisées. Une souche sauvage (wt) et une souche couplée à la protéine fluorescente qui marque l actine GreenFluorescenteProtein-ActinBindingDomain (GFP-ABD). Des levures sont alors mises en contact avec ces cellules et la phagocytose démarre. Elle sera stoppée et étudiée à trois temps différents (0, 30 et 90 minutes). Pour se faire deux technique de fixation sont utilisées : 1) la fixation chimique avec du PFA. 2). La congélation par méthanol. L inconvénient de la première méthode est qu une étape de perméabilisation est nécessaire, de plus la fixation est une fixation lente qui ne se fait pas sur le moment. Ces deux inconvénients ne sont pas présents dans la fixation au méthanol. Par contre cette méthode est difficile à effectuer, il faut pouvoir manipuler précisément et rapidement pour obtenir de bons résultats. Il faut par la suite blocker et laver les coverslips (petit disque en verre sur lesquelles se trouvent les cellules). Les cellules sont alors mises en présences d anticorps. Pour la souche wt il y a d abord un anticorps primaire, puis un secondaire contenant aussi le DAPI. Les anticorps permettront d observer la protéine VatA, qui est un domaine de la V- ATPase qui intervient sur la membrane du phagosome pour réguler l acidité durant la digestion, puis le DAPI permet de marqué l ADN et donc le noyau de la cellule. L observation de ce dernier permet de déterminer si la fixation c est effectuée correctement. La souche GFP-ABD étant déjà fluorescente, seul l ajout du DAPI est nécessaire. Finalement l analyse par microscopie fluorescente peut être effectuée. On observera de manière générale, la cellule en vert, les levures en rouge et le noyau en bleu. [2] - 2 -
2. Techniques La technique utilisée lors de ce TP pour observer la phagocytose chez Dictyostelium d. est la microscopie par fluorescence. Comme expliqué précédemment les cellules sont placées sur des coverslips dans un milieu nutritif liquide. A ce milieu sont ajoutées les levures qui seront phagocytées par les cellules cela pendant 15 minutes. Après 15 minutes deux coverslips sont retirés pour les mesures du temps 0. Ils sont déposé dans du PFA qui permet de fixer les cellules (de les tuer). Il s agit de la fixation chimique. Après 30 minutes dans le PFA les coverslips sont placé dans le PBS (un milieu liquide nettoyant). Il en sera de même pour les temps 30 et 90 minutes (ces valeurs correspondent au temps où les cellules sont laissées en contact des levures en y ajoutant les 15 minutes préalables). Cette fixation est lente et demande une étape de perméabilisation. Il y a alors une étape de blockage (PBS+FCS) et perméabilisation (Triton). La même procédure est à nouveau effectuée avec, cette fois-ci, une fixation au méthanol. Cette fixation est immédiate, car les cellules sont instantanément congelées une fois trempées dans le méthanol. Par contre la manipulation est délicate. De plus une fois congelée à -85 C, les cellules doivent être réchauffées à -35 C, pour permettre le remplacement de l eau par le méthanol. Il y a alors une étape de blockage (PBS+FCS). Par la suite, les cellules doivent être marquées pour être détectables à la microscopie par fluorescence. Pour se faire la souche wt est marquée par un anticorps primaire, des anticorps monoclonaux venant des souris et qui se lie à la protéine VatA. Après lavage au PBS les cellules sont en contact avec un anticorps secondaire (qui reconnait l anticorps primaire) qui est couplé à un fluorofore. Il s agit ici de l Alexa488 qui émet la couleur verte. La protéine V- ATPase (dont VatA est un sous-domaine) intervient pour la régulation de l acidité du phagosome. Il sera alors attendu de voir une couleur verte fortement présente sur la membrane du phagosome lors de la digestion. Elle est aussi présente sur la membrane de la vacuole contractile. Cette vacuole permet de réguler la pression osmotique. Pour la souche GFP-ABD, le marquage aux anticorps n est pas nécessaire, car l actine présente dans la cellule est déjà marquée au GFP une protéine qui émet aussi la couleur verte. En ce qui concerne les levures, celles-ci sont une souche mutante (cdc15) elles sont donc déjà marquées par un fluorofore qui émet une couleur rouge. De plus ces levures n auront pas une forme bien ronde, mais plutôt deux boules reliées. Pour terminer l ADN est aussi marqué, ce qui permettra d observer le noyau. Il sera marqué par le DAPI qui émet une couleur bleue. Dans la souche wt le DAPI est déjà contenu dans l anticorps secondaire et pour la souche GFP-ABD il y est ajouté. L observation du noyau permettra de vérifié si la fixation à bien fonctionné. Si les noyaux se retrouvent en forme d hexagone, c est que la fixation n a pas été optimale. On devrait observer des noyaux bien ronds et plus clairs aux extrémités. Les coverslips sont alors déposé sur des plaquettes de verres qui permettront l observation au microscope. [2] - 3 -
3. Résultats 3.1 Temps : 0 minute Image 1 : Souche Ax2 avec fixation au PFA C est une des seules mesures où la fixation à relativement bien fonctionné. On le voit à la forme des noyaux. Ils sont bien ronds et plus marqués au centre avec les bords clairs. Flèche bleue : Elle représente l ADN (donc le noyau) qui est marqué par le DAPI. Flèches vertes : Représentent les membranes de la cellule qui contiennent la protéine VatA. 1 et 2 sont des membranes entourant les levures, ces dernières sont déjà pahgocytées (membrane du phagosome). 3 Représente la vacuole contractile, certainement en train d expulser l eau. Flèches rouges : Cela correspond aux levures qui ont été phagocytées. 1 et 2 sont la même levure, car nous travaillons ici avec une souche mutée (cdc15). 3 est une autre cellule phagocytée. Image 2 : Vacuole d une cellule de souche Ax2 fixée au PFA à 0 minute Il s agit ici de la vacuole contractile d une cellule. Elle peut être observée car la V-ATPase est une protéine présente sur les membranes de dégradation (ce qui est le cas ici). VatA est marqué et est un sous domaine de la VATPase. -4-
Image 3 : Souche GFP-ABD avec fixation au MeOH La qualité de cette image ne nous permet pas d analyser grand-chose. On remarque simplement que plusieurs cellules sont déjà phagocytées. Image 4 : Souche GFP-ABD avec fixation au PFA Flèche verte : Elle représente les lamelipodes formés par les filaments d actines. Il faut beaucoup de filaments d où la couleur plus foncée. La cellule est en train de phagocyter la levure. Flèches rouges : 1 levure déjà phagocytée par une cellule. 2 et 3 correspondent à la même cellule en train d être internée. -5-
3.2 Temps : 30 minutes Image 5 : Souche Ax2 avec fixation au MeOH Beaucoup de levures sont déjà internées. Un zoom à été effectué sur une cellule (flèche jaune). Voir la photo suivante. Image 6 : Souche Ax2 avec fixation au MeOH Zoom sur une cellule Flèche bleue : représente le noyau de la cellule (ADN marqué au DAPI) Flèches rouges : elles correspondent à la cellule qui est internée et qui est digérée par la cellule. Flèche verte : correspond à la membrane du phagosome, plus foncé car la V-ATPase est recrutée (pour la dégradation) donc beaucoup de protéine VatA présente. -6-
Image 7 : Souche Ax2 avec fixation au PFA Flèche rouge : elle représente une cellule qui est certainement en train d être endocytée. On peut penser cela car il n y à pas de vert autour, correspondant à VatA, elle n a pas encore été recrutée pour la dégradation. Flèche jaune : montre la vacuole contractile d une cellule qui est cassée. Cela arrive souvent si les fixations ne sont optimales. Image 8 : Souche GFP-ABD avec fixation au MeOH Cette image est l une des rares où beaucoup de cellules sont encore présentes. Un zoom est effectué sur l une d elle (flèche jaune). Image 9 : Souche GFP-ABD avec fixation au MeOH Zoom sur une cellule On voit bien sur l image des noyaux que ceux-ci sont en forme d hexagone. Caractéristique d une fixation quoi n as pas bien fonctionné. Flèche verte : représente les filaments d actine fortement renforcé, car il s agit de lamelipodes permettant la phagocytose de la cellule (flèche rouge 1) Flèche rouge 2 : il s agit d une cellule déjà phagocytée. Il n y à pas de vert fortement présent autour car les filaments d actine ne sont pas renforcé dans la membrane du phagosome. On verrait fortement la membrane si VatA était marqué - 7 - (comme dans la souche Ax2)
3.3 Temps : 90 minutes Image 10 : Souche Ax2 avec fixation au MeOH Flèche jaune : représente la vacuole contractile en train d extraire de l eau (régulation de la pression osmotique) dans une cellule ne contenant pas de levure. Flèche rouge : levure en train d être certainement exocytée. Car il y à une forte présence de VatA (flèche verte) autour. VatA est utilisée pour la dégradation des levures, elle est donc présente au moment de l exocytose. Image 11 : Souche Ax2 avec fixation au PFA Flèche rouge : levure qui est en train d être exocytée. Flèche verte : forte présence de VatA -8-
Image 12 : Souche GFP-ABD avec fixation au MeOH Flèches jaunes : représentent deux cellules en train de phagocyter ou exocyter une levure. L actine (flèches vertes) étant fortement présente lors de ces 2 processus, on ne peut déterminer duquel il s agit. Cela dit par rapport au temps il serait plutôt attendu une exocytose. 4. Discussion et Conclusion L expérience n as pas été optimale. En effet, pour certaines mesures (Ax2 au MeOH à 0 min ; GFP au PFA à 30 min ; GFP au PFA à 90 min) nous n avons aucune image. Je pense que cela est principalement dû à une mauvaise manipulation des coverslips. Ces derniers doivent être placés avec le côté où se trouvent les cellules du côté de la plaque. Etant donné que l expérience est composée des beaucoup d étapes de lavage, de fixation etc je pense que les coverslips n ont pas été manipulés durant tout le long de la bonne manière. De plus, nous remarquons que les fixations effectuées n ont pas été réellement réussies. Cela est étudié, comme expliqué précédemment, par la forme des noyaux. Les mauvaises fixations induisent aussi le fait que les cellules soient totalement cassées. Ce qui est très souvent le cas dans notre expérience. Il est alors difficile de conclure qu elle méthode de fixation était la plus optimale lors de cette expérience. Il y a peut-être plus d efficacité pour la fixation au PFA, car plus facile à effectuer et c est sur cette fixation (Image 1) que nous observons les seuls noyaux avec la forme attendue. Normalement dans le cas idéal et théorique, nous devrions observer au temps 0 minute uniquement des levures qui seraient en train de se faire phagocyter. A 30 minutes, seulement des levures entièrement internées dans la cellule, période de digestion. Il s agit du phagosome. Finalement à 90 minutes, nous devrions voir toutes les levures en train d être exocytées. Ce n est pas le cas dans notre expérience. Il y à phagocytose quasiment à tous les temps, peut-être même à 90 minutes, puisque les levures ne sont pas dégradées dans le Dictyostelium d. après avoir été exocytées elles peuvent être à nouveau internées. De plus à 0 minute on observe, des levures déjà entièrement internées dans la cellule. Cela est certainement du au fait que les cellules sont déjà en contact avec les levures depuis 15 minutes. Il n y a donc pas une synchronisation exacte entre les cellules est c est pourquoi nous observons plusieurs stades de la phagocytose dans un même temps. On remarque encore que suivant le marquage utilisé on ne peut pas distinguer l endocytose de l exocytose. En effet en utilisant le marquage GFP-ABD, qui marque l actine, on ne voit pas la différence entre ces deux étapes. L actine étant effectivement fortement présente lors de ces deux moments. Par contre avec le marquage de VatA il est possible de les distinguer, étant donné que la protéine V-ATPase n est pas encore recrutée au moment de l endocytose. Mais elle sera encore présente pour l exocytose. -9-
5. Sources bibliographiques [1] UNIGE SCIENCES, Page du Docteur Thierry Soldati [en ligne]. Mise à jour le 03 juin 2009. http://www.unige.ch/sciences/chimie/enseignants/soldati_fr.php?port=last, (consulté le 03 mai 2010). [2] SOLDATI Thierry, Travaux pratiques de biochimie : Biochimistes 2 ème année, Fluorescence microscopy of Phagocytosis in Dictyostelium discoideum, 2010, pp.48 [3] WIKIPEDIA, Bienvenue sur Wikipédia le projet d encyclopédie libre que vous pouvez améliorer [en ligne]. http://fr.wikipedia.org/wiki/phagocytose (consulté le 03 mai 2010) "J'atteste que dans ce texte toute affirmation qui n'est pas le fruit de ma réflexion personnelle est attribuée à sa source et que tout passage recopié d'une autre source est en outre placé entre guillemets" Coralie Fournier - 10 -