Test d immunofluorescence (IF) 1.1 Prélèvement du cerveau et échantillonnage Avant toute manipulation, il est fondamental de s assurer que tout le personnel en contact avec un échantillon suspect soit vacciné contre la rage. De plus, chaque opérateur doit utiliser les EPI suivants : - Combinaison Tyvek - Masque avec filtre HEPA de type FFP2D (le seul masque qui confère une véritable protection) - Lunette de protection - Deux paires de gants en latex ou nitrile - Tablier de protection Désinfecter la table d autopsie à l aide d eau de javel à 3% (dilution qui assure une complète désinfection) et utiliser les instruments de nécropsie stériles. Attacher fermement l animal à la table d autopsie ou décapiter l animal. Dans ce dernier cas, bloquer la tête de l animal à l aide de pinces. Retirer la peau du crâne afin d exposer les muscles temporaux. Muscles temporaux Ouvrir le crâne au niveau oculaire et couper le long de l os temporal (photos 1, 2 et 3). 1/11
Photo 1- Première incision au niveau oculaire Photo 2- Incisions au niveau des os temporaux Photo 3- Exposition du cerveau Après avoir enlevé la calotte crânienne, utiliser des instruments propres pour les étapes suivantes. 2/11
Pratiquer une incision au niveau des méninges, à partir de la région médiane le long de chaque côté du sinus longitudinal (étape 1 sur la photo). 1 1 2 Pratiquer une deuxième incision perpendiculaire à la première et écarter les lambeaux méningés. En employant un autre jeu d instruments propres, couper à travers la substance médullaire avec un bistouri ou une paire de ciseaux, le plus bas possible, et soulever le cerveau, en procédant de l arrière vers l avant et enfin dégager la paire de nerfs crâniens (étape 2 sur la photo). Á la fin de l opération, faire rouler délicatement le cerveau dans un récipient en plastique stérile de sorte que la surface supérieure soit tournée vers l opérateur. 3/11
Couper transversalement le cerveau, à partir de la base (derrière le chiasma optique) et procéder vers le tiers inférieur de l hémisphère cérébral. Le troisième ventricule apparaît sur la surface disséquée; la corne d Ammon se reconnaît par sa forme en haricot de couleur blanchâtre. Procéder au prélèvement de la corne d Ammon, du Bulbe rachidien et du cervelet et les placer dans un récipient stérile en plastique. Inscrire sur celui-ci le numéro de l échantillon et le nom de l espèce. Cortex Cervelet Corne d'ammon Bulbe rachidien N.B : les échantillons en mauvais état (présence de moisissures) ne sont pas appropriés. Il est cependant conseillé de les analyser et de tenir compte de l état de l échantillon lors de l interprétation des résultats. Dans le cas d un échantillon négatif, il pourrait s agir d un faux négatif (détérioration de l antigène 4/11
nucleocapsidique). Il est alors conseillé d effectuer un second prélèvement (dans la mesure du possible), ou de préciser sur le rapport d analyse, l incertitude du résultat. 1.2 Préparation des lames Au moins une lame est préparée pour tous les mammifères terrestres et au moins 2 lames pour chaque exemplaire d animal domestique. Les contrôles positifs consistent en une lame comportant l impression du cerveau d une souris infectée par le virus challenge CVS-11. Le contrôle négatif consiste en une lame comportant l impression du cerveau d une souris saine. Chaque phase de la manipulation doit se dérouler IMPERATIVEMENT sous une HOTTE BIOLOGIQUE DE CLASSE II. 1.2.1 Méthode par impression Le cerveau doit être congelé. Effectuer une mince coupe de tissu cérébral et la disposer sur un morceau de papier filtre propre. 5/11
Une lame de microscope stérile est appliquée sur la tranche de section en exerçant une pression suffisante pour obtenir une fine couche de l échantillon sur la lame. Pratiquer 3 ou 4 impressions sur la même lame. Eliminez le tissu cérébral excédent en pressant très légèrement un morceau de papier filtre sur l échantillon. Faire sécher les lames à température ambiante pendant environ 10 minutes. 6/11
1.2.2 Méthode par étalement Placer un très petit fragment de tissu cérébral à l extrémité de la lame. Une autre lame est ensuite utilisée pour écraser la section de tissu contre la première lame. Etaler l échantillon d une façon homogène sur une petite portion de la lame. Prendre soin de ne pas utiliser un fragment de tissu trop grand, ce qui entraînerait la formation d une couche trop épaisse rendant impossible la coloration et l examen microscopique (la méthode par impression donne néanmoins des résultats supérieurs). 1.3 Fixation Après séchage, les lames contenant les échantillons et les lames de contrôle positif et négatif sont immergées dans l acétone pure froide pendant 1 heure à température ambiante (sous la hotte chimique). Utiliser un Bac de Hellendhal (précédemment conservé au congélateur pour éviter qu il ne se brise lors de l ajout de l acétone) pour la fixation. 7/11
Bac de Hellendhal Récipient en verre N.B : Le contrôle positif sera fixé séparément afin d éviter les contaminations entre lames contenant les échantillons à tester et le contrôle positif. Retirer les lames de l acétone et sécher les lames à température ambiante pendant 30 min (sous la hotte chimique). 1.4 Coloration en immunofluorescence Calculer le volume total nécessaire de conjugué en multipliant le nombre de lames qui seront analysées par la quantité qui sera distribuée sur chaque lame (20 µl). Nb de lames x 20= volume total (µl) de conjugué nécessaires pour la séance de travail. Á ce volume, ajouter la quantité nécessaire de bleu de Evans pour obtenir une dilution 1:20. Par exemple, pour un volume total de conjugué de 100 µl, 5 µl de bleu de Evans à 1% sera ajouté). Ajouter 20 µl de conjugué (+bleu d Evans) sur chaque lame. Incuber les lames pendant 30 min à 37 C en chambre humidifiée afin d éviter le séchage du conjugué. 1.5 Lavage Après incubation, les lames sont lavées deux fois au PBS (5 min pour chaque lavage) et une fois à l eau distillée pendant quelques secondes. Egoutter les lames sur du papier filtre. Une fois sèches, une goutte de glycérol est ajoutée à chaque lame Appliquer délicatement la lamelle sur la lame port objet, tout en évitant la formation de bulles. 8/11
1.6 Lecture au microscope Il permet l examen de tissu cérébral frais, congelé ou glycérolé. Le principe est de faire réagir des anticorps marqués (isothiocyanate de fluorescéine) avec un antigène spécifique (si présent) et observer la réaction sous microscope à fluorescence. Cette technique permet l identification de la nucléoprotéine du virus de la rage généralement abondant dans les cellules infectées. Principe de l immunofluorescence Ce test diagnostic est de haute précision et garantie une très haute sensibilité et spécificité. Les résultats sont disponibles entre 1 heure et demi à deux heures après la réception de la carcasse. Il existe un grand nombre d anticorps polyclonaux et monoclonaux dans le commerce. Le laboratoire est libre de choisir celui qui lui convient le mieux en prêtant attention à la dilution à appliquer au produit avant utilisation. L utilisation du conjugué anti-nucléocapside rabique (polyclonal) correspond au protocole utilisé par le laboratoire IZSVe (Centre de référence FAO pour la rage). 9/11
Ce conjugué anti-nucléocapside contient des anticorps polyclonaux marqués qui se dirigent contre le complexe ribo-nucléoprotéique du virus rabique. Les lames de contrôle sont examinées avant les lames contenant les échantillons. Cela permet de garantir le bon fonctionnement de l équipement ainsi qu une coloration convenablement des lames. Le contrôle positif et les lames tests contenant l antigène de la rage présenteront des structures vert brillant ou vert-jaunâtre fluorescentes. Une séance de diagnostic n est valide que si : - La fluorescence est détectée sur la lame de contrôle positif. - Aucune fluorescence n est détectée sur la lame de contrôle négatif. Echantillon positif Echantillon négatif X 200 X 200 X 200 10/11
Matériel, équipement et réactifs 1. Matériel - Echantillons de tissu cérébral à tester pour le diagnostic de rage - Tissu cérébral de souris infectées par CVS -11 (témoin positif pour le diagnostic des mammifères terrestres) - Tissu cérébral de souris non infectées (témoin négatif pour le diagnostic des mammifères terrestres et chauve-souris) 2. Equipment - Lames porte-objets et lamelles couvre objet Micropipettes et cônes stériles - Bac de Hellendhal - Microscope optique à fluorescence - Thermostat à 37 C (± 2 C) - Blouse, masque, lunettes et gants - Hotte à flux laminaire de Type II 3. Réactifs PBS (ph= 7.2-7.4) stérile; (conserver réfrigéré à 4 C) NaCl g 8.0 KH 2 PO 4 g 0.2 KH 2 PO 4 12 H 2 O g 2.9 KCl g 0.2 En 1000 ml d eau distillée - Eau distillée sterile - Acétone non diluée - Conjugué fluorescent polyclonal (conjugué anti nucléocapside lyophilisé) N.B : après resuspension, la solution peut être stockée pendant 15 jours à 4 C dans le noir - Glycérol : fluide de montage à base glycérol (30%) - Solution de bleu de Evans 11/11 X 200