PRINCIPE MICROSCOPIE CONFOCALE Un microscope confocal est un système pour lequel l'illumination et la détection sont limités à un même volume de taille réduite (1). L'image confocale (ou coupe optique) est ensuite obtenue par le déplacement de ce point de focalisation de la lumière d'excitation dans les trois dimensions de l'échantillon XYZ (2). (1) Décrite pour la première fois par Minsky en 1957, la technique d'imagerie confocale de fluorescence représente une avancée technologique importante puisqu'elle permet d'obtenir des images de grande résolution. Ces images sont comme des coupes "optiques" d'une épaisseur d'environ 0.4µm, et peuvent être obtenues à différents niveaux dans l'épaisseur d'un échantillon. Basée sur l'élimination des signaux de fluorescence provenant des régions situées en dehors du plan focal, cette technique donne ainsi accès à des informations situées à l'intérieur des cellules. Depuis le modèle d'étude de Minsky qui utilisait une lumière d'excitation diffuse générée par une lampe (plus une fenêtre), deux évolutions technologiques ont contribuées à l'augmentation de la résolution des images confocales: L'utilisation d'un laser comme source d'excitation constitue une source de lumière facilement focalisable. En effet, la lumière laser est cohérente, unidirectionnelle et composée d'une ou plusieurs couleurs très pures (ondes de même fréquence et parfaitement en phase). L'utilisation d'objectif possédant une grande ouverture numérique (N.A, numerical aperture) assure une focalisation de la source lumineuse en un point de petite taille. Il existe aujourd'hui deux types de systèmes confocaux : Le système confocal multiphoton utilise des lumières d'excitation dans l'infrarouge. Dans ce cas, seul le point de focalisation du faisceau laser est excitateur (densité de photon suffisante pour coupler l'énergie d'excitation). Ce système est considéré comme une évolution technologique importante pour trois raisons majeures : o Il ne nécessite pas d'iris confocal. o L'utilisation d'une lumière d'excitation à une longueur d'onde élevée (>900nm) assure une plus grande pénétration à l'intérieur de l'échantillon (jusqu'à 500µm au lieu de 150µm) offrant la possibilité de travailler sur des échantillons plus épais. o L'excitation des fluorophores étant limitée au point de focalisation du faisceau laser, le risque de photoblanchiement est réduit. En pratique, le rendement d'émission de fluorescence est moins bon qu'un confocal simple photon et le rapport signal/bruit est plus faible. Ainsi, il ne montre que peu d'avantage pour l'observation de cellules en culture ou de coupes de tissu (50-70µm d'épaisseur).
Le système confocal simple photon utilise une lumière d'excitation dont la longueur d'onde excite directement le fluorophore. Ainsi, la fluorescence émise peut provenir de toute l'épaisseur de l'échantillon traversée par le faisceau laser. L'élément clé de ce microscope confocal est alors représenté par une fenêtre (ou iris confocal) placée devant le photodétecteur qui élimine la fluorescence provenant des régions non focales. L'observation de signaux fluorescents repose sur quatre éléments clés : 1) une source de lumière pour l'excitation, 2) un fluorophore, 3) des filtres pour séparer les photons d'émission des photons d'excitation, 4) un détecteur qui enregistre l'émission de photon et transforme ce signal lumineux en signal électrique ou en image photographique. Pour la microscopie confocale, la lumière d'excitation est délivrée par un laser et la détection est assurée soit par une caméra CCD haute sensibilité soit par des photomultiplicateurs. Les schémas représentés sur les figures 1 et 2 décrivent le principe d'obtention du "voxel" (élément unitaire de l'image confocale). Dans le système en épifluorescence, l'objectif joue à la fois le rôle de condenseur (condense la lumière d'excitation en un point très petit de l'échantillon) et de lentille (recueille la fluorescence émise par ce même point et la focalise sur un autre foyer placé devant le photodétecteur). Cette configuration en épifluorescence assure l'illumination et la détection exacte du même point de l'échantillon (point focal) Un miroir polychroïque est placé de façon à séparer la lumière d'excitation de la lumière d'émission. Il est indispensable pour sélectionner le signal spécifique délivré par le fluorophore. La lumière d'excitation est ainsi reflétée vers l'échantillon alors que la lumière d'émission (? plus élevée) provenant de l'échantillon est transmise vers le photodétecteur. Afin d'obtenir une "coupe optique" de l'échantillon, il ne faut recueillir au niveau du photomultiplicateur (détecteur) que la lumière émise à partir du point focal. Ceci est assuré par un diaphragme en trou d'épingle, placé au point de focalisation de la fluorescence émise à partir du plan focal (figure 1). Ce diaphragme (ou iris confocal) bloque la quasi totalité des rayons lumineux provenant des plans de l'échantillon situés au-dessus et au-dessous du plan focal (figure 2). Ainsi, plus son ouverture est réduite, meilleure est la résolution spatiale de l'image dans l'épaisseur (Z). L'élément unitaire de l'image confocale est ainsi représenté par le "voxel" (équivallent du pixel en 3D) ; la taille du voxel (X,Y,Z) définit la résolution spatiale de l'image plan (X,Y) et son épaisseur (Z). Elle peut atteindre 0.16µm sur l'axe X,Y (résolution latérale) et 0.40µm sur l'axe Z (résolution axiale) pour un objectif 60X (N.A 1.4). (2) Construction des images confocales 2D/3D Il est important de comprendre qu'une image confocale n'est pas une photographie instantanée. Ainsi, dans la majorité des systèmes, la préparation doit être illuminée point par point par le faisceau laser, de façon successive grâce au mécanisme de balayage (CLSM : confocal laser scanning microscope) et au déplacement vertical de l'objectif (voir figure 3). L'obtention d'une image
confocale nécessite donc une reconstitution en différé des signaux détectés pour chaque point (élément unitaire = voxel) et leur représentation dans une position spatiale équivalente. Microscope confocal de type spinning disk Les effets phototoxiques induits par l'excitation laser rendent critique l'utilisation du microscope confocal à balayage laser pour l'observation des cellules vivantes. Ainsi, des données récentes prouvent les dommages de l illumination laser sur le déroulement du cycle cellulaire. Nos études sur des cellules sanguines tumorales confirment que la mobilité cellulaire est grandement affectée par la lumière laser. Le photoblanchiement représente le second obstacle rencontré pour l enregistrement d échantillons fluorescents. L utilisation d anti-oxydants sur les échantillons fixés réduit ce phénomène mais cette protection est difficile à appliquer lorsque l on s intéresse à étudier les cellules vivantes. Enfin, l étude des cellules vivantes requière un système d enregistrement rapide, compatible avec la dynamique des évènements d intérêt. Ainsi, dans le cas des cellules vivantes, les protocoles expérimentaux nécessitent l'acquisition d'un grand nombre d'images, en 3D et au cours du temps. Ils requièrent une technologie spécifique basée sur une minimisation de l'excitation lumineuse et une optimisation de la détection du signal fluorescent avec une caméra rapide (30-60 images/sec) et de haute sensibilité (EMCCD). C est ce que propose la technologie basée sur le disque de Nipkow. Ce disque contient environ 20.000 trous. A chaque instant, le faisceau laser est ainsi divisé en un millier de faisceaux (http://www.andor.com/microscopy_systems/techniques/confocal_scanning/) réduisant le temps d acquisition et l intensité d excitatio
Figure 1 Figure 2
Figure 3