iq-check Quanti Legionella spp.

Certification dans le cadre de la marque NF Validation iq-check Quanti Legionella spp. n attestation BRD 07/15-12/07 pour la recherche et le dénombrement des Légionelles dans les eaux de réseau chaudes et les tours aéroréfrigérantes Rapport de Synthèse

SOMMAIRE 1 INTRODUCTION... 3 1.1 PRINCIPE DE LA METHODE IQ-CHECK QUANTI LEGIONELLA SPP... 3 1.2 HISTORIQUE DE LA VALIDATION... 4 1.3 MODIFICATIONS INTERVENUES DEPUIS LA VALIDATION INITIALE... 4 1.3.1 Modification du référentiel de validation... 4 1.3.2 Modification de la méthode alternative... 4 2 PERFORMANCES DU KIT IQ-CHECK QUANTI LEGIONELLA SPP.... 4 2.1 RACCORDEMENT DE LA SOLUTION CALIBRANTE ET DU MATERIAU DE REFERENCE A L'ETALON PRIMAIRE... 5 2.1.1 Raccordement sur CFX96... 5 2.1.2 Raccordement sur Chromo4... 5 2.2 FONCTION DE CALIBRAGE... 6 2.3 LIMITE DE DETECTION DE LA PCR (LDPCR) / LIMITE DE QUANTIFICATION SUR THERMOCYCLEUR CFX96... 7 2.3.1 Evaluation de la limite de détection... 7 2.3.2 Evaluation de la limite de quantification... 7 2.4 ETUDE DU RENDEMENT ET DE LA ROBUSTESSE DE L'EXTRACTION... 7 2.5 SELECTIVITE : INCLUSIVITE ET EXCLUSIVITE... 8 2.5.1 Protocole pour l'inclusivité... 8 2.5.2 Protocole pour l'exclusivité... 8 2.5.3 Conclusion... 8 2.6 PRATICABILITE... 9 2.7 ETUDE INTERLABORATOIRE... 11 2.7.1 2.7.2 2.7.3 2.7.4 2.7.5 Objectif... 11 Plan d'essai... 11 Contrôle de la qualité des matériaux... 12 Exploitation statistique des données... 12 Résultats... 12 3 CONCLUSION... 14 2 / 14

Etudes réalisées par : EUROFINS IPL Nord (anciennement IPL santé, environnement durables Nord) Plate-forme de technologie et innovation en microbiologie 1 rue du Professeur Calmette 59046 LILLE cedex EUROFINS Environnement 9, avenue de la Laponie 91140 Les Ullis pour : BIO-RAD 3 bd Raymond Poincaré 92 430 Marnes-La-Coquette 1 Introduction Le présent rapport de synthèse rassemble l'ensemble des données actualisées relatives à l'utilisation du kit iq- Check Quanti Legionella spp. : données issues de la validation initiale (2007) et données issues de l'étude complémentaire pour la reconduction de la validation, demandée avec modification (2011). 1.1 Principe de la méthode iq-check Quanti Legionella spp. Le kit iq-check Quanti Legionella spp. est un kit destiné à la détection ou la quantification des Légionelles dans les échantillons d'eau, à l'aide de la réaction de polymérisation en chaine (PCR) en temps réel qui permet à des séquences d'adn spécifiques du genre Legionella d'être amplifiées et détectées grâce à des sondes fluorescentes. Les résultats sont obtenus en moins de 3 heures après les étapes de filtration de l'échantillon d'eau et d'extraction de l'adn via le kit Aquadien. L'extraction d'adn repose sur une lyse alcaline et un choc thermique suivi d'une purification par ultrafiltration. Une fraction de cet ADN est ensuite utilisée pour être amplifiée spécifiquement par PCR en temps réel. Au cours de la réaction de PCR, les amorces s'hybrident à la région cible. La Taq DNA polymérase utilise alors ces amorces et les desoxynucléotides triphosphates (dntps) pour élonger l'adn, créant des copies de l'adn cible de Legionella spp., les amplicons. Pendant la PCR, la sonde oligonucléotidique spécifique s'hybride aux amplicons. Cette sonde est marquée par le fluorophore FAM qui émet de la fluorescence uniquement après hybridation aux amplicons. En présence d'adn cible dans l'échantillon, l'intensité de la fluorescence croit proportionnellement à l'augmentation de la quantité de produits amplifiés. La fluorescence est mesurée directement par le module optique du thermocycleur pendant l'étape d'hybridation. Le logiciel associé à l'appareil affiche en temps réel l'intensité de la fluorescence mesurée en fonction du nombre de cycles d'amplification. Pour chaque réaction, le logiciel détermine un Ct, cycle à partir duquel la fluorescence s'élève significativement au-dessus du bruit de fond. La lecture des valeurs des Ct permet de détecter la présence des séquences d'adn cibles de Legionella spp., qui signale la présence de la bactérie dans l'échantillon d'eau d'origine. La quantification est possible en utilisant les solutions d'adn calibré iq-check Legionella Quantification Standards au cours de l'étape d'amplification par comparaison des résultats à la droite de calibrage obtenue avec ces standards utilisés au cours de l'étape d'amplification, et fournis dans le kit. Pour chaque échantillon, un ADN synthétique servant de contrôle interne est inclus dans la solution d'amplification pour détecter d'éventuels phénomènes d'inhibition de la réaction d'amplification. Le contrôle interne est amplifié en même temps que les séquences cibles de Legionella spp., et avec les mêmes amorces, mais il est détecté par une sonde marquée avec un fluorophore différent (Canal HEX). Les réactifs et la méthode sont optimisés pour une utilisation avec la gamme de thermocycleurs Bio-Rad. 3 / 14

Une extension a été apportée le 4 avril 2012. Elle concerne la possibilité d utiliser le thermocycleur CFX96 Deep Well Touch. Les modifications des caractéristiques de ce thermocycleur étant considérées comme mineures et sans impact sur les performances du kit, aucun essai complémentaire n a été réalisé. Les performances du bloc chauffant et du système optique ont déjà été évaluées sur les précédentes versions de thermocycleurs validés. Le tableau ci-dessous reprend les caractéristiques des différentes versions validées : Logiciel Version actuelle validée (reconduction 10/06/2011) Opticon Monitor 3.4 v 1.1 CFX Manager Software Industrial Diagnostic Edition Nouvelle version validée (extension 04/04/2012) v 1.2 CFX Manager Software Industrial Diagnostic Edition Changement (s), - Nouveaux tests multiplexes ajoutés (3 couleurs) * - Pilote la nouvelle version du thermocycleur en temps réel (cidessous) * Chassis PTC-200 C1000 C1000 Touch L interface utilisateur actuelle (clavier et écran) évolue vers un écran tactile * Tête optique / Bloc chauffant Chromo4 CFX96 CFX96 Deep Well Le bloc chauffant peut maintenant accepter un volume réactionnel de PCR plus grand (jusqu à 120µL), à l identique du bloc chauffant Chromo4 * : ne s appliquent pas à l instrument Chromo4 Impact pour le client - Les thermoprofils des kits actuels n ont pas changé - L algorithme d analyse n a pas changé - Le logiciel permet de gérer les instruments actuels, (CFX96) et les nouveaux (cidessous) Les utilisateurs de l application «Legionella» n'utilisent pas cette fonctionnalité, car l'instrument est piloté par le logiciel / informatique porté par l ordinateur - Le système optique est identique sur les 3 appareils - Les utilisateurs utiliseront le même volume réactionnel (50µL) dans les mêmes consommables plastiques qu avant 1.2 Historique de la validation Le kit iq-check Quanti Legionella spp. est validé depuis 2007 avec le certificat de validation n BRD 07/15-12/07 pour la détection et la quantification de Legionella spp. par concentration et amplification génique par réaction en chaîne de polymérisation (PCR) en temps réel, selon le référentiel de validation des méthodes commerciales de détection et de dénombrement de Legionella spp. et Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction en chaîne de polymérisation (PCR). L'étude initiale s'est déroulée en 3 phases : les deux premières pour l'évaluation des performances analytiques du kit iq-check Quanti Legionella spp annoncées par le fournisseur, et la troisième correspondant à l'étude interlaboratoire pour évaluer la fidélité en terme de répétabilité et reproductibilité de la méthode. L'étude de reconduction de juin 2011 fait suite à des modifications apportées à la fois au kit validé et au protocole de validation (révision 1, prenant en compte la norme NF T90-471 publiée en avril 2010). Elle consistait à renouveler les essais des deux premières phases du plan de validation, afin de vérifier les performances annoncées par le fournisseur pour la nouvelle formulation du kit iq-check Quanti Legionella spp. sur un nouveau thermocycleur, le CFX96, en tenant compte des nouvelles exigences normatives. L'étude interlaboratoire (réalisée en 2007) n'a pas été refaite. 1.3 Modifications intervenues depuis la validation initiale 1.3.1 Modification du référentiel de validation

La reconduction a été réalisée en tenant compte des exigences et plans d'expérience définis dans la nouvelle version du référentiel de validation «Protocole de validation pour les méthodes commerciales de détection et de dénombrement de Legionella spp. et Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction en chaîne de polymérisation (PCR)», révision 1, (version adoptée en janvier 2011 par AFNOR Certification) et sur les modes de calcul décrits dans la norme AFNOR NF T 90-471 : 2010, pour le dénombrement de Legionella et Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction en chaîne de polymérisation (PCR) en temps réel. 1.3.2 Modification de la méthode alternative Le kit iq-check Quanti Legionella spp. présente deux changements. L'origine de la Taq polymerase est différente. Au niveau de la chimie des sondes du contrôle interne, le fluorophore TEXAS RED est remplacé par le fluorophore HEX. Le kit Aquadien, pour l'extraction de l'adn, permet dans sa nouvelle version, deux modalités d'utilisation selon la filtrabilité des échantillons : un protocole classique et un protocole W2 pour échantillons colmatant. L'étape de purification de l'adn repose sur le principe la microfiltration double-tangentielle qui remplace le principe de la microfiltration horizontale initialement proposé. Les membranes et matériaux restent de même composition. Un nouveau thermocylcleur BioRad est testé : le CFX96. 2 Performances du kit iq-check Quanti Legionella spp. Les performances de la méthode (raccordement à l'étalon primaire, fonction de calibrage limites de détection et de quantification de l'étape PCR, linéarité, rendement et robustesse de l'extraction avec le kit Aquadien ) et la sélectivité, la praticabilité et la qualité des réactifs ont été évaluées avec la nouvelle version des kits d'extraction et d'amplification. Les résultats de l'étude interlaboratoire ont été obtenus lors de l'étude de validation initiale, avec les premières versions des kits d'extraction et d'amplification. 4 / 14

2.1 Raccordement de la solution calibrante et du matériau de référence à l'étalon primaire 2.1.1 Raccordement sur CFX96 Le raccordement de la solution calibrante de travail à l'étalon primaire est effectué pour couvrir le domaine de quantification avec 3 gammes de solutions d'adn calibré iq-check Legionella Quantification Standards, fourni avec le kit iq-check Quanti Legionella spp. et comprenant 4 niveaux de concentration d'unités génomes de Legionella pneumophila (QS1, QS2, QS3 et QS4), et 3 gammes indépendantes d'étalon primaire préparées en ciblant les 4 niveaux de concentration de la gamme d'adn calibré iq-check Legionella Quantification Standards. Le raccordement du matériau de référence à l'étalon primaire a été évalué en analysant les résultats de deux dépôts du matériau de référence fourni avec le kit iq-check Quanti Legionella spp.. Les 6 gammes indépendantes obtenues et le matériau de référence ont été analysées avec le kit iq-check Quanti Legionella spp. au cours de la même série d'amplifications sur le thermocycleur CFX96. Les paramètres analysés pour évaluer le raccordement des solutions calibrantes et du matériau de référence à l'étalon primaire sur le thermocycleur CFX96 sont repris dans le tableau suivant. Droite de régression Corrélation r 2 Efficacité (%) Gamme de référence C(t) moyen = -3,198.log(x) + 39,076 0,998 105,5 Solution calibrante Erreur de calibrage Erreur de calibrage QS1 QS2 QS3 QS4 par niveau 0,07 0,20 0,14 0,07 moyenne 0,12 Equivalence des pentes 0,00 Matériau de référence Erreur de calibrage Erreur de calibrage 0,19 L'erreur de calibrage de la solution calibrante est inférieure à 0,15 log. Les pentes de la gamme de référence et de la solution calibrante sont équivalentes. L'erreur de calibrage du matériau de référence est inférieure à 0,3 log. La solution calibrante et le matériau de référence du kit iq-check Quanti Legionella spp. satisfont les conditions de raccordement à l'étalon primaire sur le thermocycleur CFX96. 2.1.2 Raccordement sur Chromo4 Le raccordement de la solution calibrante de travail à l'étalon primaire est effectué pour couvrir le domaine de quantification avec 3 gammes de solutions d'adn calibré iq-check Legionella Quantification Standards, fourni avec le kit iq-check Quanti Legionella spp. et comprenant 4 niveaux de concentration d'unités génomes de Legionella pneumophila (QS1, QS2, QS3 et QS4), et 3 gammes indépendantes d'étalon primaire préparées en ciblant les 4 niveaux de concentration de la gamme d'adn calibré iq-check Legionella Quantification Standards. Le raccordement du matériau de référence à l'étalon primaire est évalué en analysant les résultats de deux dépôts du matériau de référence fourni avec le kit iq-check Quanti Legionella spp.. Les 6 gammes indépendantes obtenues et le matériau de référence ont été analysées avec le kit iq-check Quanti Legionella spp. au cours de la même série d'amplifications sur le thermocycleur Chromo4. Les paramètres analysés pour évaluer le raccordement des solutions calibrantes et du matériau de référence à l'étalon primaire sur le thermocycleur Chromo 4 sont repris dans le tableau ci-après. 5 / 14

Droite de régression Corrélation r 2 Efficacité (%) Gamme de référence C(t) moyen = -2,891.log(x) + 38,674 0,995 121,75 Solution calibrante Erreur de calibrage Erreur de calibrage QS1 QS2 QS3 QS4 par niveau 0,03 0,30 0,23 0,16 moyenne 0,18 Equivalence des pentes 0,13 Matériau de référence Erreur de calibrage Erreur de calibrage 0,19 L'erreur de calibrage de la solution calibrante est de 0,18 log. Néanmoins, l'équivalence des pentes de la gamme de référence et de la solution calibrante est vérifiée (différence pour les niveaux extrêmes de 0,13). L'erreur de calibrage du matériau de référence est inférieure à 0,3 log. La solution calibrante du kit iq-check Quanti Legionella spp. satisfait globalement les conditions de raccordement à l'étalon primaire sur le thermocycleur Chromo 4. Le matériau de référence du kit iq-check Quanti Legionella spp. satisfait les conditions de raccordement à l'étalon primaire sur le thermocycleur Chromo 4. 2.2 Fonction de calibrage L'étude de la fonction de calibrage est réalisée en déposant 5 fois la gamme de solutions d'adn calibré iq- Check Legionella Quantification Standards (comprenant les 4 niveaux de concentration d'unités génomes de Legionella pneumophila), fournie avec le kit iq-check Quanti Legionella spp.. Les 5 mesures ont été effectuées avec le kit iq-check Quanti Legionella spp. pour chaque niveau de concentration dans des conditions de reproductibilité. Dans ces conditions, l'équation de la droite de régression et l'efficacité de la réaction de PCR ont été définis. Droite de régression C(t) moyen = -3,197.log(x) + 41,347 Efficacité e 105,5% Les performances de la régression linaire ont été estimées, leurs valeurs sont présentées dans le tableau suivant. QS1 QS2 QS3 QS4 Biais 0,06-0,10 0,00 0,04 Ecart type S 0,12 0,06 0,08 0,05 Exactitude de linéarité E LIN 0,13 0,12 0,08 0,07 Incertitude de linéarité U LIN 0,42 0,37 0,27 0,22 Pour chacun des niveaux de la gamme, la régression linéaire satisfait l'exigence d'exactitude inférieure à 0,15. La linéarité est donc vérifiée sur tout le domaine couvert par la gamme de solutions d'adn calibré iq-check Legionella Quantification Standards fournie avec le kit iq-check Quanti Legionella spp.. 6 / 14

2.3 Limite de détection de la PCR (LDPCR) / Limite de quantification sur thermocycleur CFX96 2.3.1 Evaluation de la limite de détection La limite de détection a été évaluée à partir de l'analyse de 30 dilutions indépendantes d'adn de L. pneumophila à 5 UG par PCR. Les 30 suspensions d'adn ont toutes été analysées en duplicat au cours du même run avec le kit iq-check Quanti Legionella spp.. Les résultats de l'ensemble des 30 duplicats analysés sont positifs. La limite de détection du kit Q-Check Quanti Legionella spp. est validée à 5UG/PCR. 2.3.2 Evaluation de la limite de quantification La limite de quantification a été évaluée en analysant 30 dilutions indépendantes d'adn de L. pneumophila à 15 UG par PCR. Les 30 solutions ont été amplifiées simultanément en duplicat avec le kit iq-check Quanti Legionella spp.. La vérification de la limite de quantification consiste à s'assurer que l'exactitude au niveau de la limite de quantification (E LQ ) est inférieure à la valeur critique de 0,15. Le tableau ci-après résume l'ensemble des valeurs obtenues suite à l'amplification de 30 dilutions indépendantes d'adn de L. pneumophila à 15 UG par PCR avec le kit iq-check Quanti Legionella spp. Résultats Valeurs théoriques ou critères de validation Moyenne x' 1,309 1,279 Log (UG/puits) Ecart-type s 0,097 Log (UG/puits) Biais 0,030 Exactitude de LQ E LQ Incertitude de la LQ U LQ 0,101 0,207 0,15 L'exactitude de la limite de quantification (E LQ ) estimée à 0,101 est inférieure à la valeur critique de 0,15. La limite de quantification à 15 UG du kit iq-check Quanti Legionella spp est donc vérifiée. 2.4 Etude du rendement et de la robustesse de l'extraction L'étude du rendement et de la robustesse a été réalisée avec le kit d'extraction Aquadien pour les échantillons d'eau. L'alternative W2 du protocole d'extraction Aquadien recommandée pour l'analyse des échantillons colmatant a également été étudiée en termes de performances. Pour chaque protocole d'extraction envisagé, l'étude du rendement a été effectuée sur 10 échantillons indépendants, artificiellement contaminés, à deux niveaux de contamination (1000 et 100 000 UG par PCR) et pour 3 matrices différentes (Eau stérile, Eau chaude sanitaire, Eau de tour aéro-réfrigérante) soit 60 échantillons au total pour chaque protocole. L'absence d'acides nucléiques de Legionella a été préalablement vérifiée sur chacune des trois matrices «eau». Les échantillons ont été artificiellement contaminés par une suspension mère de la souche de L. pneumophila ATCC 33152 dont la concentration en UG/L a été déterminée par 3 quantifications, après une étape d'extraction de l'adn par le protocole de lyse directe sur 3 aliquots. 7 / 14

Les analyses des échantillons artificiellement contaminés ont été effectuées en utilisant le kit iq-check Quanti Legionella spp. en conditions de reproductibilité. Le tableau ci-dessous reprend les résultats obtenus. Rendement Matrice Niveaux testés Protocole Aquadien Protocole Aquadien W2 Log Moyenne (Log) Log Moyenne (Log) Eau chaude sanitaire 1000 UG / L 100 000 UG / L -0,29-0,34-0,39-0,16-0,30-0,45 Eau de tour aéroréfrigérante 1000 UG / L 100 000 UG / L -0,09-0,20-0,31-0,45-0,46-0,47 Eau minérale 1000 UG / L 100 000 UG / L -0,25-0,33-0,42-0,55-0,50-0,46 Rendement moyen (log) -0,29-0,41 Variance (log) 0,04 0,03 Incertitude globale élargie (log) 0,71 0,89 L'étude du rendement et de la robustesse de la méthode permet d'évaluer le rendement moyen de la méthode Aquadien à -0,29 log et celui de la méthode Aquadien W2 (échantillon colmatant) à -0,41, avec des variances proches de 0, et une incertitude globale inférieure à 0,9, quel que soit le protocole d'extraction. 2.5 Sélectivité : inclusivité et exclusivité Pour chacune des souches testées, l'adn a été extrait à partir d'une suspension bactérienne pure en utilisant le protocole d'extraction Aquadien option W2 pour échantillon colmatant. 2.5.1 Protocole pour l'inclusivité Les essais d'inclusivité ont été réalisés sur des extraits d'adn à une concentration d'environ 100 UG/puits, estimée à partir de la suspension bactérienne par une mesure de la DO à 600 nm. Les extraits d'adn des 15 souches Legionella pneumophila sérogroupes 1 à 15, et les extraits d'adn de 20 autres souches appartenant au genre Legionella ont été amplifiés avec le kit iq-check Quanti Legionella spp.. 2.5.2 Protocole pour l'exclusivité Les essais d'exclusivité ont été réalisés sur des extraits d'adn à une concentration d'environ 10 000 UG/puits, estimée à partir de la suspension bactérienne par une mesure de la DO à 600nm. Les extraits d'adn de 16 micro-organismes reconnus comme n'appartenant pas au genre Legionella ont été testés avec le kit iq-check Quanti Legionella spp.. 2.5.3 Conclusion Les ADN des 35 souches Legionella testées ont tous été détectés suite à l'extraction Aquadien-W2 et l'amplification avec le kit iq-check Quanti Legionella spp.. Parmi les 16 extraits d'adn testés, appartenant à d'autres genres que Legionella, 5 extraits ont été amplifiés mais à des niveaux très faibles, la quantité initiale étant estimée au plus à 3,02.10-2 UG/puits. Les autres extraits n'ont conduit à aucune réaction croisée (absence d'amplification). La sélectivité du kit iq-check Quanti Legionella spp. est satisfaisante. 8 / 14

2.6 Praticabilité La praticabilité est étudiée en fonction des 18 critères définis par le bureau technique. 1- Mode de conditionnement des éléments de la méthode (cf notice paragraphe III.2.) 2- Volume des réactifs (cf notice et emballage des flacons) Le kit iq-check Quanti Legionella spp. est constitué : - de sondes fluorescentes (1 tube - 0,55 ml - avec bouchon violet) - de solution d'amplification (2 tubes - 2 x 2,2 ml) - de contrôle de PCR négatif (1 tube - 0,5 ml - avec bouchon vert) - de contrôle de PCR positif (1 tube - 0,25 ml - avec bouchon rouge) - d'un matériau de référence (1 tube - 0,08 ml - avec bouchon bleu) indépendant de la gamme de calibrage, relié à l'etalon Primaire - d'un tube de chaque point de la gamme de calibrage (Standard de PCR QS) QS1 : 1 tube - 0,08 ml - avec bouchon blanc QS2 : 1 tube - 0,08 ml - avec bouchon jaune QS3 : 1 tube - 0,08 ml - avec bouchon orange QS4 : 1 tube - 0,08 ml - avec bouchon rouge - d'une carte de calibration Chaque kit iq-check Quanti Legionella spp. permet l'amplification de 43 échantillons au maximum. Le kit Aquadien est constitué : - de solution de lyse R1 (2 flacons de 100 ml) - de solution de lavage et d'élution R2 (1 flacon de 25 ml) - de cryotubes (2 sachets de 50 unités) - de colonnes de purification (96 unités) - de flacons de récupération (192 unités) - optionnel : réactif W2 pour l'extraction d'échantillons colmatant. - d'une notice. Chaque kit Aquadien permet l'extraction d'adn de 96 échantillons d'eau au maximum. 3- Condition de stockage des éléments - Péremption des produits non ouverts (cf notice IV) Le stockage doit être réalisé entre 2 et 8 C. Dans ces conditions de stockage, chaque réactif peut être utilisé jusqu'à la date de péremption indiquée. Les durées de péremption figurent en clair sur chacun des flacons et tubes constituant les kits. 4- Modalités d'utilisation après première utilisation (cf notice) Chacun des réactifs du kit doit être conservé entre 2 et 8 C avant et après ouverture. 5- Equipements ou locaux spécifiques nécessaires (cf notice) Parmi l'équipement nécessaire, il faut : Pour l'extraction avec le kit Aquadien: - une rampe de filtration - un bain-marie - une centrifugeuse équipée d'un rotor pour tubes de 1,5-2 ml, et pour dispenser des centrifugations à 6000g Pour l'amplification avec le kit iq-check Quanti Legionella spp.: - des micropipettes - un thermocycleur (CFX96, Chromo4) - un logiciel de traitement du signal (CFX Manager Software Industrial Diagnostic) 9 / 14

6- Réactifs prêts à l'emploi ou à reconstituer (cf notice) Tous les réactifs constituant les 2 kits sont livrés à une concentration prête à l'emploi. 7- Durée de formation de l'opérateur non initié à la méthode Pour un opérateur formé aux techniques de biologie moléculaire, la formation à l'utilisation du kit iq Check Legionella spp. nécessite moins de 1 jour. 8- Temps réel de manipulation - Flexibilité de la méthode par rapport au nombre d'échantillons à analyser Etapes Filtration de l'échantillon Extraction de l'adn - kit Aquadien (option W2 pour échantillon colmatant) Préparation pour l'amplification Temps moyen pour 1 échantillon (min) 2 (20)* 5 (6) 14 Temps moyen pour 30 échantillons (min)* 40 120-43 Analyse des résultats TOTAL (par échantillon) * temps moyen pour l'analyse d'échantillons non colmatant 2 23 minutes (42 minutes) 16 8 minutes Les données indiquées entre parenthèses correspondent à des temps moyens pour l'analyse d'échantillons colmatants. L'intérêt de la méthode réside notamment dans le gain de temps associé à la possibilité d'analyser de grandes séries d'échantillons. 9- Délai d'obtention des résultats Les résultats de l'analyse sont obtenus dans les 5 heures pour 1 échantillon, qu'il s'agisse d'un résultat positif ou négatif. 10-. Type de qualification de l'opérateur L'opérateur doit être qualifié à la fois pour la filtration d'échantillons d'eaux pour la recherche de Legionella et pour les techniques de biologie moléculaire en générale. 11- Traçabilité des résultats d'analyse Sur CFX96, l'analyse des données est réalisée automatiquement par le logiciel CFX Manager Industrial Edition. Les résultats des amplifications sont conservés dans le logiciel. A l'issue d'un run, l'ensemble des résultats (valeurs et courbes) est accessible via ce logiciel. Un rapport peut être édité sous format pdf sur la base d'une interprétation automatique des données (échantillons et contrôles) Une version papier du rapport peut être conservée par le laboratoire. Il est également possible d'interpréter manuellement les résultats de l'amplification. 10 / 14

12- Maintenance par le laboratoire Le thermocycleur CFX96 ne fait pas l'objet d'une maintenance par le laboratoire lui-même. 13- Volume minimal à pipeter Le volume minimal à pipeter est fixé à 5 µl. 14- Stabilité des réactifs et des gammes Les réactifs sont considérés stables jusqu'à leur date de péremption dans des conditions de conservation conformes aux conditions de stockage définies au paragraphe 3-. 15- UNG (prévention des contaminations) Aucune mention 16- Protection des réactifs aux UV L'ensemble des réactifs peut être conservés dans les emballages carton d'origine, à l'abri de la lumière. 17- Contrôle externe quantitatif de la PCR Le kit iq Check Legionella spp. est livré avec un matériau de référence qui est un ADN calibré indépendant de la gamme de standards de quantification, et est relié à l'étalon primaire. 18- Contrôle d'absence d'inhibiteur Un ADN synthétique sert de contrôle interne d'inhibition. Il est inclus à la solution d'amplification et doit être utilisé au cours de chaque réaction d'amplification par PCR. Ce contrôle est amplifié simultanément et avec les mêmes amorces que celles utilisées pour les séquences cibles de Legionella spp., la sonde associée est en revanche différente, elle est marquée par un fluorophore propre (canal HEX). 2.7 Etude interlaboratoire 2.7.1 Objectif La finalité de cette étude est d'évaluer la fidélité (répétabilité et reproductibilité) des kits iq Check Check L. pneumophila : - pour l'étape d'amplification génique seule (dosage de solutions d'adn prêtes à amplifier) ; - pour l'ensemble de l'analyse (concentration, lyse, extraction, purification et amplification génique) sur des suspensions bactériennes caractérisées ; - pour l'ensemble de l'analyse en situation réelle (eau chaude sanitaire naturellement contaminée, choisie pour sa représentativité). 2.7.2 Plan d'essai Le plan d'essai reposait sur l'envoi simultané de 6 matériaux à 14 laboratoires indépendants situés dans 5 pays. Les deux premiers matériaux, notés «solution d'adn A» et «solution d'adn B», ont été préparés par dilution d'une même solution mère contenant deux extraits purifiés d'adn (méthode Aquadien ) de Legionella pneumophila sérogroupe 1 (souche ATCC 33152) et de Legionella anisa (souche CIP 103870). 11 / 14

Deux autres matériaux, notés «suspension S1» et «suspension S2», ont été préparés à partir d'une même suspension mère réalisée à partir d - une culture de L. pneumophila sérogroupe 1 (souche ATCC 33152) ; - une culture de L. anisa (souche CIP 103870) ; - une culture d'escherichia coli (souche CIP 54.8). Le cinquième matériau, noté «échantillon naturel EN», était une eau chaude sanitaire naturellement contaminée en L. pneumophila et Legionella non pneumophila. Ces flacons ont alternativement été étiquetés «D» et «E». Le dernier matériau, noté «contrôle négatif Cnég» était une eau exempte d'adn de Legionella. Les flacons de ce lot ont tous été étiquetés «ENC». 2.7.3 Contrôle de la qualité des matériaux Les solutions d'adn A et B ont fait l'objet d'un contrôle d'homogénéité de lot. Les suspensions S1 et S2, l'échantillon naturel EN, et le contrôle négatif Cnég ont fait l'objet d'un contrôle d'homogénéité et de stabilité de lot. 2.7.4 Exploitation statistique des données L'exploitation complète a consisté en l'ajustement de la dispersion des données observées à un modèle linéaire intégrant des variables aléatoires Normales. 2.7.5 Résultats 2.7.5.1 Contrôle de la qualité des matériaux Les 6 matériaux présentaient un niveau satisfaisant d'homogénéité de lot et de stabilité. 2.7.5.2 Répétabilité (r) et Reproductibilité (R) Le tableau ci-après présente les résultats obtenus par les 13 laboratoires participant retenus (données non exploitables pour 1 laboratoire). 12 / 14

UG Résultat Log (UG) Lim inf 809 2,91 Moyenne 1037 3,02 Lim sup 1328 3,12 ADN A Ratio (r) 1,5 0,18 Ecart-type (r) 186 0,06 Ratio (R) 2,7 0,43 Ecart-type (R) 321 0,14 Lim inf 809 2,91 Moyenne 1037 3,02 Lim sup 1328 3,12 ADN B Ratio (r) 1,5 0,18 Ecart-type (r) 186 0,06 Ratio (R) 2,7 0,43 Ecart-type (R) 321 0,14 Lim inf 809 2,91 Moyenne 1037 3,02 Lim sup 1328 3,12 Suspension S1 Ratio (r) 1,5 0,18 Ecart-type (r) 186 0,06 Ratio (R) 2,7 0,43 Ecart-type (R) 321 0,14 Lim inf 809 2,91 Moyenne 1037 3,02 Lim sup 1328 3,12 Suspension S2 Ratio (r) 1,5 0,18 Ecart-type (r) 186 0,06 Ratio (R) 2,7 0,43 Ecart-type (R) 321 0,14 Lim inf 809 2,91 Moyenne 1037 3,02 Lim sup 1328 3,12 Echantillon naturel EN Ratio (r) 1,5 0,18 Ecart-type (r) 186 0,06 Ratio (R) 2,7 0,43 Ecart-type (R) 321 0,14 r est le rapport maximum attendu entre deux valeurs obtenues en condition de répétabilité (p<0,05) R est le rapport maximum attendu entre deux valeurs obtenues en condition de reproductibilité (p<0,05) Les valeurs de r, qui représente la répétabilité, se situent autour de 1,5 pour les solutions d'adn (étape de PCR uniquement), et autour de 2 pour les suspensions bactériennes (méthode globale), ce qui est tout à fait acceptable. Ce qui signifie qu'au sein d'un même laboratoire, on s'attend à des écarts de mesure, sur un même échantillon, de l'ordre d'un facteur 2. La répétabilité n'apparaît donc pas comme une source majeure d'erreur. Les valeurs de R, qui représente la reproductibilité, se situent autour de 2,5 pour les solutions d'adn (étape de PCR uniquement), et autour de 5 pour les suspensions bactériennes (méthode globale). Par rapport à la répétabilité, cet ordre de grandeur reste conforme aux valeurs observées en analyse microbiologique de l'environnement. Ce qui signifie qu'entre deux laboratoires, on s'attend à des écarts 13 / 14

de mesure, sur un même échantillon, de l'ordre d'un facteur 5. La reproductibilité ne participe donc pas de manière démesurée à la dispersion des résultats. En conclusion, la dispersion des résultats observée au cours de l'étude interlaboratoire est tout à fait acceptable. 3 Conclusion Les résultats obtenus à l'issue de l'étude préliminaire et de l'étude inter-laboratoire montrent que les performances du kit iq-check Quanti Legionella spp. sont conformes aux exigences du Bureau Technique, et donc en adéquation avec les exigences de la norme XP T 90-471. La validation du kit iq-check Quanti Legionella spp. a été reconduite le 10 juin 2011, sous le certificat BRD 07/15-12/07. 14 / 14