Séance 5. Chapitre 4 : LA BIOLOGIE MOLECULAIRE ET SES APPLICATIONS I/ Les outils de la génétique moléculaire. Voir en annexe, un tableau résumant toutes les techniques de la génétique moléculaire. 1. Découverte des enzymes de restriction.(pages 126/127) A l'aube des années 1970, bien que les bases de l'expression des gènes soit de mieux en mieux comprises, on ne sait pas les isoler pour en faire une étude approfondie. Un pas décisif sur le plan technique va permettre de mettre au point les "outils du génie génétique". http://www.chups.jussieu.fr/polys/biochimie/bgbioch/poly.chp.5.3.html http://www.edu.upmc.fr/sdv/masselot_05001/genes_et_genomes/fragmentation.html a) Des outils pour étudier les gènes. Des travaux furent menés à bien en 1965 par Werner ARBER, Daniel NATHANS et Hamilton SMITH qui obtiendront le prix Nobel en 1978: ils découvrent les enzymes de restriction (endonucléases) permettant de découper l'adn en petits segments à des endroits déterminés. Les enzymes de restriction sont produites par les bactéries lorsqu'elles sont infectées par un ba ctériophage : http://membres.lycos.fr/carcinus/genetique/genbact/bacteriophage.html Une animation : http://nte-serveur.univ-lyon1.fr/tpgenetmic/animation%20flash/propagation.swf - Aber découvre en 1962 que des bactéries sont capables de se protéger de l'infection par un virus, en découpant l'adn viral : phénomène de restriction.
- Smith isole les enzymes responsables : enzymes de restriction. - Nathans transforme les enzymes de restriction en outils. Mais, contrairement aux DNases connues jusque là, qui coupent l'adn au hasard, les DNases de restriction sont capables de couper l'adn en des sites déterminés: elles reconnaissent une séquence de bases et coupent l'adn chaque fois qu'elles la rencontrent. Les chercheurs disposent à l'heure actuelle de plusieurs centaines de telles enzymes, véritables "ciseaux moléculaires" (Eco Ri, Hind III, Taq I...) reconnaissant des séquences de bases spécifiques et engendrant des fragments d'adn dont les extrémités forment de véritables "bouts collants". Cette propriété en fait des outils de choix permettant de découper l'adn pratiquement où l'on veut non seulement pour isoler des gènes, mais aussi pour les insérer dans des phages ou des plasmides qui se révélèrent d'excellents vecteurs pour multiplier des gènes étrangers. L'hybridation de deux molécules d'adn provenant de deux espèces différentes nécessite la soudure des fragments obtenus après action des enzymes de restriction. Une enzyme, l'adn ligase, facilite la réassociation des "bouts collants" par le biais de la complémentarité de leurs bases. L'ARN polymérase est un complexe enzymatique qui assure plusieurs fonctions: - Reconnaissance sur l'adn des signaux génétiques qui permettent de commencer et de terminer la synthèse d'arnm en des sites précis, - Ouverture de la molécule d'adn au niveau des liaisons labiles qui unissent les deux brins, - Polymérisation des nucléotides dans un ordre imposé par la complémentarité des bases des nucléotides de l'arn et de celles des nucléotides d'une des deux chaînes transcrites de l'adn.
En 1970, Howard Martin TEMIN et David BALTIMORE isolent, à partir de virus, la transcriptase inverse, une enzyme capable de réaliser l'opération inverse de celle de l'arn polymérase, qui permet d'obtenir de l'adn à partir de l'arn. Ils seront récompensés par le Nobel en 1975 avec Renato DULBECCO. Son utilisation rend possible la synthèse d'un gène à partir de l'arnm gouvernant l'assemblage d'une protéine. On obtient d'abord une copie d'adn simple brin, puis à l'aide d'autres enzymes spécifiques, une copie double brin d'adn complémentaire (ADNc). L'hybridation ultérieure de ce gène avec un autre ADN exige la formation de nouveaux "bouts collants" à chacune de ses extrémités. b) Principe d établissement d une carte de restriction : étudier les fragments de restriction : Exercice méthodologique: L'objectif est de rechercher les positions relatives des sites de coupures par deux enzymes de restriction sur un échantillon d'adn de longueur 5 000 pb (paires de bases). A - Les chercheurs disposent de nombreux exemplaires d'un échantillon d'adn, obtenus par clonage de l'échantillon initial. Ce matériel est divisé en deux lots équivalents et chaque lot est soumis à l'action d'une enzyme de restriction, l'enzyme A pour un lot, l'enzyme B pour l'autre lot. On rappelle qu'une enzyme de restriction coupe l'adn chaque fois qu'elle rencontre un site précis, différent d'une enzyme à l'autre. L'attaque enzymatique est conduite de façon telle que tous les sites spécifiques de l'enzyme A pour un lot, de l'enzyme B pour l'autre lot, sont coupés. Chaque lot d'adn est alors soumis à une électrophorèse (page 140) qui sépare les fragments d'adn obtenus selon leur taille. Une électrophorèse témoin consistant à séparer des fragments d'adn de taille connue permet de disposer d'une échelle des tailles (exprimée ici en paires de bases). Les résultats de ces premières électrophorèses sont présentés sur le document. Combien l'échantillon d'adn initial présentait-il de sites de coupure pour l'enzyme A? pour l'enzyme B? Montrez à l'aide de schémas simples qu'il n'est pas possible de reconstituer avec certitude la disposition relative des fragments obtenus par l'action d'une enzyme de restriction (A ou B). B - Chaque ensemble de fragments obtenus par action de l'enzyme A est alors isolé et traité par l'enzyme B. Dans chaque cas, une nouvelle électrophorèse sépare les fragments éventuellement obtenus. La même opération est réalisée pour les fragments obtenus au départ par l'action de l'enzyme B qui sont soumis à l'action de l'enzyme A. Les résultats de ces électrophorèses sont présentés sur le document. Comparez le résultat de l'action - de A sur le fragment de 2 500 pb découpé par B ; - de B sur le fragment de 2 100 pb découpé par A. Illustrez par un schéma la conclusion se dégageant de cette comparaison. Poursuivez cette comparaison méthodique de couples de fragments convenablement choisis et proposez une "carte" montrant les positions relatives des sites de coupure pour A et B sur l'échantillon d'adn initial. Exercice 2 page 145. TP ANAGENE.
2.Le clonage et le séquençage des gènes.
a) La technique du southern blot.(page 127) - L'ADN est traité par une enzyme de restriction: plusieurs milliers de fragments de tailles différentes sont ainsi produits. - Le mélange est disposé dans un puits d'une plaque de gel d'agarose et soumis à une électrophorèse qui provoque la migration des fragments, d'autant plus vite qu'ils sont petits. - Après dénaturation de l'adn (séparation des brins complémentaires), la plaque est mise au contact d'un filtre de nitrocellulose qui recueille une empreinte ("blot") du gel. - Le filtre est immergé dans une solution contenant une sonde moléculaire radioactive (fragment d'adn reconnaissant une séquence du génome) pendant quelques heures à 65 C: celle-ci se fixe sur les fragments complémentaires. Le filtre est ensuite rincé pour éliminer les sondes non fixées. - On procède à la révélation de l'emplacement de la sonde et donc des fragments complémentaires par une technique appropriée : autoradiographie pour les sondes radioactives, photographie pour les
sondes fluorescentes, réactions enzymatiques pour les ligands reconnus par des protéines spécifiques. Cette technique est très sensible et permet de reconnaître un fragment sur les milliers au départ. Elle permet ainsi de faire la recherche simultanée chez plusieurs individus et de procurer une carte génétique d'une grande spécificité et fiabilité, par construction d'une carte de restriction. L'analyse est appelée polymorphisme de longueurs de fragments de restriction (RFLP: "restriction fragment length polymorphism). b) Le clonage d un gène (page 128) Les enzymes de restriction ont ouvert la voie au clonage des gènes à partir de 1972, dans le but de les reproduire. Supposons que l'adn d'une cellule humaine ait été découpé et ses fragments transférés chez E.coli: on dispose ainsi d'une "banque génomique" constituée de milliers de clones bactériens différents, chacun ayant multiplié un fragment du génome humain. La technique du Southern blot permet de repérer le clone ayant incorporé le gène recherché. Une fois le gène isolé, il est introduit dans un vecteur qui permet son amplification et son stockage dans une cellule vivante, généralement une bactérie. De nombreuses bactéries contiennent un ou plusieurs plasmides: la plupart sont des molécules d'adn circulaires double-brin, beaucoup plus petite qu'un chromosome de 3 à 10 kb (milliers de paires de bases). Les plasmides sont largement utilisés dans les techniques de l'adn recombinant On sait depuis quelques années introduire et faire exprimer de l'adn dans des cellules eucaryotes (levure, cellules de Mammifères en culture, cellules résultant des premières divisions de l'oeuf d'un mammifère par exemple). On peut ainsi, après un clonage dans Escherichia coli, réintroduire le gène cloné dans des cellules eucaryotes et le faire exprimer. c) le séquençage de l ADN. (Page 129) Le séquençage de l'adn consiste à déterminer l'ordre des nucléotides sur la molécule d'adn. C'est le moyen le plus précis pour rechercher la présence de mutations ponctuelles dans un gène. La méthode utilisée aujourd'hui, proposée par F. SANGER en 1977, qui a obtenu le prix Nobel de chimie en 1980, est devenue aujourd'hui une technique rapide et fiable utilisée fréquemment dans le diagnostic des maladies héréditaires. http://www.cns.fr/externe/francais/questions/
Annexe : les outils du génie génétique : Couper l'adn Coller l'adn (recombiner) Dupliquer (multiplier, cloner) l'adn Synthétiser de l'adn Les endonucléases ou enzymes de restriction peuvent, in vitro, couper spécifiquement une séquence d'adn (double brin) Les ligases sont des enzymes capables in vitro de lier deux molécules d'adn par liaisons covalentes (une sur chaque brin). Si leurs extrémités sont cohésives et complémentaires, on peut ainsi former une molécule d'adn hybride avec deux ADN provenant d'organismes différents (ADN chimère). C'est notamment le cas de l'insertion d'un ADN étranger, isolé par une enzyme de restriction, dans un plasmide coupé par cette même enzyme de restriction. * Multiplication in vivo par l'adn polymérase. - La multiplication d'une séquence d'adn était auparavant conditionnée par son insertion dans un vecteur d'insertion (virus ou plasmide) que l'on introduisait à son tour dans un vecteur de multiplication (bactérie ou cellule eucaryote comme la levure) qui, en se multipliant, reproduisait la séquence d'adn insérée (génie génétique). Cette technique est connue sous le nom de clonage d'un gène (isolement, insertion, multiplication). http://www.edumedia-sciences.com/m218_l1-biologie-moleculaire.html *Multiplication in vitro par amplification enzymatique par l'adn polymérase extraite d'une bactérie thermophile. C'est notamment la technique de l'apr (amplification en chaîne par polymérase: ce terme doit remplacer en français la PCR (polymérisation en chaîne de l'adn)): qui permet de produire de grandes quantités d'un fragment d'adn sans le cloner. http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/pcr/index.htm http://www.ens-lyon.fr/relie/pcr/principe/anim/presentation.htm Cette synthèse d'adn artificiel peut être contrôlée de façon à obtenir de l'adn de séquence déterminée. Cette technique n'est au point que pour des oligonucléotides (quelques dizaines de nucléotides). Dénaturer l'adn Hybrider l'adn (Apparier des séquences d'adn ou d'adn et d'arn complémentaires) Transcrire l'adn en ARN La dénaturation de l'adn est la séparation des deux brins (par rupture des liaisons hydrogène) ; elle s'obtient par simple chauffage modéré (vers 60 C) et est alors réversible. A plus haute température il peut y avoir rupture des liaisons covalentes entre et à l'intérieur des nucléotides et les brins sont altérés; la dénaturation est alors irréversible. On peut hybrider (c'est-à-dire associer artificiellement) des brins d'adn (qu'il faut donc avoir séparé auparavant par dénaturation) venant de molécules. C'est encore l'hybridation mais cette fois c'est son caractère spécifique qui est employé pour l'hybridation d'une sonde (courte séquence marquée radioactivement (sonde chaude) ou non (sonde froide, par exemple sonde fluorescente, FISH(http://www.pasteur.fr/recherche/unites/biophyadn/f- Ffish.html) avec une séquence d'adn ou d'arn complémentaire au sein d'un grand nombre de molécules d'acides nucléiques. Les techniques de Northern et Southern blot appliquées respectivement aux molécules d'arn et d'adn simple brin permettent de visualiser rapidement l'hybridation entre une sonde radioactive et des acides nucléiques simple brin séparés par électrophorèse sur gel et transférés par effet buvard sur une feuille de nitrocellulose. On qualifie de "Western blot" une technique assez similaire à partir de protéines. la transcription est réalisée in vivo par de gros complexes enzymatiques contenant une ARN polymérase, in vitro elle peut être obtenue avec un rendement plus faible. «Retro-transcrire" l'arn en ADN = "transcription inverse" Les enzymes de type transcriptase inverse (ou reverse, capables de catalyser la synthèse d'un ADN monobrin (dit ADNc ou ADN complémentaire à partir d'un ARN).
"transcription inverse" Insérer l'adn dans une cellule (Transformer un organisme par transgenèse) Exprimer un gène ARN). ADN peut être inséré : * chez les procaryotes et quelques cellules eucaryotes comme la levure de bière, par l'intermédiaire d'un vecteur d'insertion de type phage, virus, plasmide, * chez les eucaryotes par micro-injection (à l'aide d'une micropipette et d'un micromanipulateur), électroporation (exposition brève à un courant électrique de très haut voltage de cellules de mammifères ou de plantes en présence d'adn à insérer), bombardement (fusil à gènes avec des microprojectiles couverts d'adn, utilisé notamment pour obtenir des maïs transgéniques), agitation ou par l'intermédiaire d'un vecteur d'insertion bactérien. L'insertion du vecteur dans la cellule transformée qui se multiplie n'implique pas que le gène inséré soit exprimé. On utilise des vecteurs d'expression qui sont souvent des dérivés du plasmide pbr322 d'e. coli qui contient les signaux nécessaires à la transcription et à la traduction La méthode diffère totalement selon la longueur de la molécule d'adn que l'on veut séquencer. Séparer séquencer *La cartographie de restriction : l'action d'une (ou de plusieurs) enzyme(s) de restriction sur des molécules d'adn données fournit un ensemble de fragments de tailles variées qui dépend de la séquence de l'adn coupé. Les fragments (dits "fragments de restriction" d'une taille de quelques milliers à quelques dizaines de milliers de paires de nucléotides) peuvent être séparés et leur taille évaluée. Ce qui permet, par comparaison de l'action de plusieurs enzymes de restriction, l'établissement de ce que l'on appelle une carte de restriction. On peut donc penser que deux cellules possédant la même information génétique auront exactement la même carte de restriction. De la même manière, deux cellules de fonction identique mais prise chez deux individus différents, sont supposées avoir des cartes de restriction différentes mais voisines. * L'électrophorèse sur gel.