Spectrophotométrie d'absorption moléculaire Étude et dosage de la vitamine B 6 1
1.But et théorie: Le but de cette expérience est de comprendre l'intérêt de la spectrophotométrie d'absorption moléculaire dans l'étude d'un composé possédant des formes chimiquement et spectrophotométriquement distinctes. Dans ce but, une constante d'acidité sera déterminée par le biais des spectres d'absorption en utilisant la loi de Lambeer-Beer. L'acide étudié est la vitamine B 6 ou pyridoxine: OH OH OH HO OH O OH O OH N H K 1 ab N H K 2 ab N forme acide forme neutre forme basique Les constantes d'acidité sont données de façon suivante: + AH 2 AH + H + K 1 ab = [AH][H + ] / [AH 2+ ] AH A - + H + K 2 ab = [A - ][H + ] / [AH] Ensuite une une tablette de vitamine B 6 sera analysée, pour en déterminer la teneur en pyridoxine en utilisant la méthode d'étalonnage externe, puis interne. L'absorption des molécules dépend de la distribution en électrons. Les trois formes de cette molécule n'absorbent pas les rayonnements de la même façon. Quand plusieurs formes coexistent, l'absorption mesurée est la somme des absorptions des différentes formes. L'absorption d'une espèce chimique est donnée par la loi de Lambeer-Beer: A λ = l c ε λ A λ : l'absorption à la longueur d'onde λ l: la longueur de la cuve [cm] ε λ : le coefficient d'extinction molaire [l cm -1 mol -1 ] à la longueur d'onde λ c: la concentration [mol / l] 2
L'absorption de plusieurs espèces chimiques est: A λ = l (c 1 ε λ 1 + c 2 ε λ 2 +...) Dès lors, si les constantes d'acidité sont suffisamment différentes, alors en ajustant le ph on peut déterminer les absorptions individuelles. 2.Partie pratique: 2.1.Détermination de la constante d'acidité: 2.1.1.Manipulations: Nous avons travaillé avec les appareils suivants: Spectromètre UV-Visible (Perkin-Elmer Lambda 2) couplé à un ordinateur (IBM PS2/30) Une cellule en quartz l = 1 cm Nous avons préparé les solutions suivantes: Acide citrique 0.1 M (2 l): 42.0 g dans deux litres ce qui donne une solution: 0.1 ± 10-4 M Hydrogénophosphate de sodium 0.2 M (0.5 l): 35.8 g dans 500 ml ce qui donne une solution: 0.2 ± 10-4 M Pyridoxine 10-3 M (250 ml): 0.0533 g dans 250 ml ce qui donne une solution: 1.04 10-3 M Des solutions ont été préparées comme suit: ph Volume de Na 2 HPO 4 [ml] Volume d'acide citrique [ml] 2.2 30.0 1470.0 3.0 20.5 79.5 3.6 32.2 67.8 4.4 44.1 55.9 5.0 51.5 48.5 5.6 58.0 42.0 6.6 72.8 27.2 Les ph n'ont pas pu être vérifier car le laboratoire n'était pas muni de phmètre, ce qui peut être source d'erreur. Le blanc a été fait avec le tampon de ph 2.2. Les résultats sont présentés sur un graphique en annexe (annexe 1). 3
2.1.2.Résultats: Spectres en annexe Remarque: Il y a quelque chose de bizarre avec la courbe à ph 2.2, elle sera donc tenue à l'écart des résultats utilisés. 2.1.2.1.Détermination des coefficients d'extinction molaire: Nous pouvons déterminer les coefficients d'extinction molaire grâce aux spectres avec le ph le plus faible (nous prenons celui à ph 3 car celui à ph 2.2 est étrange) et avec le ph le plus fort (6.6). Il faut faire l'approximation qu'à ces deux ph une seule des formes est présente dans l'échantillon. En prenant les courbes à leur maximum nous trouvons (291 et 324 nm): Pour le ph de 3: La forme présente sera la forme acide. Le maximum de la courbe se trouve à une longueur d'onde de 291 nm et l'absorbance est de 0.888880. Avec la loi de Lambeer-Beer nous trouvons que le coefficient d'extinction molaire est: ε 291 AH2+ = A 291 / (l c) ε 291 AH2+ = 0.888880 / (1 1.04 10-4 ) = 8546.92 [l cm -1 mol -1 ] Pour la longueur d'onde de 324 nm, l'absorbance est de 0.044520, le coefficient d'extinction molaire est de: ε 324 AH2+ = 0.044520 / (1 1.04 10-4 ) = 428.08 [l cm -1 mol -1 ] Pour le ph de 6.6: La forme présente sera la forme neutre. Le maximum de la courbe se trouve à une longueur d'onde de 324 nm et l'absorbance est de 0.719400. Avec la loi de Lambeer-Beer nous trouvons que le coefficient d'extinction molaire est: ε 324 AH = A 324 / (l c) ε 324 AH = 0.719400 / (1 1.04 10-4 ) = 6917.31 [l cm -1 mol -1 ] Pour la longueur d'onde de 219 nm, l'absorbance est de 0.249380, le coefficient d'extinction molaire est de: ε 291 AH = 0.249380 / (1 1.04 10-4 ) = 2397.88 [l cm -1 mol -1 ] 2.1.2.2.Première méthode de détermination de la constante d'acidité: La méthode consiste à déterminer les concentrations de la forme acide (notée AH 2+ )etla 4
forme neutre (notée AH) en partant de la loi de Lambeer-Beer pour deux composés. Nous avons deux équations avec deux inconnues [AH 2+ ] et [AH], nous pouvons donc résoudre ces équations: 1. A 324 = l ([AH] ε 324 AH + [AH 2+ ] ε 324 AH2+) = [AH] ε 324 AH + [AH 2+ ] ε 324 AH2+ 2. A 291 = l ([AH] ε 291 AH + [AH 2+ ] ε 291 AH2+) = [AH] ε 291 AH + [AH 2+ ] ε 291 AH2+ Remarque: l = 1 De la première équation nous tirons: [AH] = A 324 / ε 324 AH - ([AH 2+ ] ε 324 AH2+) / ε 324 AH En introduisant ce résultat dans l'équation 2 et en la travaillant un peu on obtient: [AH 2+ ] = (A 291 ε 324 AH - A 324 ε 291 AH) / (ε 324 AH ε 291 AH2+ - ε 324 AH2+ ε 291 AH) Puis, ayant toutes les concentration ([H + ] = 10 -ph ) nous utilisons la formule: K 1 ab = [AH][H + ] / [AH 2+ ] Les résultats sont les suivants: PH Absorbance à 291nm Absorbance à 324nm [AH] [AH 2+ ] K 1 ab 3.0 0.88888 0.04452 3.6 0.86073 0.04162-2.19E-07 1.01E-04-5.47E-07 4.4 0.79953 0.11558 1.11E-05 9.04E-05 4.89E-06 5.0 0.68281 0.24084 3.04E-05 7.14E-05 4.26E-06 5.6 0.45619 0.48723 6.83E-05 3.42E-05 5.02E-06 6.6 0.24938 0.71940 K 1 moyenne ab 4.72E-06 La valeur pour le ph de 3.6 est vraiment étrange, elle n'a pas été prise en compte pour la moyenne. Cette erreur est peut être due au fait que les coefficients d'extinction molaire ont été calculé à ph 3 et en faisant l'approximation que seul une des deux espèces était présente, ce qui ne doit pas être le cas. Les autres valeurs semblent coïncider les unes avec les autres. Dans ce cas les différences peuvent être dues à des erreurs de manipulation ou comme plus haut, à l'approximation faite lors du calculs des coefficients d'extinction molaire. 2.1.2.3.Deuxième méthode de détermination de la constante d'acidité: La deuxième méthode est de tracer un graphe de l'absorbance en fonction du ph pour les deux longueurs d'onde, de calculer pour les deux longueurs d'onde la moyenne entre l'absorbance minimale et l'absorbance maximale. En effet 5
K 1 ab = [AH][H + ] / [AH 2+ ] Si nous prennons l'inverse de la fonction logarithmique on a: pk 1 ab = ph log([ah]/[ah 2+ ]) À la moyenne, [AH] = [AH 2+ ] la deuxième partie de l'équation s'égalise à 0 et on a pka = ph Les valeurs sont les suivantes: PH Absorbance à 324nm Absorbance à 291nm 3.0 0.04452 0.88888 3.6 0.04162 0.86073 4.4 0.11558 0.79953 5.0 0.24084 0.68281 5.6 0.48723 0.45619 6.6 0.71940 0.24938 Moyenne 0.382 0.569 Ce qui donne le graphe suivant: 0.90000 0.80000 0.70000 Absorbance en fonction du ph Absorbance 0.60000 0.50000 0.40000 0.30000 0.20000 0.10000 0.00000 3.0 3.3 3.5 3.8 4.0 4.3 4.5 4.8 5.0 5.3 5.5 5.8 6.0 6.3 6.5 6.8 ph Pour la longueur d'onde de 291 nm l'absorbance moyenne est de: 0.56913 arrondi à 0.57. Pour la longueur d'onde de 324 nm l'absorbance moyenne est de: 0.38196 arrondi à 0.38. Calcule pour la longueur d'onde de 291 nm: 6
Graphiquement on peut déterminer qu'à l'absorbance de 0.56 correspond un ph de 5.33. Le pka est donc de 5.33 se qui donne une constante K 1 ab = 4.68 10-6 Calcule pour la longueur d'onde de 324 nm: Graphiquement on peut déterminer qu'à l'absorbance de 0.38 correspond un ph de 5.36. Le pka est donc de 5.36 se qui donne une constante K 1 ab = 4.37 10-6 La valeur moyenne trouvée de cette façon est de: 4.52 10-6. Ces ordres de grandeur de la constante K 1 ab correspondent bien à ceux obtenus par l'autre méthode, qui était de: 4.72 10-6 en moyenne. Dans ce cas les erreurs viennent du fait que les ph correspondant aux valeurs moyennes des absorbances doivent être trouvés manuellement, donc avec une erreur relativement importante. Il convient de noter que tout de même ces valeurs sont très proches et qu'elles sont proches de celles trouvée plus haut. Avec utilisation de SciFinder Schoolar nous trouvons une estimation de la constante d'acidité de 4.57 10-5 (pka = 4.34 ± 0.28). Les références de l'article contenant la valeur de constante nous a été fourniees par l'assistant, après une longue et infructueuse recherche. La valeur est de 2.14 10-5 (pka = 4.67). Nous constatons qu'il y a un facteur 10 entre la valeur trouvée expérimentalement et celle de la littérature. Cette erreur doit venir entre autre de dilutions imprécises, de mauvaises manipulations... 2.1.3.Points isobestiques: Sur nos spectres les point isobestiques sont nets, toutes les courbes se coupent en un point, à la longueur d'onde d'environ 303 et 267 nm. Si l'intensité ne varie pas malgré les longueurs d'onde différentes cela signifie, que pour ces longueurs d'ondes les coefficients d'extinction molaires sont les mêmes, et comme la quantité totale (forme acide, basique et neutre) de produit à analyser ne varie pas, l'absorbance reste la même. La présence de points isobestiques est un paramètre nécessaire mais pas suffisant pour établir la présence d'un équilibre entre deux formes, ne faisant pas intervenir d'intermédiaire réactionnel. 2.2.Dosage quantitatif de la pyridoxine dans une préparation pharmaceutique: 2.2.1.Manipulation pour la calibration externe: Les solutions suivantes ont été préparées sur un volume de 100 ml (il y a eu une erreur de lecture du protocole, les volumes auraient dus être de 10ml). La concentration de 7
pyridoxine initiale était de 10-3 mol/l. Les dilutions ont été faites avec le tampon à ph 2.2 préparé pour la manipulation précédente. Les solutions suivantes ont été préparées: Concentration de pyridoxine [mol/l] Volume de pyridoxine ajouté [ml] 10-5 1 2 10-5 2 4 10-5 4 6 10-5 6 8 10-5 8 10-4 10 Les mesures ont été prises à une longueur d'onde fixe de 291 nm. 2.2.2.Résultats pour la calibration externe: Les résultats sont les suivants: Concentration [mol/l] Absorbance 1.00E-05 0.0932 2.00E-05 0.1550 4.00E-05 0.3282 6.00E-05 0.5062 8.00E-05 0.6750 1.00E-04 0.8856 Pente 8798.9 Ordonnée à l'origine -0.0324 Ce qui donne le graphique suivant: 8
Absorbance Absorbance en fonction de la concentration de pyridoxine 0.9000 0.8500 0.8000 0.7500 0.7000 0.6500 0.6000 0.5500 0.5000 0.4500 0.4000 0.3500 0.3000 0.2500 0.2000 0.1500 0.1000 0.0500 0.00E+00 2.00E-05 4.00E-05 6.00E-05 8.00E-05 1.00E-04 Concentration de la pyridoxine [mol/l] La droite a une pente de 8798.9 et une ordonnée de 0.0324 elle devrait être à 0, la pente devrait donc changer un peu, or le programme informatique utilisé dans ce rapport ne le permet pas. Nous considéreront dans les calculs que l'ordonnée est de 0. 1. Première pastille: Masse entière: 0.1984 g Masse une fois sous forme de poudre: 0.1877 g L'absorbance est de: 0.1102 On doit résoudre: 0.1102 = 8798.9 [B 6 ] ( 0.0324) [B 6 ] = 1.25 10-5 Le volume de dilution est de 250 ml, la pastille contenait donc 5.00 10-5 mol de vitamine B 6, se qui donne une masse de: 10.3 mg ce qui donne par tablette: 10.9 mg / tablette. L'indication du fabriquant est de 40 mg par tablette. 2. Deuxième pastille: Masse entière: 0.2002 g Masse une fois sous forme de poudre: 0.1914 g L'absorbance est de: 0.1085 On doit résoudre: 0.1085 = 8798.9 [B 6 ] ( 0.0324) [B 6 ] = 1.23 10-5 Le volume de dilution est de 250 ml, la pastille contenait donc 4.93 10-5 mol de vitamine B 6, se qui donne une masse de: 10.1 mg ce qui donne par tablette: 10.6 mg / tablette. 3. Troisième pastille: Masse entière: 0.1914 g Masse une fois sous forme de poudre: 0.1864 g L'absorbance est de: 0.1331 9
On doit résoudre: 0.1331 = 8798.9 [B 6 ] ( 0.0324) [B 6 ] = 1.51 10-5 Le volume de dilution est de 250 ml, la pastille contenait donc 6.05 10-5 mol de vitamine B 6, se qui donne une masse de: 12.4 mg ce qui donne par tablette: 12.8 mg / tablette. Nous remarquons que dans les trois cas la concentration par tablette en milligramme est de l'ordre du quart de ce qui est indiqué par le fabriquant. Il est possible que pas toute la vitamine ne se soit dissoute dans le tampon à ph 2.2, et que lors du filtrage une certaine quantité de vitamine aie été perdue, mais certainement pas au point de réduire les résultats au tiers de la valeur exacte. Il est également certain que le fait que la pente n'aie pas été modifiée si l'on égalise à zéro l'ordonnée à l'origine aie joué un rôle. Les tablettes semblent donc contenir moins de vitamine B 6 que ce qui est indiqué. 2.2.3.Manipulation pour l'étalonnage externe: Les manipulations ont été faites pour la première tablette. Les solutions ont été préparées de façon suivantes: Numéro des solutions Volume de solution de la tablette [ml] Volume de solution stock 10-3 M [µl] Blanc 25 0 1 25 250 2 25 400 3 25 500 Nous considèrons que le volume de solution stock ajouté est négligeable par rapport au volume total. Les mesures ont été faites à une longueur d'onde fixée à 291 nm. 2.2.4.Résultats: Les résultats sont les suivants: Numéro Volume ajouté [µl] Absorbance Blanc 0 0.1157 1 250 0.1931 2 400 0.2304 3 500 0.2768 Le graphique est le suivant: 10
Absorbance en fonction du volume ajouté 0.2800 0.2600 0.2400 Absorbance 0.2200 0.2000 0.1800 0.1600 0.1400 0.1200 0.1000 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 Volume ajouté concentration 10-3 La méthode de calcul est la suivante: Nous connaissons la concentration ajoutée à l'aide de la solution stock et nous connaissons l'absorbance du blanc et de la solution mesurée. A blanc = ε l c inconnue A solution = ε l (c inconnue + c ajoutée ) En divisant ces deux équations nous obtenons: A blanc / A solution = c inconnue / (c inconnue + c ajoutée ) D'où nous trouvons: c inconnue = A blanc c ajoutée / (A solution A blanc ) Les résultats sont les suivants: Numéro Volume ajouté [µl] Absorbance Concentration ajoutée [mol/l] Concentration [mol/l] Blanc 0 0.1157 1 250 0.1931 1.00E-05 1.49E-05 2 400 0.2304 1.60E-05 1.61E-05 3 500 0.2768 2.00E-05 1.44E-05 Moyenne 1.52E-05 Les concentrations calculées ici montrent peu de variation. De plus ces trois valeurs sont proches de celle obtenue par calibration externe. Par cette méthode on obtient une masse de vitamine B 6 de 13.2 mg par tablette avec cette méthode contre 13.9 avec la méthode de calibration externe. Une autre méthode serait de déterminer la droite de régression et de l'égaliser à 0, se qui nous donnerait la concentration cherchée. 11
2.2.5.Conclusion: Par ces deux méthodes nous obtenons des concentrations en masse par tablette de vitamine B 6 nettement inférieures à celles indiquées par le fabriquant. Il est possible que pas toute la tablette de vitamine se soit dissolue dans le tampon et qu'une partie de la tablette soit restée dans le filtre (les deux méthodes utilisaient la même solution). La première méthode est très pratique et permet d'accéder à la concentration de l'inconnue avec très peu de calculs, cependant il faut se méfier d'être dans le domaine de linéarité, que la droite de calibration soit bien faite (que l'ordonnée à l'origine soit à zéro, ce qui n'était pas tout à fait le cas dans notre droite, mais l'ordonnée était très petite). La deuxième méthode est moins évidente à première vue, il faut se méfier des volumes ajoutés car une petite erreur sur ces derniers se répercute directement sur les résultats (les erreurs de volumes se compense dans le cas d'une calibration interne car la régression compense les erreurs entre elles). L'avantage de cette méthode est que les conditions expérimentales pouvant interférer sur les mesures (force ionique...) sont à peu près les mêmes, et donc leur poids dans le résultats est minimisé. Les deux méthodes semblent donc être tout à fait appropriées pour ce type de mesures, elles ont chacune leurs avantages et leurs inconvénients. 3.Conclusion: Ce travail pratique nous a montré quelques intérêts de l'absorption, à quoi cette méthode pouvait servir, comment l'utiliser... D'une manière générale, les résultats coïncident et nous montrent que cette méthode est relativement précise, en dépit de nos erreurs de manipulations. 12