Centre Universitaire d El-Tarf Institut des Sciences Agronomiques 3 ème année Contrôle de Qualité en Agroalimentaire TP n 1: Initiation au laboratoire Introduction L analyse de la matière vivante au laboratoire nécessite l utilisation de plusieurs techniques allant du titrage chimique aux méthodes de résonance magnétique nucléaires. Toutefois, l unicité et la diversité qui caractérisent le monde vivant permettent la mise en œuvre d une méthodologie d approche commune à toutes les matières vivantes. Ainsi, le dosage du cholestérol sanguin nécessite des connaissances de base en biochimie concernant le comportement physico-chimique de la molécule, mais aussi la maîtrise des techniques de laboratoire. La mise en place d une technique de dosage nécessite plusieurs mises au point et optimisations qui conduisent alors à un protocole expérimental. Le dosage du cholestérol par cette méthode deviendra ainsi possible pour des échantillons d origine différentes. L analyse est effectuée en plusieurs étapes. Pour cela il est important de connaître l appellation, le principe de fonctionnement et les mesures de sécurité de chaque appareil. I-APPAREILLAGE : 1-SPECTROPHOTOMETRE: La spectrophotométrie nous permet de doser les molécules solubles dans les liquides biologiques. Lorsqu une molécule est soumise dans le spectrophotomètre à l influence d un faisceau lumineux, elle absorbe grâce à son groupement chromophore une radiation monochromatique. Seule une partie de la lumière incidente est absorbée par les molécules d une substance dissoute donnée. Si l énergie lumineuse de la lumière incidente est égale à I 0 et celle de la lumière émergente est I, la loi de Beer-Lambert indique : Log (I/I 0 ). DO = ε.l.c avec : DO=densité optique, ε=coefficient d absorption moléculaire spécifique à la substance pour une longueur d onde donnée (λ) exprimée en nanomètre (nm) Ce coefficient est exprimé en M 1 cm -1, L=Trajet de la cuve dans laquelle s effectue la mesure. Il est égal à 1 cm, C=concentration de la solution exprimée en Mole.L -1. A l aide d un spectrophotomètre l absorption de cette radiation est mesurée. Ces mesures sont effectuées à différentes longueurs d onde. On défini ainsi trois zones : la première est comprise entre 200 et 400 nm (ultraviolet), la seconde entre 400 et 800 nm (Visible), la troisième supérieure à 800 nm (infrarouge). DO = 0,94 = 345 nm Les principales parties du spectrophotomètre sont : 1- Source lumineuse : Elle est constituée d une lampe à tungstène fournissant des radiations lumineuses dans le domaine du visible et de l infrarouge (λ supérieure à 700nm) ou bien d une lampe au deutérium fournissant un rayonnement ultraviolet (λ inférieur à 300nm). R. : 3-15/11/2003 page 1/6
2- Monochromateur : Il permet de filtrer une radiation de longueur d onde définie à partir d un mélange complexe de radiations lumineuses. 3- Cuve : C est le contenant de la substance. On utilise des cuves en quartz pour des lectures en UV et des cuves en verre pour des lectures au visible. 4- Cellule photoélectrique : Cet effet photoélectrique permet la transformation de l énergie lumineuse en énergie électrique. 5- Amplificateur : Le courant produit étant de très faible intensité (quelques ma) il sera amplifié. 6- Enregistreur : L intensité électrique de l amplificateur est transformée en déplacement d un stylet inscripteur sur le papier d enregistrement. L enregistrement obtenu est directement proportionnel aux densités optiques. 2- CENTRIFUGEUSE : C est l une des méthodes de séparation les plus utilisées. Le principe se base sur l augmentation de la force de pesanteur (par rapport à la sédimentation). 2-1-Sédimentation: Les forces agissant sur une molécule en suspension dans un liquide à l équilibre sont: P-A-F=0 où P : pesanteur = mg, A : Archimède = -m / g avec m : masse du liquide déplacé A P-A=F=6πυrV où υ: viscosité, r: rayon, V: vitesse de sédimentation. F V= (P-A)/6πυr = g (m-m / )/6πυr La vitesse de sédimentation d une particule est ainsi régie par la P relation de «Stock»: en convertissant les masses en masses volumiques, on obtient: V= [(4/3)π r 3 (φ S -φ L )]/6πυr = 2r 2 (φ S -φ L )/9υ où φ: masse volumique ou densité 2-2-Centrifugation : Le passage de la sédimentation à la centrifugation est accompagné du remplacement de l accélération g par une force centrifuge beaucoup plus intense : g γ γ=ω 2.x avec F=mγ donc F=mω 2.x où x : la longueur de l axe de rotation et ω : la vitesse de rotation angulaire à l équilibre :F-A-C=0 F-A=C F-A=6πυrV V=F-A / 6πυr V ω 2.x (m-m ) / 6πυr V= ω 2.x [2r 2 (φ P -φ L ) / 9υ] dans cette équation la vitesse de sédimentation dépend aussi bien : de la différence de viscosité entre la particule et le liquide, du rayon des particules, et de la vitesse de centrifugation par la longueur de l axe, ce facteur est exprimé en tours par minute ou nombre de g (Ng): A F γ[m/s]=ω 2 [rad/s] 2.x[cm] γ[m/s]=ω 2 [2πn/60 ] 2.x[cm] le nombre de g Ng=γ/g= (2πn/60 ) 2.x / g = T.P.M.. x / g T.P.M. = Ng. g/x C R. : 3-15/11/2003 page 2/6
3-ELECTROPHORESE : C est aussi une méthode de séparation. Elle nous permet d étudier le déplacement d une molécule chargée par rapport au liquide sous l influence d un champ électrique. Si la molécule est chargée positivement elle se déplacera vers le pôle négatif (Cathode), si au contraire elle est chargée négativement elle migrera vers le pôle positif. Les parties de l appareillage électrophorètique sont : un générateur de courant électrique, des cuves ou chambres de migration, des plaques de migration (Acétate de cellulose), un densitomètre. 4-ETUVE: C est un appareil qui nous permet le séchage des matériaux à analyser (exemple: plaque d acétate de cellulose lors de l électrophorèse, papier filtre lors de la chromatographie des glucides et des acides aminés,...) ainsi que la verrerie utilisée au sein du laboratoire. Ses principales parties sont : une résistance électrique, un thermostat, un ventilateur, une sonde de température, une chambre de chauffage, une ouverture. 5- ph METRE : Le ph est la mesure de l acidité d une solution. Il est défini comme étant le logarithme négatif de la concentration en ions H +. cette mesure se fait sur une échelle allant de zéro (0) qui représente le maximum d acidité à quatorze (14) qui représente le maximum d alcalinité. La formule étant : ph=-log (H + ). Il est constitué de : - une électrode en verre qui représente la sonde de l appareil, - un dispositif de lecture avec des boutons de réglage ou d étalonnage de l appareil. 6- BALANCE : C est un appareil de précision qui nous permet d effectuer des pesées de l ordre du gramme des différentes matières nécessaires à la préparation des solutions. Elle est composée : - d un plateau où les matières sont déposées à l aide d une spatule, - d un dispositif de mesure avec des boutons pour le réglage des paramètres de mesure. 7- BAIN MARIE : C est une cuve en Plexiglas ou autre matériau dans laquelle plonge un thermomètre doté d un thermostat. le chauffage de l eau est obtenu grâce à des résistances immergées dans l eau. La chaleur est homogénéisée grâce à un système de mélange à turbine. R. : 3-15/11/2003 page 3/6
II- MATERIEL DE VOLUMETRIE : 1- MATERIEL EN VERRE : Bêcher : Récipient de forme cylindrique gradué du ml jusqu au litre munis d un bec pour les transvasements des solutions. Erlenmeyer : Récipient de forme conique, à fond plat gradué en ml. Ballon à fond plat : Récipient de différentes contenances ordinaire de forme ronde. Fioles jaugés : Les fioles jaugés sont généralement utilisées aux environs de 200 à 250ml. Elles portent un trait sur le col pour délimiter le volume indiqué. pipettes graduées ou jaugées : Les pipettes servent à prélever des volumes déterminés de liquide non visqueux. Certaines sont graduées sur toute la longueur, d autres ne portent qu un seul trait de jauge qui définit un volume bien précis. Eprouvettes graduées : Les éprouvettes graduées sont utilisées pour déterminer des volumes ne nécessitant pas une grande précision. Les contenances vont de 100 à 1000 ml. Burettes : Ce sont des instruments de laboratoire utilisés dans la titration d un soluté dans une solution. Les burettes graduées sont constituées d un tube en verre cylindrique terminé à la partie inférieure par un tube effilé muni d un robinet. En général, les burettes sont graduées en dixièmes de ml, elles ont une contenance de 5 à 50 ml, elles libèrent des gouttes d environ 0.05 ml. certaines burettes très élaborées (telle que la burette de Pellet - en face) qui permettent un remplissage automatique, un réglage automatique du zéro, un changement automatique du contenu de la pipette. 2- MATERIEL EN POLYETHYLENE : Le polyéthylène remplace le verre dans la fabrication de nombreux ustensiles de laboratoire (bechers, éprouvettes,...etc). Le polyéthylène résiste à l attaque des agents chimiques tels que l Acide fluorhydrique. 3- MATERIEL EN PORCELAINE : R. : 3-15/11/2003 page 4/6
Les ustensiles en porcelaine résistent aux températures élevées, à de nombreux agents chimiques. Parmi ces ustensiles notons les mortiers, les pilons... 4- MATERIEL EN QUARTZ : Le quartz résiste aux températures élevées, mais il subit l attaque des bases alcalines, des carbonates alcalins, de l acide fluorhydrique et de l acide phosphorique. III - REDACTION DU COMPTE RENDU : Le compte rendu du TP doit comporter une page de garde sur laquelle figurent les informations suivantes: L entête de l institution, La date du TP, Le nom de l étudiant ou des étudiants, Le groupe de TP, Le numéro de la paillasse de manipulation, Le numéro du TP, Le titre du TP, Un plan de travail (Introduction, But, Principe, Appareillage, Réactifs, Mode opératoire, Observations et résultats, Exploitation et discussion des résultats, Conclusion) Une numérotation des pages, Ce qu il faut éviter sur votre compterendu : Le compte-rendu est personnel, il ne peut être une simple copie de la brochure de TP! Ne pas utiliser de fiches cartonnées, de feuilles cariées ou de feuilles de couleur, Ne jamais utiliser de stylos de couleur rouge, Ne pas utiliser de feutres ou de marqueurs sur le compte-rendu, Eviter de remettre un compte-rendu trop artistique, Ne jamais écrire au verso des feuilles, utiliser un seul côté! Ne pas écrire sur toute la largeur de la feuille, laisser toujours une marge sur la gauche, Ne pas remettre des feuilles volantes, penser toujours à les agrafer! et les agrafer sur un seul côté! Eviter de remettre de feuilles mal gommées. D une façon globale, le compte-rendu doit rester un document scientifique : clair, net et précis! Telles sont ses caractéristiques. Le chargé du cours : R. : 3-15/11/2003 page 5/6
M. Boumendjel R. : 3-15/11/2003 page 6/6