Chromatographie Liquide de Haute Performance (CLHP-HPLC) Introduction
Principe de la CLHP Séparation de constituants dans un mélange complexe Mise en solution dans un solvant ou un mélange de solvant (éluant) Analyse qualitative Analyse quantitative
Principe
Schéma
CLHP Apparition : années 1950 Chromatographie : séparation et quantification Liquide : travail en solution Haute performance : Grande efficacité de la séparation
Comparaison CPG-CLHP CPG : Chromatographie en Phase Gazeuse : composés volatils, faibles masses molaires CLHP : toutes molécules trouvent un solvant pour y être dissoutes : méthode universelle
Exemple de chromatogramme Rétention différée
Performance - Efficacité N th 2 2 t r t r = 16 = 5,54 ω ω 0 1/ 2 Nombre de plateaux théoriques N > 2000
Résolution R tr t A r t B r t A rb = 2 = 1,18 ω + ω ω + ω 0 0 1/ 2 1/ 2 A B A B R ~ 1,5
Asymétrie As = A/B
Autres paramètres Temps de rétention réduit : t R = t R t 0 Facteur de capacité : k, 1 = t R 1 t t 0 0 k, 2 = t R 2 t t 0 0
Temps mort (t m ou t 0 ) Temps que met un produit pour traverser la colonne sans être retenu. Se calcule si on connaît la porosité de la colonne, définie par : ε = V éluant = d t V l / cm π r / cm colonne vide 3-1 / cm.min m / min 2 2 Le temps mort dépend des caractéristiques de la colonne : la longueur (l), son diamètre (2r), sa porosité (ε) et du débit imposé par la pompe (d). t m = επ l r d 2
Autres paramètres Sélectivité : Sous réserve de certaines approximations : = α t t, R, R 2 1 R S = 1 4 α 1 α k' k' + 1 N
Objectif Séparation individuelle de tous les constituants d un mélange Deux facteurs : Miscibilité dans la phase mobile Interaction (affinité) avec la phase stationnaire
Principe d une séparation Temps d analyse : minimal Performance : maximale
Constitution de la chaîne
Les pompes Délivrer un débit constant sous une pression élevée, constante
Vanne d injection
Boucle d injection
Colonnes
Détecteur UV
Détecteur UV
Détecteur réfractométrique
Détecteur fluorimétrique
Constitution de la colonne Colonne remplie de billes Billes de silice tapissées d un revêtement
Billes
Phase inverse (RP) / phase normale Complémentarité
Physico-chimie de la rétention Compromis entre: phase stationnaire phase mobile
Interactions intermoléculaires
Interactions intermoléculaires
Moment dipolaire
Autres moments
Interaction dipôle-dipôle
Interaction dipôle-dipôle
Polarisabilité
Interaction dipôle permanent-dipôle induit
Dispersion
Interactions de Van der Waals
Liaison hydrogène
Bilan
O O H O O O H O H O
«Magic» LogP octanol/eau Constante de partage octanol / eau i,octanol P i = C Ci,eau? O O O H O H H O O H O H O H O H H O H H H H H H H O O H O H O H H H O H H H O H H O O H H H O H H H O H H O H H O O O H H H O H H O H H H O H H
Version Chemsketch (ACDLABS)
LogP par la méthode de Villar (Int. J. Quantum Chem., 44, 203 (1992))
LogP / Villar en PM3
LogP par la méthode Ghose, Pritchett et Crippen (J. Computational Chem., 9, 80 (1988))
Influence de la polarité de l éluant Notion de force éluante : Influence de la proportion de solvant apolaire Isothermes de van t Hoff H S ln k' i ln i + + RT R i i ( ) = φ
Préparation d une séparation
Choix de l éluant
Gradient d éluant
Gradient d éluant
Couplages Identifier les produits sortants par : Spectrométrie de masse Résonance magnétique nucléaire Spectroscopie Infra-Rouge
Couplage CLHP-SM
Couplage CLHP-RMN
Couplage CLHP-IR
Optimisation d une séparation t analyse le plus petit possible Résolution : 1,7 > R > 1,4 Asymétrie : centrée sur 1 Performance élevée Robustesse : une légère modification des paramètres ne doit pas influer sur la qualité de la séparation et de l analyse.
Facteurs d optimisation Colonne (longueur, diamètre, particules, chaîne alkyle) Débit - Pression Eluant (%polaireapolaire, ph) Température
Efficacité - Débit Anisotropie d écoulement
Van-Deemter / Knox Hauteur Equivalente en Plateaux Théoriques : H = L N BVD Van Deemter : H = AVD + + CVD. v v 3 BKn Knox : H = AKn. v + + CKn. v v
Efficacité d une colonne (nombre de plateaux théorique): Efficacité réelle (nombre de plateaux efficace) : avec 2 2 2 16,54 5 = = = ω δ σ R R R t t t N 2 2 2 ' 16 ' 5,54 ' = = = ω δ σ R R R eff t t t N ' t 0 t t R R =
Perte de charge
Exemple : optimisation de la séparation des bases de l ADN
Stabilisation
Choix judicieux des concentrations
Spectre UV-visible
Débit
% MeOH
ph
Température
Bilan
Bilan de l optimisation
Applications de la CLHP Analytique CLHP Analytique Gamme d étalonnage Ajouts dosés Etalon interne CLHP préparative Dérivation en sortie Boucle d injection à gros volume