KIT EXAO : COMPARAISON DES ECHANGES GAZEUX ENTRE CELLULES AUTOTROPHES ET HETEROTROPHES OBJECTIFS : L autotrophie et l hétérotrophie sont deux grands types de métabolisme. Une souche d euglène et une souche de levure seront testées par EXAO pour leur activité respiratoire et photosynthètique. COMPOSITION : 1 40ml d une suspension d Euglèna Gracilis (prête à l emploi ) 2 Souche de Saccharomyces cerevisae sur boîte de pétri (le milieu sur lequel sont fournies les levures permet de préparer leur métabolisme respiratoire à la manipulation) 3 1ml d une solution à 5% d iodure de potassium (KI) pour immobiliser les euglènes 5 5ml d une solution de K 2 CO 3 (10-3 M). (Notée CP) 6 5ml d une solution de glucose à 20%. (Notée G) MATERIEL : (en option) 10 lames de numération KOVA (10 cupules de comptage/lame) 10 poires stériles A RECEPTION : Placer la boîte de pétri au réfrigérateur couvercle vers le bas pour éviter la condensation. Ouvrir la bouteille d euglènes pour dégazer (il est préférable de réaliser cette étape près de la flamme d un bec bunsen ou près d un bec électrique si votre TP n a pas lieu dans les 24 heures qui suivent la réception du colis) puis conserver à 15-20 C à la lumière. Conserver les solutions à température ambiante. MANIPULATION : Commencer par une observation au microscope des deux souches et un comptage des cellules. Les euglènes bougeant vite, il est possible de les immobiliser dans la lame de comptage en ajoutant une micro-goutte de KI. (0,2ml de KI pour 1ml d euglènes). 1
Euglènes : Ajouter 1,5ml de la solution de K 2 CO 3, les euglènes sont alors prêtes à l emploi, cependant pour un meilleur résultat, vous pouvez les faire buller en introduisant un bulleur d aquarium dans la suspension pendant une dizaine de minutes. Si vous décidez de travailler en demi-groupe, prélever 20ml de la suspension d euglènes en conditions stériles avant de faire buller. En effet la contamination engendrée par le bulleur n est pas importante dans la mesure où l on manipule immédiatement mais une semaine plus tard les contaminants introduits se seront développés et fausseront les résultats! Vous pouvez alors commencer la manipulation avec le logiciel EXAO. Nos souches ont été testées avec un bioréacteur JEULIN. Verser 10-15 ml de la suspension dans le bioréacteur puis refermer en contrôlant bien l étanchéité de l ensemble. Utiliser les sondes à O 2 et à CO 2. Effectuer les mesures sur 10 minutes : 4 minutes d obscurité 2 minutes de lumière 4 minutes d obscurité Il est conseillé d utiliser un projecteur de diapositives pour source de lumière car l intensité lumineuse doit être importante (et de nombreux lycées en disposent ) Attention : la sonde à O 2 est très sensible, un choc sur la table peut entraîner un artéfact sur la courbe. La sonde à CO 2 réagit moins vite, c est un micro-phmètre il y a donc plus de temps d adaptation. Levures : Prélever quelques colonies de levures avec un cure-dent ou mieux : une anse de platine et ensemencer 20ml d eau du robinet jusqu à obtenir une suspension très trouble de levures (la concentration de cette suspension doit être supérieure ou égale à 10 8 cellules/ml (mesurable avec une cellule de Malassez). Verser la suspension dans votre bioréacteur et commencer les mesures avec la sonde à oxygène. Au bout de 3 minutes de mesures, injecter quelques µlitres de la solution de glucose fournie. 2
RESULTATS ET INTERPRETATION : Euglènes : Cette manipulation a été réalisée sur 20 minutes : La période d éclairement va de T 1 =0minutes à T 2 =6minutes et de T3=12minutes à T4=20minutes. A l obscurité (de 6 à 12 minutes) : L analyse de la courbe montre une consommation d O 2 et un dégagement de CO 2 : les euglènes respirent. A la lumière (de 0 à 6minutes et de 12 à 20 minutes) : L analyse de la courbe montre un dégagement d O 2 et une consommation de CO 2 : Les euglènes photosynthétisent. 3
Problèmes éventuels : La sonde à CO 2 est un microphmètre, il y a donc un temps de réaction de plusieurs dizaines de secondes entre l exposition à la lumière et le changement de pente de la courbe. En effet la sonde mesure les variations de ph dues au dégagement ou à la consommation de CO 2 seulement ces variations résultent d une modification de l équilibre HCO3 CO3 -, le changement de ph n est donc pas immédiat. Levures : Cette manipulation a été réalisée sur 10 minutes. Au bout de 5 minutes, une solution de glucose est injectée dans le bioréacteur. Avant injection de glucose : L analyse de la courbe montre une consommation d O 2 :les levures respirent. Après l injection de glucose : L injection de glucose entraîne une modification de la pente : la respiration est activée par le glucose. Ce phénomène est dû au fait que les levures sont fournies sur un milieu épuisé en source de carbone, lorsque l on injecte du glucose, les levures le consomment pour produire l énergie nécessaire à leur croissance : C 6 H 12 O 6 + 6O 2 6CO 2 + 6H 2 0 + Energie 4
Cette manipulation a été réalisée sur 10 minutes, l injection de glucose a été effectuée dés le début de l expérience. On s intéresse également aux variations de CO 2. On observe un dégagement de CO 2 tandis que l O 2 est consommé : C 6 H 12 O 6 + 6O 2 6CO 2 + 6H 2 0 + Energie Ces expériences montrent qu il existe deux grands types de métabolismes : Autotrophie et hétérotrophie. Les levures présentent un métabolisme hétérotrophe, elles peuvent produire de l énergie à partir de diverses sources de carbones (sucres ). Les euglènes présentent un métabolisme autotrophe, ce sont des microorganismes photosynthétiques qui transforment l énergie lumineuse grâce aux chloroplastes. 5